Summary
Vi beskriver en værdifuld diagnostisk test, der potentielt kan bruges til at afgøre tilbagetrækning af immunosuppression efter transplantation uden forhøjet risiko for afstødning. Analysen anvender principperne for forsinket type Overfølsomhed og giver præcis vurdering af såvel donor specifikke effektor og lovgivningsmæssige immunreaktioner monteres ved modtagerne.
Abstract
Forsinket hypersensitivitet reaktion (DTH) er en hurtig in vivo manifestation af T-celle-afhængig immunrespons mod et fremmed antigen (Ag), at værtens immunsystem har oplevet i den seneste tid. DTH reaktioner er ofte opdelt i en sensibilisering fase, med henvisning til den oprindelige antigen oplevelse og en udfordring fase, som normalt følger flere dage efter sensibilisering. Manglen på en forsinket hypersensitivitet reaktion på en tilbagekaldelse Ag demonstreret ved hudtest er ofte betragtes som et bevis på anergy. Den traditionelle DTH assay er blevet anvendt effektivt til at diagnosticere mange mikrobielle infektioner.
Trods deling lignende immune funktioner såsom lymfocytinfiltrering, ødem og vævsnekrose, er den direkte DTH ikke et muligt diagnostisk teknik i transplanterede patienter på grund af muligheden for direkte indsprøjtning resulterer i sensibilisering til donor-antigener og graft tab. For at undgå dette problem, brummenen-til-mus "trans-vivo"-DTH-assay blev udviklet 1,2. Denne test er primært en overførsel DTH assay, hvor humane perifere mononukleære blodceller (PBMC'er) og specifikke antigener blev injiceret subkutant i pinnae eller trædepuden af en naiv mus og DTH-lignende hævelse måles efter 18-24 timer 3.. Det antigen præsentation af menneskelige antigenpræsenterende celler, såsom makrofager eller DCS-til T-celler i meget vaskulær musevæv udløser inflammatoriske kaskade og tiltrækker mus immunceller resulterer i hævelse svar. Svaret er antigen-specifikke og kræver forudgående antigen sensibilisering. En positiv donor-reaktivt DTH respons i Tv-DTH assay afspejler, at transplantation patienten har udviklet en pro-inflammatoriske immune disposition mod graft alloantigener.
Det vigtigste træk ved dette assay er, at det også kan anvendes til at detektere regulatoriske T-celler, der forårsager bystander-suppression. Bystander-suppression af etDTH recall reaktion i overværelse af donor-antigen er karakteristisk for transplanterede patienter med accepterede allotransplantater 2,4-14. Overvågningen af transplanterede patienter til alloreactivity og regulering af TV-DTH kan identificere en undergruppe af patienter, der kunne drage fordel af reduktionen af immunosuppression uden forhøjet risiko for afvisning eller forringet nyrefunktion.
Et lovende område er anvendelsen af Tv-DTH assay i overvågningen af autoimmunitet 15,16 og også i tumorimmunologi 17..
Protocol
1.. Fremstilling af lymfocytter
- Indsaml blod ind ACD (Acid Citrate Dextrose) rør.
- Isolere PBMC fra frisk humant perifert blod ved hjælp lymfocytseparationsmedium ifølge standardmetoder.
- Vask PBMC tre gange med PBS for at fjerne kontaminerende blodplader. Blodplader blev fundet at interferere med trans-vivo DTH assay. Maksimal tilladte blodplade kontaminering af PBMC præparat er ≤ 1x10 7 / injektion.
- Hvis der er en mærkbar røde blodlegemer kontaminering udføre lyse af røde blodlegemer ved hjælp ACK lysepuffer efter første vask. Fjern ACK buffer ved vask 2 gange med PBS.
2.. Fremstilling af alloantigen
- Isoler PBMC fra donoren perifert blod ved hjælp af fremgangsmåden vist ovenfor.
- Resuspender donor PBMC i PBS ved en koncentration på 120x10 6 celler / ml (4x10 6 celler / 30 ul).
- Tilsæt 1 uM PMSF til blandingen for at forhindre proteinnedbrydning.
- Sonikeres cellesuspensionen hjælp syv 1 sekund impulser med en 2 mm-sonde sonikator. (Bemærk: Opbevar materialet koldt og undgå for store bobler Hvis skumdannelse opstår, så lad cellesuspensionen sidde på is i en 2-3 min.).
- Verificere afbrydelse af> 90% af cellerne under anvendelse af et hæmocytometer.
- Centrifugeres blandingen ved 14.000 rpm ved 4 ° C i 20 min i nedkølet mikrocentrifuge.
- Overfør supernatanten til en ny 2,0 ml sikker lås rør og bestemme proteinkoncentration.
3.. Cell Forberedelse til injektion
- For hver injektion portion 7x10 6 PBMC i 2,0 ml safe-lock rør.
- Centrifuger ved 6.000 rpm i et minut i mikrofuge og fjern supernatanten.
- Cellerne i PBS med eller uden antigener. Juster injektionsvolumen til 35 pi med PBS. Følgende skema anvendes til injektioner:
Negativ kontrol: PBMC + PBS
Positiv kontrol: PBMC + TT / DT (25 & muG / injektion)
Eksperimentel antigenspecifik reaktion: PBMC + test Ag (4-8 mg / injektion)
Eksperimentel antigenspecifik forordning: PBMC + test Ag + TT / DT
4.. Pre-måling, injektion, og Post-måling
- Bedøve CB17 SCID mus med isofluran. Mål bageste trædepudetykkelse ved hjælp af en fjederbelastet skydelære. Put skydelære i centrum af trædepuden, med den ene kant rører den sidste walking fodpude, at tilvejebringe en benchmark at holde målestedet konsekvent. Trædepudetykkelse registreres, når gauge aflæsningen er stabil.
- Langsomt injicere cellesuspensioner subkutant ind i footpads af mus ved hjælp af ½ cc insulininjektionssprøjter med 28-gauge nål. Udfør injektion med nålen pegende mod tæerne, og facet opad. (Bemærk: sørg for at der ikke er nogen lækager).
- 18-24 timer efter injektion, bedøver mus med isofluran og gentag måling af trædepuden hævelse.
- Subtrhandle tykkelsen af hver trædepude inden injektion fra postinjektionspositionen værdi for at få den trædepuden hævelse værdi udtrykker dataene i enheder af 10 -4 inches. Beregn antigenspecifikke netto hævelse ved at trække kontrol trædepude hævelse (PBMC + PBS) fra trædepuden hævelse værdier opnået fra de behandlinger (PBMC + donor alloantigen, TT / DT, eller donor alloantigen + TT / DT). En positiv kontrol reaktion at huske antigen TT / DT ≥ 25x10 -4 inches mere end baggrunden respons på PBS er nødvendig for at testen kan anses for gyldig.
- Bestem hæmning tilbagetrækningsprocedurerne reaktioner i nærvær af donor-antigener ved at sammenligne den netto hævelse af hver injektion ved hjælp af følgende formel:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1.. Evaluering af nyretransplanterede patienter til donor-antigen-specifikke reaktion ved hjælp Tv-DTH assay
For at teste donor-reaktivt cellulær immunitet i nyretransplanterede patienter, vi injicerede PBMC fra disse patienter med donor-antigener alene eller med en recall antigen tetanustoksoid (TT). Som en positiv kontrol celler blev injiceret med TT alene. Vi observerer tre mønstre af forsinket hypersensibilitet i transplanterede patienter (figur 1). Alle patienter reagerede kraftigt på Recall Ag (TT). Patient # 62 viser den regulatoriske mønster, kendetegnet ved et svagt respons på donor-antigen og en markant forbundet undertrykkelse (67%) at tilbagekalde antigen reaktion i nærvær af donor-antigen. Dette er det mønster, som er blevet fundet at være forbundet med orgel allograft tolerance. Patient # 48 udviser en nonregulatory mønster, som har den indslag af en svag reaktion på donor, men ingen tilknyttet suppression (eller linket undertrykkelse <50%). Detopskrift er observeret hyppigere i patienter, der tager immunsuppressive lægemidler. Dog kan nogle patienter stadig modtager efter transplantationen immunosuppressive lægemiddel vise donor antigen-linked undertrykkelse af deres DTH respons. Patient nr. 8 udstiller donor-sensibiliserede mønster, som er kendetegnet ved en høj respons på donor-antigen, og ingen tilknytning undertrykkelse. Denne reaktion er forbundet med graftafstødning i kliniske casestudier 8..
2.. Rolle donor regulering i klinisk monitorering i nyretransplantation
PBMC fra fag indskrevet i ITN507ST observationelle forsøg blev ("Identifikation og Mekanismedata Undersøgelser af Tolerant nyretransplantationspatienter") testet for donor-specifikke indirekte pathway T effektor og T regulatoriske reaktioner ved hjælp af TV-DTH assay og donor (eller donor HLA- matchede surrogat) antigen. Som vist i figur 2A, indirekte vej T effektor reaktioner på donor-antigener afsløreren tydelig spektrum tværs af indskrivning grupper trædepude hævelse stiger patienternes kliniske status spænder fra dem, der er tolerante over for dem, der er kronisk afvise. PBMCer fra tolerante modtagere induceret reduceret eller ingen DTH responser mens PBMCer afstøder enkeltpersoner udløste kraftige hævelser.
Målingen af anti-donor indirekte vej T lovgivningsmæssige initiativer af den tilknyttede undertrykkelse viste assay, at immun forordning var en vigtig mekanisme til nyreallografttransplantation accept. 2b viser et fald i regulatoriske reaktioner over området fleste (Tol) gennem mellemprodukt (Mono og SI) til mindst tolerante (CR) patienter 14..
3.. Overvågning af autoimmunitet hjælp Tv-DTH assay
Et lovende område er anvendelsen af Tv-DTH assay i overvågningen af autoimmunitet. BIM, en proces af fibro-obliterativ okklusion af de små luftveje itransplanteret lunge, er den mest almindelige årsag til lungetransplantation fiasko.
Ved at teste rollen af cellemedieret immunitet til collagen type V i denne proces, fandt vi, at den højeste relative risiko for bronchiolitis obliterans syndromet (BIM) udvikling blev observeret hos patienter, som udviklede en positiv Tv-DTH reaktion på collagen type V i deres perifert blod.
Figur 3 viser, at PBMCer fra lungetransplantation modtagere, men ikke fra raske kontroller eller collagen IV-reaktivt Goodpastures syndrom patienter efter nyretransplantation, var ofte kollagen V reaktiv 15..
4.. Anvendelse i tumor immunologi
Trans-vivo DTH åbner nye muligheder i kræftforskning til at prioritere patienter med prostatacancer for vaccination terapi. Da regulatoriske T celler spiller vigtige roller i udviklingen af kræft og progression, vi brugte Tv-DTH at teste reaktiviteten af PBMCs fra kræftpatienter behandlet med en DNA-vaccine der koder prostatasyrephosphatase (PAP). Vi brugte bystander-suppression af respons på recall antigen for at bestemme, om antigen-specifikke regulatoriske aktiviteter bliver fremkaldt som respons på vaccination. Vi fandt, at PAP-specifikke regulatoriske T-celler opstår spontant i nogle patienter med prostatakræft, opretholdes under immunisering og forhindrer påvisning af PAP-specifikke effektor responser efter immunisering. Hos nogle patienter vi identificeret PAP-specifikke regulerede T-celle responser før immunisering. Præ-eksisterende regulatoriske T-celler er specifikke for PAP, kan være forbundet med manglende evne til at udvikle antigen-specifik Th1-typen immunresponser efter vaccination. Alternativt kan allerede eksisterende regulatoriske T-celle respons på PAP vil identificere patienter sandsynlighed for at udvikle effektor reaktioner efter gentagne immunisering. Enten måde, denne analyse giver en vigtig observation, da det måske foreslå et middel til at prioritere eller udelukke individual patienter fra antigenspecifik vaccine evaluering 17.
Figur 1. Eksempler de tre vigtigste mønstre af forsinket type hypersensitivitet (DTH) fundet i nyretransplanterede patienter. Patient PBMC'er blev injiceret ind i footpads af CB17 SCID-mus med enten recall antigen (TT), donor-antigener eller med både donor + recall antigen. Show er netto hævelse respons over baggrunden.
Figur 2. . Indirekte vej T-celle analyse Emner indskrevet i fem grupper: enægget tvilling, klinisk tolerant (Tol), steroid monoterapi(Mono), standard immunosuppression (SI) og kronisk afstødning (CR) blev undersøgt for T effektor reaktioner (A) og T regulatoriske responser (B) ved Tv-DTH assay. Alle paneler: Individuelle resultater fra hvert emne (enkelte symboler) og gruppe median (vandret linje) med kvartiler vises. Signifikante forskelle mellem grupperne er vist, * p <0,05, ** p <0,01 og *** p <0,001, # p = 0,04, # # p = 0,03, # # # p = 0,008.
Figur 3. Måling af kollagen type V specifik autoimmunitet ved Tv-DTH assay. Tv-DTH reaktioner fra PBMCer opnået fra normale raske kontrolpersoner nyretransplanterede med GPS eller lungetransplantation modtagere. Alle 3 grupper haft positive reaktioner (≥ 25x10 -4 inches netto hævelse) at tilbagekalde antigen, Col (jegI), et fibrilar collagen specifikt for ledbrusk, fremkaldte ikke en Tv-DTH respons hos patienter eller kontroller. Nyretransplanterede recipienter med GPS havde forhøjet betyde hævelse reaktioner på Col (IV). Lungetransplantation modtagere reagerede ikke på Col (IV), men reagerede på Col (V).
Figur 4.. Brug af tv-DTH assay til at vurdere tumor induceret immunregulering. PBMC fra prostatacancerpatienter blev injiceret med prostatasyrephosphatase (PAP) alene eller med recall antigen TT / DT og som en kontrol prostata specifikt antigen (PSA) blev injiceret med eller uden recall antigen TT / DT. Injektion af PAP + TT / DT identificeret PAP antigenspecifikke regulatoriske celler, som co-administration af PSA ikke var i stand til at undertrykke en DTH reaktion på TT / DT recall antigen.
Figur 5. Reproducerbarhed af Tv-DTH assay. Kryopræserverede celler opnå ved leukapherese på 2007/01/15 blev optøet, vasket med PBS, blandet med PBS eller EBV eller P37-TE + EBV (selv peptid) eller P37-MA + EBV (donor peptid) og injiceret i trædepuder. Celler blev testet i følgende tidspunkter: 2008/07/29, 2010/02/23, 9/1/2011, 10/11/2011, 12/15/2011.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trans-vivo DTH-analysen er en ny diagnostisk test med en potentiel klinisk anvendelse ved vurderingen celle-medierede responser i transplantation, cancer og autoimmune patienter. Det er værdifuld, fordi det er ikke kun nyttige i overvågningen recall T effektor responser, men også det kan detektere T regulatoriske responser. En pålidelig måde at opdage menneskets DTH regulering kunne forudsige sikkerheden af immunosuppression tilbagetrækning hos patienter, der er kandidater til monoterapi eller tolerance forsøg.
Fjernsynet-DTH er meget følsom til at påvise indirekte vej for allorecognition af MHC. Men TV-DTH kan modificeres til at detektere direkte alloresponse mod intakte donor MHC-molekyler. At påvise donor antigen-linked undertrykkelse af DTH, kan EBV-LCL celler, der udtrykker enkelt donor HLA klasse I eller klasse II coinjiceret med patient PBMC. Når EBV-LCL blev anvendt som en kilde af antigen i DTH assay blev cellerne gamma-bestrålet med 10.000 rad, og 200.000 celler blev coinjiceret med PBMC i trædepuden af SCID-mus.
Under udviklingen af Tv-DTH finder vi, at flere forhold kan påvirke denne analyse. Det vigtigste er kravet til påvisning af bystander-suppression. Vi dokumenteret, at for at detektere inhibering af en tilbagekaldelse DTH reaktion på co-lokaliseret donor-antigen, både udfordringen stedet og immunokompetence af musen adoptiv vært er kritiske faktorer, der begrænser følsomheden af TV-DTH test. PBMC fra tolerante transplanterede patienter medieret bystander-suppression, når PBMC blev injiceret i trædepuderne, og ikke ører, og kun i immunsvækkede, ikke immunkompetente mus 3.
Ligesom alle analyser på Tv-DTH test har styrke og svagheder. De enorme fordele af TV-DTH assay omfatter følgende: 1) er meget følsom og kan detektere humane regulatoriske T-celler, 2) den opdager regulatoriske T-celler ved deres funktion ikke af tarving fænotype, 3) den detekterer både Th-1 og TH-17 effektor svar 4) rå cellelysater kan anvendes til at detektere regulering uden sensibiliserende patienterne til donor-antigen 5) dette assay viser høj reproducerbarhed / stabilitet (figur 5). Ulemperne er: 1) den kræver et relativt stort antal PBMC per injektion, 2) teknikken kræver omfattende uddannelse, navnlig i bystander-suppression assay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne af dette manuskript har ingen interessekonflikter til at videregive.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende bidragene fra AM VanBuskirk til udviklingen af vores forståelse af det regulerede DTH respons hos transplanterede patienter. Dette arbejde blev støttet NIH tilskud PO1AI084853 og R01AI066219-06, og af EU-sponsorerede One Study.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACD tube for blood collection | BD | 02-684-26 | |
| Lymphocyte Separation Medium | Cellgro | 25-072-CV | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Cellgro | 21-031-CM | Without calcium & magnesium |
| ACK Lysis Buffer | BioWhittaker | 10-548E | |
| TT/DT or EBV | Sanofi Pasteur Inc./ Meridian Life Science, Inc. | TT/DT 25 μg/injection EBV 8 μg/injection | |
| Protease inhibitor PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | |
| Eosine for cell count | Sigma-Aldrich | E-6003 | |
| Alloantigen | Purified HLA antigens, synthetic allopeptides can be used instead of donor cell-free lysates | ||
| 50 ml sterile centrifuge tubes | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| 10 ml pipettes and pipettor | BD Falcon | 13-675-20 | |
| 2 ml safe-lock tubes | Costar | 3213 | |
| 1000 μl, 100 μl , 10 μl pipettes with sterile tips | |||
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
| Full size centrifuge and microfuge | Beckman Coulter/Eppendorf | ||
| 1/2cc or 1cc insulin syringes | Becton Dickinson | 14-826-79 | 28 gauge |
| Vibracell sonicator | Divtech Equipment Co. Sonocs Materials Inc | 2 mm probe | |
| Dial thickness gauge | Mitutoyo, Japan | ||
| SCID mice | Harlan | ||
| Isoflurane | Piramal Healthcare | Inhalant anesthesia |
References
- Carrodeguas, L., et al. Trans vivo analysis of human delayed-type hypersensitivity reactivity. Hum. Immunol. 60, 640-651 (1999).
- VanBuskirk, A. M., et al. Human allograft acceptance is associated with immune regulation. J. Clin. Invest. 106, 145-155 (2000).
- Burlingham, W. J., Jankowska-Gan, E. Mouse strain and injection site are crucial for detecting linked suppression in transplant recipients by trans-vivo DTH assay. Am. J. Transplant. 7, 466-470 (2007).
- Burlingham, W. J., et al. Loss of tolerance to a maternal kidney transplant is selective for HLA class II: Evidence from trans-vivo DTH and alloantibody analysis. Human Immunology. 61, 1395-1402 (2000).
- Geissler, F., et al. Human liver allograft acceptance and the 'tolerance assay': In vitro anti-donor T cell assays show hyporeactivity to donor cells but, unlike DTH, fail to detect linked suppression. Transplantation. 72, 571-580 (2001).
- Jankowska-Gan, E., et al. Human liver allograft acceptance and the 'tolerance assay'. II. donor HLA-A, -B but not DR antigens are able to trigger regulation of DTH. Hum. Immunol. 63, 862 (2002).
- Minor H Antigen HA-1-specific Regulator and Effector CD8+ T Cells, and HA-1 Microchimerism, in Allograft Tolerance. J. Exp. Med. Cai, J., et al. 199, 1017-1023 (2004).
- Rodriguez, D. S., et al. Immune regulation and graft survival in kidney transplant recipients are both enhanced by human leukocyte antigen matching. Am. J. Transplant. 4, 537-543 (2004).
- Xu, Q., et al. Human CD4+CD25low adaptive T regulatory cells suppress delayed-type hypersensitivity during transplant tolerance. J. Immunol. 178, 3983-3995 (2007).
- Derks, R. A., Jankowska-Gan, E., Xu, Q., Burlingham, W. J. Dendritic cell type determines the mechanism of bystander suppression by adaptive T regulatory cells specific for the minor antigen HA-1. J. Immunol. 179, 3443-3451 (2007).
- Jankowska-Gan, E., et al. Successful reduction of immunosuppression in older renal transplant recipients who exhibit donor-specific regulation. Transplantation. 88, 533-541 (2009).
- Jankowska-Gan, E., et al. Pretransplant immune regulation predicts allograft outcome: bidirectional regulation correlates with excellent renal transplant function in living-related donor-recipient pairs. Transplantation. 93, 283-290 (2012).
- Knechtle, S. J., et al. Early and limited use of tacrolimus to avoid rejection in an alemtuzumab and sirolimus regimen for kidney transplantation: clinical results and immune monitoring. Am. J. Transplant. 9, 1087-1098 (2009).
- Haynes, L. D., et al. Donor-specific indirect pathway analysis reveals a B-cell-independent signature which reflects outcomes in kidney transplant recipients. Am. J. Transplant. 12, 640-648 (2012).
- Burlingham, W. J., et al. IL-17-dependent cellular immunity to collagen type V predisposes to obliterative bronchiolitis in human lung transplants. J. Clin. Invest. 117, 3498-3506 (2007).
- Bobadilla, J. L., et al. TH-17, Monokines, Collagen Type V, and Primary Graft Dysfunction in Lung Transplantation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 177 (6), (2008).
- Olson, B. M., et al. Human prostate tumor antigen-specific CD8+ regulatory T cells are inhibited by CTLA-4 or IL-35 blockade. J. Immunol. 189, 5590-5601 (2012).
