Summary
Modulatie van hippocampally-afhankelijke ruimtelijk werkgeheugen door middel van directe intrahippocampale micro-injectie, begeleid en gevolgd door
Abstract
Glucose metabolisme is een nuttige marker voor lokale neurale activiteit, die de basis vormen van de methoden zoals 2-deoxyglucose en functionele magnetische resonantie beeldvorming. Het gebruik van dergelijke methoden in diermodellen vereist anesthesie en dus zowel verandert de hersenen staat en voorkomt gedragsmaatregelen. Een alternatieve methode is het gebruik van in vivo microdialyse om de continue meting van de hersenen extracellulaire concentraties van glucose, lactaat en verwante metabolieten in wakker ongebreidelde dieren nemen. Deze techniek is bijzonder nuttig in combinatie met taken om zich op specifieke hersengebieden en / of acute farmacologische manipulatie, bijvoorbeeld hippocampus metingen tijdens een ruimtelijk werkgeheugen taak (spontane afwisseling) tonen een dip in extracellulair glucose en lactaat stijging die die wijzen op verhoogde glycolyse 1,2 en intrahippocampale toediening van insuline zowel verbetert het geheugen en verhoogt de hippocampus glycollyse 3. Stoffen zoals insuline kan worden geleverd aan de hippocampus via dezelfde microdialyse probe gebruikt om metabolieten te meten. Het gebruik van spontane afwisseling als maat hippocampus functie is ontworpen om beschamen vermijden stressvolle motivators (bijv. voetschok), fixeren, of beloningen (bijvoorbeeld voeding), die zowel taakuitvoering en metabolisme te veranderen, deze taak ook een meten van motorische activiteit die controle mogelijk maakt voor niet-specifieke effecten van de behandeling. Samen deze methoden tot directe meting van de neurochemische en metabole variabelen regelgedrag.
Protocol
1. Chirurgie Voorbereiding
- Handling. Dieren (meestal ratten of muizen, hoewel de werkwijze voor microdialyse combinatie met gedragstherapie testen is grotendeels een algemeen alle vereiste nodig species-specifieke aanpassingen, bijvoorbeeld voor anesthesie) behandeld gedurende ten minste 10 min / dag minstens twee dagen voor de operatie. Uitgebreide behandeling is aangetoond dat dieren in een ongespannen toestand te laten op het moment van testen, waarbij mogelijke verwarren 2,4,5. Wij zullen ratten gedurende dit protocol als voorbeeld soort. Behandeling moet gebeuren zonder stress veroorzaakt door te trekken op bont van bijvoorbeeld latex of nitril handschoenen: dit kan het best worden bereikt met behulp van blote handen, in overleg met de faciliteit dierenarts en gezondheid van de werknemers ambtenaren. Als dit niet mogelijk is, katoen handschoenen worden gedragen belemmering meer handschoenen te voorkomen trekken aan de ratten vacht.
- Steriel Veld Voorbereiding. Voorafgaand aan chirurgie, de Surgical gebied wordt bereid, een steriel veld opgesteld rond de stereotactische inrichting en een steriele doek geplaatst over de inrichting, die een verwarmingselement dat wordt gebruikt voor rat lichaamstemperatuur. Een circulerende warm water pad nauwkeurige thermostaat gebruikt om oververhitting van het dier.
- Anesthesie inductie. De isofluraan vaporizer wordt gecontroleerd niveaus van isofluraan bevatten en verbonden met de inductiekamer. Verbindingen worden gecontroleerd om een gesloten lus te bevestigen. De lucht-handling vacuüm systeem wordt gecontroleerd op operationeel zijn. Isofluraan verdamping wordt ingeschakeld en de dieren geplaatst in de inductiekamer met een 5% isofluraan in zuurstof mix: dat wil zeggen, 5% isofluraan toegevoegd in een stroom van 100% zuurstof en aan de inductiekamer.
- Plaatsing in apparatuur. Dieren worden vastgezet in de stereotaxisch apparaat met behulp van earbars en een tand bar. Correcte earbar plaatsing resulteert in een onbeweeglijke hoofd en oren die plat liggen langs de earbars. Dierensnel bevestigd en de neus ingebracht in een speciaal ontworpen verdoving neuskegel; levering van verdampt isofluraan omgeschakeld van de inductiekamer de neuskegel en de verdoving mix ingesteld op 2-3% isofluraan in de zuurstofstroom naar de neuskegel leveren.
- Bevestiging van de anesthesie. Een chirurgische anesthesie vlak wordt bevestigd door het leveren van een harde kneep de voet en aanblazen het oog, zou een eventuele reactie veroorzaken. Deze tests worden herhaald ongeveer 15 min intervallen gedurende chirurgie om handhaving van een chirurgische anesthesie vlak bevestigen. Haar wordt uit de incisieplaats voordat ze de steriele veld.
2. Chirurgie
- Animal eerste behandeling. Oogzalf wordt toegepast op elke oogbal het drogen te voorkomen. 1 ml steriele zoutoplossing gegeven sc eventuele uitdroging tijdens de operatie, en het lichaam is bedekt met een steriele doek. Betadine wordt toegepast op de hoofdhuid en afgestreken van het centrumuit met een wattenstaafje, 70% ethanol wordt eveneens bemonsterd en de twee zwabberen stappen worden nog tweemaal herhaald om een geschikte incisie waarborgen. Huidcontact tijd betadine en alcohol ten minste 3 min vóór insnijding. Anesthesie wordt onderhouden en regelmatig gecontroleerd gedurende chirurgie; een sc injectie van carprofen 5 g / kg) gegeven om analgesie te initiëren en aseptische techniek wordt gebruikt. Analgesie wordt gegeven na inductie van de anesthesie bij alle stress te minimaliseren van injectie.
- Incisie en schedel voorbereiding. Een 3-4 cm snede sagitally gemaakt in het centrum van de schedel. Een 1:1 mengsel van bupivicaine: epinefrine wordt plaatselijk aangebracht op verdere analgesie en bloeding minimaliseren. De hoofdhuid wordt gehouden uit de buurt van de incisie met behulp van chirurgische clips en steriele swabs worden gebruikt om bovenliggende membranen te verwijderen uit de schedel. Coördinaten voor het boren worden gemeten met behulp van bregma als referentiepunt, gemarkeerd met een steriele boor (of, als alternatief, een hand-held brandijzer device), en opnieuw bevestigd op juistheid voordat u gaat boren begint. Coördinaten voor specifieke hersengebieden van belang (bijvoorbeeld hier de hippocampus) worden bepaald met een brein atlas. Voor de hippocampus microdialyse, gebruiken we een boorlocatie op 5.6 mm achter bregma, +5.0 laterale, en 3,0 ventrale dura uit.
- Boren. Drie gaten geboord door de schedel, met en waarbij er slechts minimale kracht zoals die trauma aan de dura en de onderliggende membranen zeer gering of afwezig toepassing. Een gat is bij de gemeten plaats van canule inbrengen, de andere twee zijn gepositioneerd zoals geschikt voor het inbrengen van de schedel schroeven. Doel-en kleinbedrijf schroeven (bijv. 1,17 mm zelftappende schroeven; Fine Science Tools) worden ingebracht in deze gaten zonder impact op de hersenen onder, en worden gebruikt als ankerpunten voor latere tandheelkundig cement toepassing.
- Canule plaatsing en sluiting. De canule is geplaatst op invoegcoördinaten, die opnieuw bevestigd de plaats van het gat geboord is,en wordt daarna langzaam verlaagd tot de gewenste diepte. Eenmaal goed geplaatst, wordt de canule vastgezet met tandheelkundig cement. Zo nodig wordt een steriele chirurgische hechtdraad gebruikt om de wond te sluiten. Een stilet wordt in de canule de doorgankelijkheid te handhaven. In dit protocol gebruiken we een CMA12 sonde en gids canule (CMA / Microdialyse).
- Acute post-chirurgische zorg. 3 ml steriele zoutoplossing gegeven sc aan hydratatie gaan, een sc injectie van carprofen 5 g / kg) wordt ook gegeven aan analgesie leiden. Dieren worden uit de inrichting en in een verwarmde verkoeverkamer in een schone kooi, en gevolgd totdat zij volledig hersteld van anesthesie. Volledig herstel wordt beoordeeld door het herstel van de oprichtreflex en normale motoriek. Dieren worden vervolgens terug naar hun kooi en regelmatige deelneming kamer.
- Korte-termijn follow-up zorg. Kooien van dieren die een operatie hebben ondergaan, zijn gemarkeerd met de datum van de operatie. Dieren worden ten minste eenmaal per dag gedurende minstens three dagen na de operatie, en gegeven een carprofen kauwbare tablet (2 mg) op de dag na de operatie en elk van de twee volgende dagen. Als dieren niet consumeren de carprofen, kan injecteerbaar carprofen worden gegeven aan adequate pijnstilling te garanderen. Bewaakt zowel de algehele gezondheid van het dier en de toestand van de wond (voor infectie, roodheid, etc.) naar aanleiding van de institutionele verzorging van dieren richtlijnen en het zoeken naar hulp of advies van dierenverzorgers of de dierenarts indien nodig. Belangrijker mee dat correcte verwerking en acclimatisering aan de experimentator essentieel: dieren uitgebreid behandeld, waaronder manipulatie van de canule, totdat er geen teken van nervositeit of stress blijft bij aanraking door de experimentator.
- Latere dier zorg en behandeling. Dieren volgen nodige tests en euthanasie is afhankelijk van het goedgekeurde protocol en hun specifieke experimentele groep.
3. Microdialyse (MD)
- Perfusaten voorbereiding. Kunstmatige extracellulaire vloeistof (AECF) wordt gemaakt met 153,5 mM Na, 4,3 mM K, 0,41 mM Mg, 0,71 mM Ca, 139,4 mM Cl, 1,25 mM glucose, gebufferd bij pH 7,4 6 OPMERKING dat accurate vloeistof samenstelling van essentieel belang is:. Onjuistheden of gebruik andere, minder fysiologische vloeistoffen zoals Ringer's of PBS voor microdialyse zal leiden tot een aanzienlijke onjuiste resultaten 6. Bijzonder op dat de ionische samenstelling van de extracellulaire vloeistof (ECF) niet dezelfde als die van de CSF, Zoals blijkt uit een 2004 gedetailleerde studie van de hippocampus ECF 6. Op de testdag, bovine serum albumine (BSA) worden toegevoegd met 2% gewicht / gewicht en volledig opgelost, hierdoor verlies van peptiden, zoals insuline door naleving van de buis, en vermindert ook het risico van vloeistofverlies (ultrafiltratie) de probe membraan. Na bereiding, moet de perfusievloeistof gefiltreerd door een 0,2 um filter.
- Als een behandeling zoals insuline wordt afgegeven aan de behain interessegebied (hier de hippocampus), bereid deze behandeling met een bekende hoeveelheid van het bereide AECF met de geschikte geneesmiddelconcentratie. Voor insuline, heeft een concentratie van 400 nM (66,7 μU / ul) voor levering via reverse microdialyse aangetoond hippocampale metabolische, cognitieve functie 7 beïnvloeden. Merk op dat de resulterende weefselconcentratie van insuline wordt hier gemeten en blijft onbekend.
- Het opzetten van mD sonde en lijnen. Maak een frisse microdialyse probe en lijn de dag voorafgaand aan het testen. Maak twee afzonderlijke lijnen voor "instroom" en "uitstroom". Gebruik PE50 buis twee 1 meter lange stukken FEP buis sluiten en dat er een minimale dode ruimte tussen de lijnen zorgen. Sluit de instroom slang een 1 ml Hamilton spuit met steriel gefiltreerd, gedeïoniseerd H 2 0 (dH 2 0) en vervolgens aan de probe.
- Microdialyse draaibaar. Om het vrije verkeer van dieren tijdens het gebruik van metingen, sluit een vloeistof draaibare op de inFlow en uitstroom lijnen, dicht bij de pomp, met behulp van extra FEP buis. Vergeet het inwendige volume van de draaibare slang en rekening gezien in timing van de bemonstering (hieronder).
- Het opzetten van mD pomp. Zet de mD pomp en draaien op 1,5 pl / min tot u dH 2 0 het verlaten van de uitlaatbuis op de sonde. Dan, terwijl de pomp wordt uitgeschakeld, sluit u de andere lijn tussen de uitstroom buis en een monstername buis. Run 5 ml door de buis en plaats de sonde in een injectieflacon met steriel dH 2 0 's nachts, ervoor te zorgen dat de sonde altijd nat blijft.
- Pre-indringende proefpersoon. 24 uur vóór de proef verwijderen dummy stylet van het hoofd van de rat en plaats een mD probe (alleen voor dit doel niet voor bemonstering) gedurende 10 minuten. Vervang vervolgens de dummy stilet en zet de rat in zijn kooi. Deze procedure is bedoeld om enig effect van reactieve gliosis minimaliseren de testdag 8 en in onze handen, geeft dit een goede results die passen gegevens van andere technieken en lijken hippocampus activatie 2,5,7,9 weerspiegelen; anderen gebruikt een soortgelijke benadering dat de sonde laat in plaats gedurende 24 uur vóór de meting, die ook een goede benadering indien schade aan de probe overnacht worden vermeden.
- Probe evenwicht. Op de dag van microdialyse, vul de Hamilton spuit en scintillatievat met gefilterd AECF en pompen door equilibreren gedurende 1 uur. Indien nodig vult een tweede Hamilton spuit met bereid behandeling (bijvoorbeeld insuline-AECF) en plaats in de injectiepomp.
- Probe inbrengen. Wanneer evenwicht is voltooid, verwijdert u de dummy stilet en voorzichtig de geëquilibreerde mD sonde in de hersenen van de rat via de canule. Plaats de rat in een doorzichtige plastic doos die een deel van het huis van de rat beddengoed bevat. Zorg ervoor dat als tegenwicht voor de buis: een 1,6 ml microcentrifuge buis gevuld met water om de slang buiten de kooi op een zodanige wijze dat de zwaartekracht de microdi houdt bevestigenALYSE lijnen unkinked, maar niet strak. Laat equilibreren probe in rat gedurende 2 uur. Aan het begin van deze periode, bevestigen dat de stroom van perfusaat wordt gedeblokkeerd: dit is het gemakkelijkst door het verzamelen van perfusaat uitstroom over een bepaalde periode en een gewicht van het monster te bevestigen dat de verwachte volume wordt het systeem verlaten. Elke sonde die opbrengsten <90% van de verwachte volume, en niet zichzelf te corrigeren na het verwijderen en opnieuw invoegen, moet worden vervangen (anders oedeem op de sondepunt zal resulteren). Als de stroom is aanhoudend laag of afwezig is, controleert u alle aansluitingen op lekkage, bij gebreke daarvan, slangen los te koppelen in fasen om te zien of de blokkade kan worden geïsoleerd. Als het probleem niet is geïdentificeerd, vervang dan de sonde, als het probleem niet is opgelost, kan het nodig zijn om opnieuw te beginnen met nieuwe sonde en lijnen uit paragraaf 3.3. De twee uur equilibratie periode staat de bloed-hersenbarrière verzegelt rond de sonde en voorkomen van acute effect probe insertie.
- Monsters. Zorg ervoor dat de correlation tussen monster dialyse (van hersenen) en inzameling (in buis) wordt nauwkeurig berekend. Bijvoorbeeld met gebruikmaking van twee meter FEP buizen tussen draaibare probe er een totaal volume tussen probe en verzameling van 30 pl en daarom duurt 20 minuten bij 1,5 ul / min debiet voor monster om door de probe, slangen, connectors en draaien aan het einde van buis bereiken collectie. Bij het verzamelen van monsters ervoor te zorgen dat u voldoende volume om de concentratie nodig is voor uw assays hebben te verzamelen. Hier zullen we gebruik maken van 5 min sample bakken, en dus verzamel 7,5 ul van dialysaat in elke collectie buis.
- Beginstalen. Zodra evenwicht is voltooid, begint monstername. Verzamel tenminste drie monsters terwijl de rat in rust in het huis kamer voor een stabiel basislijn metingen
- Behandeling timing. Zorg ervoor dat benodigde timing voor aanvang van de behandeling te berekenen voorafgaand aan het experiment: onthoud dat net zoals er een tijdsverschil tussen dialyseen monsterverzameling is er een vertraging (gewoonlijk identiek) tussen perfusaat waarbij de spuit en aankomen op hippocampus het dier. Vandaar dat in onze setup met een 30 ul volume tussen spuit en sonde, wijzigt u de spuit aan die met de behandeling perfusaat 20 min voordat u de behandeling te beginnen met aankomst op de hippocampus wensen.
- Veranderen van spuiten. Een vloeistof schakelaar kan worden gebruikt indien gewenst, maar is niet nodig: op het juiste moment, koppelt de instroom lijn van de controle-perfusaat spuit en snel verbinding te maken met de behandeling-perfusaat spuit. Dit duurt niet meer dan 5 sec tot wezenlijke onderbreking te voorkomen dat de perfusaat flow. Rekening mee dat dit proces moet worden teruggedraaid nadat de gewenste dosering is geleverd, als een in de tijd beperkte levering van de behandeling gewenst is. Alternatief kan de behandeling tot de bemonsteringsduur (zie figuur 2). Luchtbellen niet worden opgenomen in de lijn tijdens schakeling vanspuiten, deze kunnen verzamelen op de dialysemembraan en verminderen probe efficiency.
- Behavioral testen. Als het uitvoeren van een gedrags-taak, volgt u deze procedure (zie punt 4 hieronder). NOTA VAN dat de coördinatie met de levering van de behandeling aan de hippocampus belangrijk is. Zo moet toediening van insuline worden getimed tot 10 minuten voor het begin van het testen van 10 optreden. Daarom moet de omschakeling naar een insuline-bevattende perfusaat optreden 30 minuten voorafgaand aan gedrags-testen (20 min voor perfusaat om door de lijnen plus 10 min gewenste levertijd vooruit testen).
- Voltooiing van monstername. Na het verzamelen van de gewenste monsters, verwijder voorzichtig de sonde van het hoofd van het dier, wederom rekening houdend rekening te houden met vertraging tussen dialyse en monstername. Keer terug het dier naar zijn kooi en observeer de voet voor een post-experimentele verandering in gezondheid of zijn gedrag totdat het dier wordt gedood en de hersenen verwijderd om te bevestigen juistesonde plaatsing. Als offer niet onmiddellijk optreden, de terugkeer van de dummy stilet om de canule aan een introductie van vreemd materiaal te vermijden.
- Analysis. De analysemethode afhankelijk van de analyt (en) van belang. Omdat dialyse sampling niet voor volledige analyt equilibreren bij de probe membraan moet monsterconcentraties worden gecorrigeerd ECF gebruikmaking van de zero-net-flux methode 11,12 geven.
4. Behavioral Testen
- Plaatsing op doolhof. Na basislijn monsters (dat wil zeggen, na ten minste drie monsters hebben afgerond dialyse, maar kan nog steeds in de uitstroom buis worden verzameld), beweeg de rat in de gedrags-testapparatuur. Passende taak kan worden gebruikt, de gegevens in figuur 1 werden verzameld met een vierarmig plus maze-vormige en het meten spontane afwisseling, die een maat is van ruimtelijke werkgeheugen: de rat wordt eerst geplaatst in de center van het doolhof en vrij kunnen 9,13 verkennen. Omdat elke gedrags test mogen worden gebruikt, de focus van dit protocol is niet op de specifieke taak gebruikt als een voorbeeld (dat elders 9,14,15 gedetailleerd), maar in het kort, zijn dieren toegelaten tot de doolhof te verkennen (de periode van het grijze vierkant in figuur 1) en gebruik hippocampally-afhankelijke processen geheugen waarvan armen behouden onlangs zijn bezocht.
- Dialyseslang beweging tijdens het testen. Houd de slang zodat hij vrij kan bewegen, noch belemmeren de rat beweging of te mogen bewegen voor het dier en het af te leiden. Verblijf in plaats en het minimaliseren van uw eigen beweging, zodat u niet van invloed op de rat gedrag.
- Vervolg monstername. Zoals tijdens de basislijn verplaatst u de uitstroom slang aan op een nieuwe collectie buis om de 5 minuten.
- Afwisseling testen. Het dier zich vrij verkennen het doolhof gedurende 20 minuten. Noteer de volgorde en timing van de arm entries met gebruikmakingeen video-opname of met de hand voor latere taakuitvoering analyse 9,15.
5. Post-testen
- Eindmonster collectie. Na het testen, verwijder voorzichtig rat uit doolhof en terug te keren naar de kamer te controleren. Ga verder microdialyse monstername voor ten minste vier monsters aan de periode van het herstel van de taakuitvoering te dekken.
- Probe verwijderen. Nadat alle monsters zijn verzameld, verwijder voorzichtig de sonde van het hoofd van het dier en breng het in een opslag flacon, de terugkeer van de dieren naar de kooi.
- Probe opslag. Na terugkomst dier naar de kooi en het invullen van verzameling van alle resterende dialysaat, spoel de sonde met dH 2 0 en op te slaan in een scintillatieflesje gevuld met dH 2 0 en bedekt met parafilm. Spoel de slang door naar een spuit met een oplossing van 1:10.000 Kathon in dH 2 0 microben groei te voorkomen. Probes kunnen opnieuw worden gebruikt mits zij goede doorstroming en hebbengeen schade aan het membraan, met zorg deze regelmatig worden dan tien toepassingen.
- Histologie. Dood het dier en verwijder de hersenen. Plak op een cryostaat en gebruik van standaard histologische technieken (bijv. cresyl violet kleuring) om de juiste plaatsing probe bevestigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ratten moeten snel herstellen van een operatie en wees alert, beweeglijk en actief binnen de 30 minuten na beëindiging van de anesthesie. Het effect van de canule kap moet minimaal indien de ingreep wordt uitgevoerd schoon en minimale tandheelkundig cement. Als een teken van infectie wordt opgemerkt tijdens de post-operatieve monitoring, of de rat is op geen enkele manier tekenen van nood of ongemak, onmiddellijk te beëindigen het experiment, dit zou moeten zijn uiterst zeldzaam. Tijdens de behandeling voorafgaand aan de test, moeten de dieren alert zijn, vrij beweeglijk, vriendelijk en nieuwsgierig. Goed behandeld moeten dieren hoofdzaak geen waarneembare spanning blijven van een operatie, post-chirurgisch herstel, of de aanwezigheid van de onderzoeker, dit kan worden bevestigd indien gewenst door meting van plasma stresshormonen (adrenaline, glucocorticoïden) en / of glucose 2,4 , 5.
Brain ECF glucose is typisch in het bereik 0,5 - 1,5 mm, variërend per hersengebied, hoewel hogere waardenkan worden gezien in diabetische dieren, in de hippocampus, baseline glucose concentraties zijn in de orde van 1,25 afsluiten mM 6,12. In afwezigheid van exogeen behandeling dient een dip in ECF glucose (en gewoonlijk een stijging in ECF lactaat) zichtbaar tijdens taakuitvoering, in hersengebieden betrokken bij de bemiddeling deze taak (zie figuur 1 bijvoorbeeld): dit weerspiegelt de verhoogde metabole activiteit veroorzaakt door de cognitieve belasting 9,14,16. Soortgelijke wijzigingen kunnen als bewijs dat een behandeling lokaal metabolisme, zoals bijvoorbeeld was na acute toediening van insuline door toevoeging aan het perfusaat 7 (figuur 2) toe.
In het algemeen een goed handvat dier moet gedrags-tests uit te voeren met geen enkel teken van angst en zonder enig teken van bewustwording van de microdialyse buis: tekenen van overmatige verzorging, immobiliteit, een indicatie van pijn of pogingen van het dier aan de sonde te verwijderen gevenwaarschijnlijk onvoldoende behandeling en / of infectie rond de sonde site, en moet worden gezien als een indicatie dat experiment te beëindigen.
Dieren die insuline toediening dient, naast verhoogde hippocampale metabolisme vertonen aanzienlijk verbeterde ruimtelijke geheugen 7. Control, moet onbehandelde dieren gemiddelde afwisseling prestaties op de 4-arm doolhof van tussen de 65 en 75% 7,9,14.
Figuur 1. Taak-geassocieerd dip in de hippocampus ECF glucose (overgenomen van 9). Grijze box is de periode van doolhof testen op spontane afwisseling (SA). Paarse lijn geeft de hippocampus glucose bij dieren met geen doolhof testen (maar die waren anders identiek behandeld). Rode lijn is de metingen bij dieren het uitvoeren van de 4-arm SA taak; oranje lijn toont metingen bij dieren het uitvoeren van de eenvoudiger3-arm versie van SA.
Figuur 2. Veranderingen in hippocampale glucose en lactaat na toediening van insuline via opneming in het perfusaat (naar 7). Insuline bereikt de hippocampus op het punt aangegeven door pijl en continu daarna toegediend. Dieren werden getest in hun kooien, zonder manipulatie gedrag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Alle oplossingen in microdialyse onmiddellijk worden gefilterd voor gebruik met behulp van een 0,2 um filter. Na het inbrengen van de sonde in de geleiding canule in acht om te bevestigen dat stroom wordt gehinderd en monstername plaatsvindt. Als de stroom stopt na het inbrengen, de meest waarschijnlijke oorzaak van schade aan de probe membraan veroorzaakt door onvoldoende zorg bij het insteken, en een nieuwe sonde moet worden vervangen.
Zoals hierboven opgemerkt, is een belangrijk voordeel van deze werkwijzen is het ontbreken van verwarren, waardoor zowel gedrags neurochemische maatregelen in wakkere, vrij bewegende dieren: om te profiteren van dit uitgebreide behandeling voorafgaand aan het testen is essentieel zodat het dier tijdens onbelast metingen. De verevening bedraagt doorgaans voldoende om een stabiele metabole basis is, maar voedingsmiddel kan worden verwijderd 1-2 uur voorafgaand aan de test indien gewenst, om de uniforme bloedsuikerspiegel waarborgen in dieren.
The twee belangrijkste beperkingen van mD als steekproeftechniek zijn (i) beperkte omvang van analyt en (ii) kans op verlies van analyt door hechting in de buis. De eerste kan worden verminderd tot op zekere hoogte door het gebruik van mD probes met een groter molecuulgewicht cutoff. Typische commerciële probes mogelijk cutoffs tot 100 kD, zodat moleculen tot misschien 50 kD passeert relatief onbelemmerde, maar het gebruik van lagere cutoff membranen wordt aanbevolen als mogelijk een monster verloren via ultrafiltratie bij de sondepunt minimaliseren. Adhesie van doelmoleculen de slang een probleem vooral in het geval van peptide metingen, waarvan vele algemeen houden aan buizen FEP en dus zowel analyt herstel en meetnauwkeurigheid verlagen. Dit probleem kan worden beperkt door (i) het voorbehandelen van het inwendige van de buis met een perfusaat waaraan 2% runderserumalbumine toegevoegd, als een blokkerend middel en (ii) door het minimaliseren van de lengte van de buis rendement: als needed kan een lichtgewicht verzameling flesje dicht bij de uitstroom van de probe worden bevestigd, maar dit brengt bijkomende problemen schakelen verzamelbuizen zonder de dieren, vooral tijdens gedrag testen. Een voordeel van de techniek is dat monsters worden verkregen in een vorm vrij van cellulair debris of grote moleculen zoals enzymen, en in het algemeen geschikt voor directe analyse via injectie in HPLC, MS of andere analytische machines zoals het is zonder verdere zuivering , dit staat ook in veel gevallen de analyse van meerdere analyten in elk monster (zoals glucose en lactaat metingen in figuur 2).
Een variatie op het gebruik van reverse microdialyse om farmacologische behandelingen te leveren is het gebruik van dual-microinjectie microdialyse probes, verkrijgbaar van verschillende bronnen. De boring van de injectiepoort het algemeen zeer smal en gevoelig voor verstopping en kan moeilijk nauwkeurigde timing en / of het volume van behandeling levering. Dit alternatief is daarom alleen aanbevolen voor behandelingen die niet vatbaar zijn voor toediening via opneming in het perfusaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de NIH / NIDDK (DK077106 om ECM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
The majority of reagents are standard laboratory grade and can be obtained from a supplier of choice. Similarly, equipment such as syringe pumps and tubing can be used from any of several manufacturers. Specific items used here for which details are important include: |
|||
| CMA 12 microdialysis probes | CMA/ Microdialysis | CMA-12-XXX | These are available in various membrane lengths and cutoffs, indicated by specific codes in the 'XXX.' |
| Human insulin (Humulin) | Eli Lilly | N/a | |
| Liquid swivel | Instech | 375/D/22QM | This specific swivel has very low torque and internal volume, as well as a nonreactive quartz lining. |
References
- McNay, E. C., Fries, T. M., Gold, P. E. Decreases in rat extracellular hippocampal glucose concentration associated with cognitive demand during a spatial task. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (6), 2881 (2000).
- McNay, E. C., Gold, P. E. Age-related differences in hippocampal extracellular fluid glucose concentration during behavioral testing and following systemic glucose administration. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 56 (2), 66 (2001).
- McNay, E. C., McCarty, R. C., Gold, P. E. Fluctuations in brain glucose concentration during behavioral testing: dissociations between brain areas and between brain and blood. Neurobiol. Learn. Mem. 75 (3), 325 (2001).
- McNay, E. C., Gold, P. E. Extracellular glucose concentrations in the rat hippocampus measured by zero-net-flux: effects of microdialysis flow rate. 72 (2), 785 (1999).
- McNay, E. C., Sherwin, R. S. Effect of recurrent hypoglycemia on spatial cognition and cognitive metabolism in normal and diabetic rats. Diabetes. 53 (2), 418 (2004).
- McNay, E. C., et al. Hippocampal memory processes are modulated by insulin and high-fat-induced insulin resistance. Neurobiology of Learning and Memory. 93 (4), 546 (2010).
- McNay, E. C., McCarty, R. C., Gold, P. E. Fluctuations in brain glucose concentration during behavioral testing: dissociations between brain areas and between brain and blood. Neurobiology of Learning & Memory. 75 (3), 325 (2001).
- McNay, E. C., Williamson, A., McCrimmon, R. J., Sherwin, R. S. Cognitive and neural hippocampal effects of long-term moderate recurrent hypoglycemia. Diabetes. 55 (4), 1088 (2006).
- McNay, E. C., Sherwin, R. S. From artificial cerebro-spinal fluid (aCSF) to artificial extracellular fluid (aECF): microdialysis perfusate composition effects on in vivo brain ECF glucose measurements. Journal of Neuroscience Methods. 132 (1), 35 (2004).
- McNay, E. C., et al. Hippocampal memory processes are modulated by insulin and high-fat-induced insulin resistance. Neurobiology of Learning and Memory. 93 (4), 546 (2010).
- Benveniste, H., Drejer, J., Schousboe, A., Diemer, N. H. Regional cerebral glucose phosphorylation and blood flow after insertion of a microdialysis fiber through the dorsal hippocampus in the rat. Journal of Neurochemistry. 49 (3), 729 (1987).
- Benveniste, H., Diemer, N. H. Cellular reactions to implantation of a microdialysis tube in the rat hippocampus. Acta Neuropathologica. 74 (3), 234 (1987).
- McNay, E. C., Fries, T. M., Gold, P. E. Decreases in rat extracellular hippocampal glucose concentration associated with cognitive demand during a spatial task. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (6), 2881 (2000).
- McNay, E. C., et al. Hippocampal memory processes are modulated by insulin and high-fat-induced insulin resistance. Neurobiol. Learn Mem. 93 (4), 546 (2010).
- Lonnroth, P., Jansson, P. -A., Smith, U. A microdialysis method allowing characterization of intercellular water space in humans. American Journal of Physiology. 1987, E228 (1987).
- McNay, E. C., Gold, P. E. Extracellular glucose concentrations in the rat hippocampus measured by zero-net-flux: effects of microdialysis flow rate. 72 (2), 785 (1999).
- Lalonde, R. obert The neurobiological basis of spontaneous alternation. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 26 (1), 91 (2002).
- Richman, C., Dember, W., Kim, P. Spontaneous alternation behavior in animals: A review. Current Psychology. 5 (4), 358 (1986).
- McNay, E. C., Canal, C. E., Sherwin, R. S., Gold, P. E. Modulation of memory with septal injections of morphine and glucose: effects on extracellular glucose levels in the hippocampus. Physiol. Behav. 87 (2), 298 (2006).
- McNay, E. C., Gold, P. E. Memory modulation across neural systems: intra-amygdala glucose reverses deficits caused by intraseptal morphine on a spatial task but not on an aversive task. Journal of Neuroscience. 18 (10), 3853 (1998).
- Rex, A., Bert, B., Fink, H., Voigt, J. P. Stimulus-dependent changes of extracellular glucose in the rat hippocampus determined by in vivo microdialysis. Physiol. Behav. 98 (4), 467 (2009).
