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Neuroscience

Hippocampus Insulin Mikroinjektion und doi: 10.3791/4451 Published: January 11, 2013

Summary

Modulation der hippocampally-abhängige räumliche Arbeitsgedächtnis durch direkte intrahippocampal Mikroinjektion, begleitet und gefolgt von

Abstract

Glukosestoffwechsel ist ein nützlicher Marker für die lokale neuronale Aktivität, die die Grundlage von Methoden wie 2-Desoxyglucose und funktionelle Kernspintomographie. Allerdings solcher Methoden in Tiermodellen erfordert die Verwendung Anästhesie und damit sowohl verändert das Gehirn Zustand und verhindert Verhaltensmaßnahmen. Ein alternatives Verfahren ist die Verwendung von in vivo-Mikrodialyse zur kontinuierlichen Messung des Gehirns extrazellulären Flüssigkeit Konzentrationen von Glukose, Laktat, und verwandte Metaboliten an wachen, ungehemmte Tiere. Diese Technik ist besonders nützlich, wenn mit Aufgaben entworfen, um auf spezifische Hirnregionen und / oder akute pharmakologische Manipulation verlassen kombiniert, zum Beispiel, zeigen Hippocampus Messungen während einer räumlichen Arbeitsgedächtnis Aufgabe (spontane Wechsel) ein erfrischendes Bad im extrazellulären Glukose und Lactatanstiegs, die sind suggestive der verstärkten Glykolyse 1,2 und intrahippocampal Verabreichung von Insulin sowohl verbessert das Gedächtnis und erhöht Hippocampus Glykollyse 3. Substanzen wie Insulin kann der Hippocampus über den gleichen Mikrodialysesonde verwendet, um Metaboliten zu messen geliefert werden. Die Verwendung von spontanen Wechsels als Maß der Hippokampus-Funktion ausgelegt ist, jede von confound belastenden Motivatoren (zB Fußschock), Ruhigstellen oder Belohnungen (zB Nahrungsmittel), die alle beide Aufgabenleistung und Metabolismus verändern kann zu vermeiden; diese Aufgabe stellt auch eine Messung der motorischen Aktivität, die Steuerung ermöglicht für unspezifische Effekte der Behandlung. Zusammen ermöglichen diese Verfahren die direkte Messung der neurochemischen und metabolische Variablen Regelverhalten.

Protocol

Ein. Chirurgie Vorbereitung

  1. Handhabung. Tiere (am häufigsten, Ratten oder Mäusen, obwohl das Verfahren zur Mikrodialyse und Kombination mit Verhaltenstests ist weitgehend eine allgemeine eines mit einem gewünschten artspezifischen Anpassungen nötig, z. B. für die Anästhesie) werden für mindestens 10 min / Tag für mindestens gehandhabt zwei Tage vor der Operation. Umfangreiche Handhabung hat sich gezeigt, Tieren in einem unbelasteten Zustand zum Zeitpunkt des Testens zu verlassen, möglich vermieden confound 2,4,5. Wir werden Ratten in diesem Protokoll als Beispiel Arten verwenden. Dies kann am besten erreicht werden mit bloßen Händen, in Absprache mit der Anlage Tierarzt und die Gesundheit der Mitarbeiter Beamten: Handhabung muss ohne Stress durch Ziehen am Fell von zB Latex oder Nitril verursacht erfolgen. Ist dies nicht möglich, sollte weicher Baumwolle Handschuhe über Barriere Handschuhe getragen werden, um zu vermeiden, Ziehen an der Ratten Fell.
  2. Sterile Feld Vorbereitung. Vor Beginn der Operation, die chirurgischal-Bereich hergestellt wird, eine sterile Feld um den stereotaktischen Vorrichtung und ein steriles Tuch über das Gerät gestellt vorbereitet und deckt ein Heizkissen, die verwendet werden, um rat Körpertemperatur aufrecht zu erhalten ist. Eine umlaufende warmem Wasser Pad mit genauen Thermostat wird verwendet, um eine Überhitzung des Tieres.
  3. Narkose. Der Verdampfer Isofluran wird überprüft, um einen optimalen Gehalt an Isofluran enthalten ist und mit der Ansaugkammer. Verbindungen werden geprüft, um eine geschlossene Schleife zu bestätigen. Die RLT-Vakuum-System wird geprüft, in Betrieb sein. Isofluran Verdampfung wird eingeschaltet und das Tier in die Induktionskammer platziert mit einer 5% Isofluran in sauerstoffarmen Gemischs: das heißt, 5% zugegeben Isofluran in einen Strom von 100% Sauerstoff und an der Ansaugkammer.
  4. Placement in die Vorrichtung. Die Tiere werden in der stereotaktischen Vorrichtung mit earbars und einen Zahn bar gesichert. Richtig earbar Platzierung ergibt sich eine immobile Kopf und Ohren, die flach entlang der earbars. Tiereschnell gesichert und die Nase in einem zu diesem Zweck konzipiert Anästhesie nosecone eingefügt; Lieferung von verdampften Isofluran wird von der Ansaugkammer zum Nasenkonus und der Narkose Mix eingestellt auf 2-3% Isofluran in den Sauerstoffstrom werde der nosecone liefern eingeschaltet.
  5. Bestätigung der Anästhesie. Chirurgisches Anästhetikum Ebene wird durch die Bereitstellung einer harten Quetschung am Fuß und einen Luftstoß auf das Auge bestätigt; sollte weder eine Antwort hervorrufen. Diese Tests werden in etwa 15 min Abständen während der Operation wiederholt werden, um Wartung einer chirurgischen Anästhesie plane bestätigen. Haar ist aus der Einschnittstelle vor Eintritt in den sterilen Bereich entfernt.

2. Chirurgie

  1. Tierische Erstbehandlung. Augensalbe ist jedem Augapfels um Austrocknung zu vermeiden aufgebracht. 1 ml steriler Kochsalzlösung wird sc gegeben, jede Dehydratation während der Operation zu verhindern, und der Körper mit einem sterilen Tuch bedeckt. Betadine auf die Kopfhaut aufgebracht wird, und von der Mitte abgetupftmit einem Wattestäbchen, 70% Ethanol wird in ähnlicher Weise abgestrichen und die beiden swabbing Schritte werden zweimal wiederholt, um eine geeignete Inzisionsstelle gewährleisten. Hautkontakt Zeit für betadine und Alkohol sollte mindestens 3 min vor Hautschnitt sein. Anästhesie gehalten wird und überprüft regelmäßig während der Operation, ein einzelner subkutaner Injektion von Carprofen 5 g / kg) gegeben, um Analgesie zu initiieren, und aseptischen Technik wird verwendet. Analgesie nach Einleitung der Narkose um eine Belastung von Injektion zu minimieren gegeben.
  2. Incision und Schädel Vorbereitung. A 3-4 cm Schnitt sagittal in der Mitte des Schädels hergestellt. Eine 1:1-Mischung aus Bupivacain: Adrenalin wird topisch auf weitere Analgesie und minimieren Blutungen angewendet. Die Kopfhaut wird entfernt von dem Einschnitt unter Verwendung von chirurgischen Clips und sterile Tupfer werden zur darüberliegenden Membranen aus dem Schädel zu entfernen gehalten. Koordinaten zum Bohren gemessen den Bregma als Bezugspunkt, markiert mit einem sterilen Bohrkrone (oder, alternativ, ein Handgerät Kauter device) und für die Richtigkeit vor dem Bohren beginnt erneut bestätigt. Koordinaten für bestimmte Regionen des Gehirns von Interesse (zB hier der Hippocampus) werden mit einem Hirnatlas. Für Hippocampus Mikrodialyse, verwenden wir eine Bohrstelle bei 5,6 mm posterior Bregma, 5,0 lateraler und 3,0 ventral von Dura.
  3. Drilling. Drei Löcher werden durch den Schädel gebohrt, wobei darauf geachtet wird, um nur eine minimale Kraft, so dass Verletzungen der Dura und darunterliegenden Membranen minimal oder nicht vorhanden ist anzuwenden. Eine Loch an der Stelle gemessen Kanüleneinführvorrichtung, die beiden anderen sind als praktisch für Einführen positioniert Totenkopf Schrauben. Zweck-Schrauben (z. B. 1,17 mm Blechschrauben; Fine Science Tools) werden in diese Bohrungen ohne Beeinträchtigung des Gehirns unter insertiert und als Ankerpunkte für nachfolgende Dentalzement Anwendung verwendet.
  4. Kanüle Platzierung und Schließung. Die Kanüle wird bei Einsetzen Koordinaten, welche erneut bestätigt die Seite des Loches gebohrt werden positioniert,und wird dann langsam zu der Zieltiefe abgesenkt. Einmal richtig positioniert ist, wird die Kanüle an Ort und Stelle mit Zahnzement befestigt. Falls notwendig, wird eine einzelne sterilen chirurgischen Naht verwendet, um die Wunde zu verschließen. Ein Stilett in die Kanüle eingeführt, um die Durchgängigkeit aufrechtzuerhalten. In diesem Protokoll verwenden wir eine CMA12 Sonde und Führungskanüle (CMA / Microdialysis).
  5. Akute postoperative Versorgung. 3 ml steriler Kochsalzlösung wird sc gegeben Hydratisierung fortzusetzen; eine einzige subkutane Injektion von Carprofen 5 g / kg) ist ebenfalls angegeben, um Analgesie zu initiieren. Tiere werden aus der Vorrichtung entfernt und in einen vorgewärmten Aufwachraum, in einem sauberen Käfig und überwacht, bis sie vollständig aus der Narkose zurückgewonnen werden. Eine vollständige Erholung wird durch die Wiederherstellung des Stellreflexes und normale Fortbewegung beurteilt. Die Tiere werden dann in ihrem eigenen Käfig und regelmäßige Beteiligung Raum wieder zugeführt.
  6. Short-term follow-up Pflege. Käfige der Tiere, die operiert wurden sind mit dem Datum der Operation markiert. Die Tiere werden mindestens einmal pro Tag für mindestens thr überwachtee Tagen nach der Operation und gegebenen Carprofen Kautablette (2 mg) am Tag nach der Operation und jeden der beiden folgenden Tagen. Wenn Tiere nicht verbrauchen die Carprofen, kann injizierbaren Carprofen gegeben ausreichende Analgesie zu gewährleisten. Überwachung sowohl die allgemeine Gesundheit des Tieres und den Zustand der Wunde (für eine Infektion, Rötung, etc.) nach institutionellen animal care Richtlinien und sucht die Hilfe oder Beratung Tierpfleger oder Tierarzt, wenn nötig. Wichtig ist, dass entsprechende Handhabung und Akklimatisierung an den Experimentator wesentlich ist: Tiere sollten ausgiebig behandelt werden, einschließlich Manipulation der Kanüle, bis kein Zeichen von Nervosität oder Stress bleibt, wenn durch den Experimentator behandelt.
  7. Nachfolgende Tier Pflege und Behandlung. Die Tiere werden geeignete Tests und Euthanasie Verfahren nach dem genehmigten Protokoll und ihre spezifischen experimentellen Gruppe folgen.

3. Microdialysis (mD)

  1. Perfusaß Vorbereitung. Künstliche extrazellulären Flüssigkeit (AECF) mit 153,5 mM Na, 4,3 mM K, 0,41 mM Mg, 0,71 mM Ca, 139,4 mM Cl, 1,25 mM Glukose, gepuffert bei pH 7,4 6 gemacht HINWEIS dass genaue Fluidzusammensetzung wichtig ist:. Ungenauigkeiten oder verwenden von anderen, weniger physiologischen Flüssigkeiten wie Ringer-oder PBS für Mikrodialyse wird deutlich fehlerhaften Ergebnissen 6 führen. Speziell zu beachten, dass die ionische Zusammensetzung der extrazellulären Flüssigkeit (ECF) nicht das gleiche ist wie die der CSF, wie wir 2004 in einem detaillierten Untersuchung des Hippocampus ECF 6 zeigte. Am Tag des Tests, Rinderserumalbumin (BSA) bei 2% Gewicht / Gewicht hinzugefügt und vollständig aufgelöst, dies verringert den Verlust von Peptiden wie Insulin aus Einhaltung des Schlauchs, und verringert auch die Gefahr einer Fluidverlust (Ultrafiltration) an der Sonde Membran. Nach Herstellung sollte das Perfusat durch einen 0,2 um Filter filtriert werden.
  2. Wenn eine Behandlung wie Insulin ist an dem Büstenhalter geliefert werdenin der Region von Interesse (hier der Hippocampus), bereiten diese Behandlung mit einem aliquoten Teil der vorbereiteten AECF mit dem entsprechenden Wirkstoffkonzentration. Für Insulin wurde eine Konzentration von 400 nM (66,7 μU / ul) für die Lieferung per Reverse Mikrodialyse wurde gezeigt, dass Hippocampus metabolischen und kognitive Funktion 7 beeinflussen. Beachten Sie, dass die resultierende Gewebe Konzentration von Insulin wird hier nicht gemessen und bleibt unbekannt.
  3. Einrichten mD-Sonde und Linien. Bereiten Sie einen frischen Mikrodialysesonde und Linie der Tag vor der Prüfung. Erstellen Sie zwei getrennte Leitungen für "Zufluss" und "Abfluss". Verwenden PE50 Schlauch an zwei 1 Meter langen Stücken der FEP-Schlauch verbinden und sicherstellen, dass es eine minimale Totraum zwischen den Zeilen. Verbinden der Zuflussrohr in eine 1 ml Hamilton-Spritze mit sterilfiltriertem, entionisiertem H 2 0 (dH 2 0) gefüllt ist, und dann Befestigen der Sonde.
  4. Microdialysis Drehgelenk. Um kostenlos tierischen Bewegung zu ermöglichen, während die Messungen, verbinden eine Flüssigkeit schwenken, um die inflow und Abflussleitungen, die Pumpe zu schließen, unter Verwendung zusätzlicher FEP-Schlauch. Denken Sie daran, das innere Volumen des Schwenk-und Schlauch berücksichtigen bei der Prüfung Zeitpunkt der Probenentnahme (unten).
  5. Einrichten mD Pumpe. Schalten Sie den mD Pumpe und laufen mit 1,5 ul / min bis dH 2 0 Verlassen des Abflussrohr an der Sonde zu sehen. Dann wird, während die Pumpe ausgeschaltet ist, das andere zwischen dem Abflußrohr und einem Probensammelröhrchen. Führen Sie 5 ml durch das Rohr und legen Sie die Sonde in einem Fläschchen mit sterilem dH 2 0 Nacht; sicherzustellen, dass die Sondenspitze bleibt immer nass.
  6. Pre-Probing Testperson. 24 Stunden vor dem Test, entfernen Sie die Dummy-Stilett aus der Ratte den Kopf und legen Sie eine mD-Sonde (nur für diesen Zweck verwendet und nicht für die Probenahme) für 10 min. Dann ersetzen Sie den Dummy Mandrin und legte die Ratte zurück in seinen Käfig. Dieses Verfahren wurde entwickelt, um eine Wirkung der reaktiven Gliose am Testtag 8 und in unseren Händen zu minimieren, gibt dieser guten Results passend Daten anderer Techniken und erscheinen an hippocampale Aktivierung 2,5,7,9 reflektieren, andere haben einen ähnlichen Ansatz, der die Sonde verlässt anstelle für 24 h vor der Messung, was ebenfalls eine gute Ansatz verwendet werden, wenn eine Beschädigung der Sonde über Nacht vermieden werden können.
  7. Sonde Äquilibrierung. Am Tag der Mikrodialyse, füllen die Hamilton-Spritze und Szintillationsfläschchen AECF mit gefilterter und pumpen bis 1 Stunde lang äquilibrieren. Wenn nötig, füllen Sie ein zweites Hamilton-Spritze mit vorbereiteten Behandlung (z. B. Insulin-AECF) und Ort in die Spritzenpumpe.
  8. Einführen der Sonde. Wenn Äquilibrierung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Dummy-Stilett und schieben Sie die äquilibriert mD Sonde in der Ratte Gehirn über die Kanüle. Legen Sie die Ratte in einem durchsichtigen Kunststoff-Box, die einige der Ratten zu Hause Betten enthält. Achten Sie darauf, um ein Gegengewicht zur Schlauch: legen Sie eine 1,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit Wasser auf die Schläuche gefüllt außerhalb des Käfigs in einer Weise, dass die Schwerkraft die microdi hältalysis Linien unkinked aber nicht straff. Lassen Sonde in Ratten für 2 Stunden äquilibrieren. Zu Beginn dieser Periode, bestätigen, dass die Strömung des Perfusat freigegeben: Dies lässt sich am einfachsten durch das Sammeln von Perfusat Abfluss über einen definierten Zeitraum und Wiegen der Probe, um zu bestätigen, dass die erwartete Volumen wird aus dem System gemacht. Jede Sonde, dass die Renditen <90% des erwarteten Volumen und nicht selbst korrigieren nach dem Entfernen und Wiedereinsetzen sollte ersetzt werden (sonst Ödeme an der Sondenspitze resultieren). Wenn Flow ist anhaltend niedrigen oder nicht vorhanden, alle Verbindungen auf Leckagen; ersatzweise Schlauchadapter in Stufen zu sehen, ob die Blockade isoliert werden kann. Wenn das Problem nicht erkannt wird, ersetzen Sie die Sonde, wenn das Problem nicht beheben lässt, kann es notwendig sein, erneut mit neuen Sonde und Linien aus Abschnitt 3.3 zu starten. Die zweistündige Äquilibrierungsperiode ermöglicht die Blut-Hirn-Schranke um die Sonde verschließen und vermeiden Sie jegliche akute Wirkung von Einführen der Sonde.
  9. Sammeln von Proben. Sicherzustellen, dass die correlation zwischen Probe Dialyse (aus dem Gehirn) und Sammlung (in das Rohr) wird genau berechnet. Zum Beispiel werden unter Verwendung von zwei Metern von FEP Schlauch zwischen Drehgelenk und Sonde besteht ein Gesamtvolumen zwischen Sonde und Sammlung von 30 ul und daher dauert es 20 min bei 1,5 ul / min Flussrate für Probe, um durch die Sonde, Schläuche, Verbinder passieren und schwenken um das Ende der Verrohrung zum Einzug gelangen. Beim Sammeln von Proben sicherzustellen, dass Sie genügend Volumen, um notwendige Konzentration für Ihre Tests haben zu sammeln. Hier verwenden wir 5 min Probe bins, und so sammelt 7,5 ul von Dialysat in jedem Sammelrohr.
  10. Baseline-Proben. Nach Äquilibrierung abgeschlossen ist, beginnen Probenentnahme. Sammle mindestens drei Proben, während die Ratte in Ruhe zu Hause Kammer, um eine stabile Basislinie von Messungen zu etablieren
  11. Behandlung Timing. Achten Sie darauf, erforderliche Timing für Einleitung der Behandlung vor dem Experiment zu berechnen: erinnern, dass genauso wie es eine zeitliche Verzögerung zwischen der Dialyseund Probenentnahme, gibt es eine Verzögerung (normalerweise identischen) zwischen Perfusat Verlassen der Spritze und Ankunft an dem Tier Hippocampus. Daher wird in unserer Einrichtung mit einem 30 ul Volumen zwischen Spritze und Sonde, ändern Sie die Spritze an diesem mit Behandlungs-Perfusat 20 min, bevor Sie die Behandlung beginnen bei der Ankunft am Hippocampus wollen.
  12. Ändern Spritzen. Ein flüssiges Schalter kann verwendet werden, wenn gewünscht, aber nicht notwendig ist: zum richtigen Zeitpunkt, ziehen Sie einfach die Zuleitung von der Steuerung-Perfusat Spritze und schnell auf die Behandlung-Perfusat Spritze zu verbinden. Dies sollte nicht länger als 5 Sekunden zu erheblichen Unterbrechung der Perfusat Flow zu vermeiden. HINWEIS, dass dieser Prozess umgekehrt werden, nachdem die gewünschte Dosierung geliefert wurde, wenn eine zeitlich begrenzte Bereitstellung von Behandlung gewünscht werden. Alternativ kann die Behandlung für die Dauer der Probenahme fortzusetzen (siehe Abbildung 2). Luftblasen sollten nicht in die Leitung beim Schalten eingeführt werdenSpritzen, wie es auf der Dialysemembran ansammeln und zu reduzieren Sonde Effizienz.
  13. Verhaltenstests. Wenn Durchführung einer Verhaltenstherapie Aufgabe, folgen dieser Verfahren (siehe Abschnitt 4). Hinweis, dass die Koordination mit der Lieferung der Behandlung mit dem Hippocampus wichtig ist. Zum Beispiel sollte Abgabe von Insulin zeitgesteuerte bis 10 min vor dem Beginn testing 10 auftreten. Daher sollte die Umstellung auf eine Insulin-haltigen Perfusat auftreten 30 min vor Verhaltenstests (20 min zum Perfusat durch die Leitungen plus 10 min vorbei gewünschte Lieferzeit vor der Prüfung).
  14. Fertigstellung der Probennahme. Nach dem Sammeln der gewünschten Proben, entfernen Sie die Sonde aus dem Kopf des Tieres, wieder daran zu denken, berücksichtigt Zeitverzögerung zwischen Dialyse und Probenentnahme zu nehmen. Bringen Sie das Tier in seinen eigenen Käfig und genau beobachten für jede post-experimentellen Änderung Gesundheitszustand oder Verhalten, bis das Tier getötet und das Gehirn entfernt zur Bestätigung der korrektenAufsetzen der Sonde. Wenn Opfer nicht sofort auftreten, schicken Sie das Dummy-Stilett an der Kanüle, um jegliches Einbringen von Fremdmaterial zu vermeiden.
  15. Analyse. Die analytische Methodik wird variieren abhängig von der Analyt (en) von Interesse. Da Dialyse Probenahme keine vollständige Analyten Äquilibrierung bei der Sonde Membran zu ermöglichen, sollten Probenkonzentrationen korrigiert ECF Konzentrationen mit der Null-net-flux-Methode 11,12 geben.

4. Behavioral Testing

  1. Platzierung auf Labyrinth. Nach der Baseline-Proben (dh nach mindestens drei Proben Dialyse abgeschlossen haben, kann jedoch noch in Ausströmrichtung Schlauch gesammelt werden), sanft bewegen die Ratte in das Verhaltenstests Vorrichtung. Jede entsprechende Aufgabe verwendet werden, die Daten in Abbildung 1 wurden unter Verwendung eines vierarmigen plus-förmigen Labyrinths und Messen spontaner Wechsel, die ein Maß für räumliche Arbeitsspeicher ist: die Ratte wird zunächst im Jhs platziertter des Labyrinths und ungehindert 9,13 erkunden. Da jede Verhaltenstest verwendet werden kann, ist der Schwerpunkt dieses Protokoll nicht auf die spezifische Aufgabe, hier als Beispiel (die anderswo 9,14,15 detailliert), aber in Kürze verwendet werden, sind Tiere gestattet, um das Labyrinth zu erkunden (die Zeit der das graue Feld in Abbildung 1) und verwenden hippocampally-abhängige Prozesse in den Speicher, von denen Armen halten wurden vor kurzem besucht.
  2. Dialyseschlauch Bewegung während des Tests. Halten des Schlauchs, so daß er sich frei bewegt, weder behindert der Ratte Bewegung noch zugelassen wird, um vor dem Tier zu bewegen und es abzulenken. Bleiben Sie an Ort und Stelle und minimieren Sie Ihre eigene Bewegung, so dass Sie nicht beeinflussen der Ratte Verhalten.
  3. Fortsetzung Probenentnahme. Als während der Baseline, bewegen Sie den Abfluss Schlauch an ein neues Sammelgefäß alle 5 min.
  4. Alternation Test. Lassen Sie das Tier frei erkunden das Labyrinth für 20 min. Notieren Sie sich die Reihenfolge und den Zeitpunkt des Arms Einträge entweder übereine Videoaufzeichnung oder von Hand für die spätere Aufgabe Performance-Analyse 9,15.

5. Post-Tests

  1. Endprobe Sammlung. Nach der Prüfung, entfernen rat sanft von Labyrinth und Rückkehr zur Kammer zu steuern. Weiter Mikrodialyse Probenentnahme für mindestens vier Proben, um die Zeit der Erholung von Aufgabenerfüllung zu decken.
  2. Sondenentnahme. Nachdem alle Proben gesammelt wurden, entfernen Sie die Sonde aus dem Kopf des Tieres und in einen Speicher Fläschchen; wieder das Tier in das Haus Käfig.
  3. Probe Lagerung. Nach der Rückkehr Tier zum eigenen Käfig und Abschluss-Sammlung jeder verbleibenden Dialysat, spülen Sie die Sonde gründlich mit dH 2 0 und an einem Szintillationsfläschchen mit dH 2 0 gefüllt und mit Parafilm. Spülen des Schlauchs durch die Umstellung auf eine Spritze mit einer Lösung von 1:10.000 Kathon in dH 2 0 bis Mikrobenwachstum zu verhindern. Sonden können so lange wiederverwendet werden, da sie gute Fließeigenschaften und aufrechtzuerhalten habenkeine Schäden an der Membran; mit Sorgfalt dieser sollte routinemäßig in mehr als zehn Anwendungen sein.
  4. Histologie. Töten das Tier und entfernen das Gehirn. Slice auf einem Kryostaten und verwenden Standard-histologischen Techniken (zB Cresylviolett Färbung), um die korrekte Aufsetzen der Sonde zu bestätigen.

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Representative Results

Ratten sollte rasch erholen sich von der Operation und wachsam sein, beweglich und aktiv innerhalb von 30 min nach Beendigung der Narkose. Die Auswirkungen der Kanülenkappe sollte minimal sein, wenn die Operation durchgeführt wird sauber und minimalen Dentalzement verwendet wird. Wenn Anzeichen einer Infektion während der postoperativen Überwachung aufgefallen ist, oder die Ratte ist in keiner Weise zeigt Anzeichen von Leiden oder Beschwerden, sofort beenden das Experiment, das sollte extrem selten. Bei der Handhabung vor der Prüfung sollten die Tiere wachsam sein, frei beweglich, freundlich und neugierig. Gut gehandhabt Tiere sollten im wesentlichen keinen beobachtbaren verbleibender Spannung von der Operation, post-chirurgischen Wiederherstellung oder der Anwesenheit des Experimentator, dies bestätigt werden kann, wenn durch Messung von Plasma Stresshormone wünschen übrig (Epinephrin, Glucocorticoide) und / oder Glucose 2,4 , 5.

Gehirn ECF Glucose ist typischerweise im Bereich von 0,5 - 1,5 mm, durch Variieren Gehirnregion, obwohl höhere Wertekann bei diabetischen Tieren gesehen werden; im Hippocampus sind die Grundlinien Glukosekonzentrationen auf die enge Größenordnung von 1,25 mM 6,12. In Ermangelung einer exogenen Behandlung sollte ein Bad im ECF Glukose (und allgemein ein Anstieg der ECF Laktat) gesehen, während der Aufgabenausführung werden, in Hirnregionen bei der Vermittlung dieser Aufgabe (siehe Abbildung 1 zum Beispiel) beteiligt: ​​dies spiegelt die erhöhte Stoffwechselaktivität durch die kognitive Belastung 9,14,16 induziert. Ähnliche Veränderungen kann als Anzeichen dafür, dass eine bestimmte Behandlung lokalen Stoffwechsel, wie etwa nach akuter Gabe von Insulin durch Zugabe zum Perfusat 7 (Abbildung 2) gesehen zunimmt eingenommen werden.

Im Allgemeinen sollte ein gut Griffen Tier Verhaltenstests ohne Anzeichen von Stress und ohne Anzeichen von Bewusstsein für die Mikrodialyse Schlauch durchführen: Anzeichen für übermäßiges Putzen, Immobilität, Angabe von Schmerzen oder Versuche des Tieres, um die Sonde zu entfernen anzuzeigenwahrscheinlich unzureichende Handhabung und / oder Infektion um die Sonde vor Ort, und sollte als Indiz, dieses Experiment zu beenden genommen werden.

Tiere, die Verabreichung von Insulin sollte, zusätzlich zu erhöhten hippocampalen Stoffwechsel, zeigen deutlich verbesserte räumliche Speicher 7. Control, sollten auch unbehandelte Tiere haben mittlere Wechsel Leistung auf dem 4-Arm Labyrinth von zwischen 65 und 75% 7,9,14.

Abbildung 1
Abbildung 1. Task-verbundenen Sprung in Hippocampus ECF Glukose (aus 9). Grey-Box ist die Zeit des Labyrinths Tests auf spontane Wechsel (SA). Lila Linie zeigt Hippocampus Glukose bei Tieren ohne Labyrinth-Tests (aber wer sich anderweitig gehandhabt identisch). Rote Linie ist Messungen bei Tieren Durchführung der 4-Arm SA Aufgabe; orange Linie zeigt Messungen bei Tieren Durchführung der leichter3-Arm-Version von SA.

Abbildung 2
Abbildung 2. Veränderungen im Hippocampus Glukose und Laktat nach der Verabreichung von Insulin über die Aufnahme in das Perfusat (aus 7). Insulin erreicht den Hippocampus an der Stelle durch den Pfeil angedeutet und wird danach kontinuierlich verabreicht. Die Tiere wurden in ihre Käfige getestet, ohne Verhaltensänderungen Manipulation.

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Discussion

Alle Lösungen in Mikrodialyse verwendet sollte sofort filtriert werden vor der Verwendung mit einem 0,2 um Filter. Nach dem Einführen der Sonde in die Führungskanüle, beobachten zu bestätigen, dass Strömung ungehindert und Probensammelvorrichtung auftritt. Wenn der Durchfluss stoppt nach dem Einsetzen ist die wahrscheinlichste Ursache Beschädigung der Sonde Membran durch unzureichende Pflege beim Einsetzen verursacht, und ein frischer Sonde muss ersetzt werden.

Wie oben erwähnt, ein wichtiger Vorteil dieser Methoden der Mangel an verwechseln ist, ermöglicht sowohl Verhaltens-und neurochemische Maßnahmen wach, frei beweglichen Tieren: Um diesen Vorteil zu nutzen, ist umfangreich Handhabung vor dem Test, um wichtig, dass das Tier während der unbelasteten werden Messungen. Die Äquilibrierung beträgt in der Regel ausreichend, um eine stabile metabolische Baseline bieten, aber Essen kann für 1-2 Stunden entfernt werden, bevor die Prüfung, wenn gewünscht, um einheitliche Blutzuckerspiegel über Tiere zu gewährleisten.

The beiden höchstwertigen Grenzen mD als Abtasttechnik sind (i) eingeschränkt Größe des Analyten und (ii) Potential für den Verlust der Analyt durch Adhäsion in dem Rohrstrang. Ersteres kann zu einem gewissen Grad durch die Verwendung von Sonden mit mD großer Molekulargewichtsgrenze gelindert werden. Typische kommerzielle Sonden ermöglichen Cutoffs von bis zu 100 kD, so dass Moleküle von bis zu vielleicht 50 kD wird durch relativ ungehindert passieren, aber der untere Grenzfrequenz Membranen wird empfohlen, soweit möglich, jede Probe Verlust durch Ultrafiltration an der Sondenspitze zu minimieren. Adhäsion der Zielmoleküle an der Rohrleitung ist ein Problem vor allem in den Fällen von Peptid-Messungen, von denen viele neigen zum Kleben an Schläuchen FEP und reduzieren damit sowohl Analytwiederfindung und Messgenauigkeit wird. : Dieses Problem kann durch (i) Vorbehandlung des Inneren des Schlauchs unter Verwendung eines zu dem Perfusat 2% Rinderserumalbumin zugesetzt wurde, als ein hemmendes Agens, und (ii) durch die Minimierung der Länge des Rückleitungs-Rohrmaterial minimiert werden wenn neEDED kann eine leichte Sammelgefäß Nähe des Abflusses von der Sonde angebracht werden, obwohl dies wirft zusätzliche Probleme bei der Umstellung Sammelröhrchen ohne Störung des Tieres, insbesondere während Verhaltenstests. Ein Vorteil dieser Technik ist, dass die Proben in einer Form frei von Zelltrümmern oder große Moleküle wie Enzyme erhalten werden, und eignen sich generell zum direkten Analyse mittels Injektion in HPLC, MS oder andere analytische Maschinen Ist-ohne weitere Reinigung , dies ermöglicht auch in vielen Fällen die Analyse von mehreren Analyten in jeder Probe (wie die Glucose und Lactat-Messungen in Figur 2 gezeigt).

Eine Variation der Verwendung von Reverse Mikrodialyse zur pharmakologischen Behandlungen liefern, ist Dual-Mikroinjektion-Mikrodialysesonden, erhältlich von mehreren Quellen zu verwenden. Allerdings ist die Bohrung der Injektionsöffnung im Allgemeinen sehr schmal und neigen zum Verstopfen, und es kann schwierig sein, genaudas Timing und / oder das Volumen der Behandlung Lieferung. Diese Alternative ist deshalb nur für Behandlungen, die nicht zugänglich sind Abgabe über die Aufnahme in das Perfusat empfohlen.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch die NIH / NIDDK (DK077106 ECM) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

The majority of reagents are standard laboratory grade and can be obtained from a supplier of choice. Similarly, equipment such as syringe pumps and tubing can be used from any of several manufacturers. Specific items used here for which details are important include:

CMA 12 microdialysis probes CMA/ Microdialysis CMA-12-XXX These are available in various membrane lengths and cutoffs, indicated by specific codes in the 'XXX.'
Human insulin (Humulin) Eli Lilly N/a
Liquid swivel Instech 375/D/22QM This specific swivel has very low torque and internal volume, as well as a nonreactive quartz lining.

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References

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Hippocampus Insulin Mikroinjektion und<em&gt; In vivo</em&gt; Microdialysis Während Spatial Memory Testing
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McNay, E. C., Sandusky, L. A., Pearson-Leary, J. Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing. J. Vis. Exp. (71), e4451, doi:10.3791/4451 (2013).More

McNay, E. C., Sandusky, L. A., Pearson-Leary, J. Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing. J. Vis. Exp. (71), e4451, doi:10.3791/4451 (2013).

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