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Immunology and Infection

Trans-vivo Delayed Type Ipersensibilità Assay per Antigen regolamento specifico

Published: May 2, 2013 doi: 10.3791/4454

Summary

Descriviamo un test diagnostico prezioso che potrebbe potenzialmente essere utilizzato per decidere il ritiro di immunosoppressione dopo trapianto senza elevato rischio di rigetto del trapianto. Il test utilizza i principi di ipersensibilità di tipo ritardato e fornisce una valutazione accurata del donatore risposte immunitarie effettrici e normativi specifici montati dai destinatari.

Abstract

Risposta di ipersensibilità di tipo ritardato (DTH) è un rapido in manifestazione in vivo della risposta immunitaria delle cellule T-dipendente ad un antigene estraneo (Ag), che il sistema immunitario ospite ha sperimentato nel recente passato. Reazioni DTH sono spesso divisi in una fase di sensibilizzazione, riferendosi all'esperienza iniziale antigene, e una fase sfida, che segue solitamente parecchi giorni dopo la sensibilizzazione. La mancanza di una risposta di ipersensibilità di tipo ritardato per un richiamo Ag dimostrato da test cutaneo è spesso considerato come una prova di anergia. Il dosaggio DTH tradizionale è stato usato efficacemente nel diagnosticare infezioni microbiche molti.

Nonostante la condivisione funzioni immunitarie simili come infiltrazione linfocitaria, edema e necrosi tissutale, il DTH diretto non è una tecnica diagnostica fattibile in pazienti trapiantati causa della possibilità di iniezione diretta conseguente sensibilizzazione ad antigeni donatori e perdita del trapianto. Per evitare questo problema, il ronziouno-a-mouse "trans-vivo" test DTH è stato sviluppato 1,2. Questo test è essenzialmente un trasferimento di test DTH, in cui il sangue cellule umane mononucleate periferiche (PBMC) e gli antigeni specifici sono stati iniettati per via sottocutanea nei padiglioni auricolari o zampa di un topo ingenua e DTH-come gonfiore viene misurata dopo 18-24 ore 3. La presentazione dell'antigene da cellule presentanti l'antigene umano come i macrofagi o DCS a cellule T nei tessuti altamente vascolare del mouse attiva la cascata infiammatoria e attrae le cellule immunitarie del mouse con conseguente risposte gonfiore. La risposta è antigene-specifici e richiede preventiva antigene sensibilizzazione. Una risposta DTH donatore-reattiva positiva nel test Tv-DTH riflette che il paziente trapiantato ha sviluppato una disposizione immunitaria pro-infiammatoria verso alloantigeni innesto.

La caratteristica più importante di questo saggio è che può anche essere utilizzato per rilevare le cellule T regolatorie, che causano la soppressione astanti. Soppressione di un astanteDTH risposta richiamo alla presenza di antigeni del donatore è caratteristica di trapianto di rene-accettati 2,4-14. Il monitoraggio dei pazienti trapiantati per alloreattività e regolazione con Tv-DTH può identificare un sottogruppo di pazienti che potrebbero trarre beneficio dalla riduzione di immunosoppressione senza elevato rischio di rigetto o di deterioramento della funzione renale.

Un'area promettente è l'applicazione del saggio Tv-DTH nel monitoraggio di autoimmunità 15,16 e anche in immunologia tumorale 17.

Protocol

1. Preparazione di linfociti

  1. Prelevare il sangue in (acido citrato destrosio) tubi di ACD.
  2. Isolare PBMC da sangue periferico umano fresco utilizzando linfociti di separazione medio secondo metodi standard.
  3. Lavare le PBMC tre volte con PBS per rimuovere le piastrine contaminanti. Le piastrine sono risultati interferire con test DTH trans-vivo. Massima ammissibile di contaminazione delle piastrine di preparazione PBMC è ≤ 1x10 7 / iniezione.
  4. Se vi è una contaminazione del globulo rosso evidente, lisi dei globuli rossi utilizzando tampone di lisi ACK dopo primo lavaggio. Rimuovere il tampone ACK lavando due volte con PBS.

2. Preparazione di alloantigene

  1. Isolare PBMC dal sangue periferico del donatore utilizzando la procedura sopra riportata.
  2. Risospendere donatore PBMC in PBS ad una concentrazione di 120x10 6 cellule / ml (4x10 6 cellule / 30 microlitri).
  3. Aggiungere 1 mM PMSF alla miscela per impedire proteinedegradazione.
  4. Sonicare la sospensione cellulare con sette impulsi di 1 secondo con un mm-sonda Sonicatore 2. (Nota: Tenere il freddo materiale ed evitare bolle eccessive Se schiuma accade, lasciare la sospensione cellulare sedersi su ghiaccio per un 2-3 min.).
  5. Verificare l'interruzione del> 90% delle cellule utilizzando un emocitometro.
  6. Centrifugare la miscela a 14.000 rpm a 4 ° C per 20 min in microcentrifuga refrigerata.
  7. Trasferire il surnatante in una nuova provetta Safe-Lock 2.0 e determinare la concentrazione di proteine.

3. Preparazione delle cellule per preparazioni iniettabili

  1. Per ciascuna aliquota iniezione 7x10 6 PBMC in provette Safe-Lock da 2,0 ml.
  2. Centrifugare a 6000 rpm per un minuto in microcentrifuga e rimuovere il surnatante.
  3. Risospendere le cellule in PBS con o senza antigeni. Regolare il volume di iniezione di 35 ml con PBS. Il seguente schema è usato per le iniezioni:
    Controllo negativo: PBMC + PBS
    Controllo positivo: PBMC + TT / DT (25 & mu; G / iniezione)
    Sperimentale Antigen Specific Risposta: PBMC + test di Ag (4-8 mg / iniezione)
    Sperimentale Antigen regolamento specifico: PBMC + test di Ag + TT / DT

4. Pre-misura, iniezione e post-misurazione

  1. Anestetizzare CB17 SCID mouse con isoflurano. Misurare lo spessore zampa posteriore utilizzando una pinza a molla. Mettere pinza al centro del cuscinetto plantare, con un bordo di toccare l'ultimo pad camminata del piede, per fornire un punto di riferimento per mantenere il sito di misura costante. Spessore zampa è registrato quando manometro si è stabilizzata.
  2. Iniettare lentamente sospensioni cellulari per via sottocutanea nei cuscinetti plantari dei topi utilizzando ½ cc siringhe da insulina con ago 28-gauge. Eseguire l'iniezione con l'ago rivolto verso le dita dei piedi, e lo smusso rivolto verso l'alto. (Nota: assicurarsi che non ci siano perdite).
  3. 18-24 ore dopo l'iniezione, anestetizzare il mouse con la misura isoflurano e ripetizione della zampa gonfiore.
  4. Subtragire lo spessore di ogni zampa prima dell'iniezione dal valore dopo l'iniezione per ottenere il valore gonfiore zampa, esprime i dati in unità di 10 -4 pollici. Calcolare l'antigene-specifica gonfiore netta sottraendo il controllo footpad gonfiore (PBMC + PBS) dai valori gonfiore zampa ottenuti dai trattamenti (PBMC + donatore alloantigene, TT / DT, o donatore alloantigene + TT / DT). Una risposta positiva di controllo per richiamare l'antigene TT / DT di ≥ 25x10 pollici -4 oltre risposta di fondo a PBS è necessario per il test per essere considerato valido.
  5. Determinare l'inibizione di risposte di richiamo in presenza di antigeni donatori confrontando il gonfiore netto di ogni iniezione utilizzando la seguente formula:
    Equazione 1

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Representative Results

1. Valutazione del trapianto di rene per la risposta antigene-specifica donatore utilizzando test Tv-DTH

Per testare il donatore-reattiva immunità cellulare nel trapianto di rene abbiamo iniettato PBMC di questi pazienti con antigeni del donatore da soli o con un richiamo antigene tossoide tetanico (TT). Come i pozzetti di controllo positivo sono stati iniettati con sola TT. Osserviamo tre modelli principali di ipersensibilità di tipo ritardato nei pazienti trapiantati (Figura 1). Tutti i pazienti hanno risposto con forza a Recall Ag (TT). Paziente # 62 mostra lo schema normativo, caratterizzato da una risposta debole per donatore antigene e una soppressione collegato marcata (67%) per richiamare risposta antigene in presenza di antigene donatore. Questo è il modello che è stato trovato per essere associato con la tolleranza dell'organo trapiantato. Paziente # 48 mostre un modello nonregulatory, che ha la caratteristica di una debole risposta al donatore, ma non la soppressione collegato (o la soppressione legato <50%). Questomodello è stato frequentemente osservato in pazienti che assumono farmaci immunosoppressori. Tuttavia, alcuni pazienti continuano a ricevere dopo il trapianto farmaco immunosoppressivo possono visualizzare donatore soppressione antigene-linked della loro risposta DTH. Paziente # 8 mostre il modello donatore-sensibilizzate, caratterizzato da una elevata risposta ad antigeni del donatore e senza soppressione collegati. Questa risposta è associata con il rigetto in casi clinici 8.

2. Ruolo della regolamentazione donatore-specifica nel monitoraggio clinico nel trapianto renale

PBMC di soggetti arruolati nello studio ITN507ST osservazionale ("Identificazione e Indagini meccanicistica della tolleranti pazienti sottoposti a trapianto renale") sono stati testati per il donatore-specifica via indiretta T risposte regolamentari effettrici e T utilizzando il saggio Tv-DTH e donatore (o donatore HLA- surrogato abbinato) antigene. Come mostrato in Figura 2A, indiretti pathway T effettrici risposte agli antigeni donatori svelauna gamma distinta di tutti i gruppi di registrazione; aumenta gonfiore zampa come clinici gamme di stato del paziente da quelli che sono tolleranti a quelli che sono cronicamente rifiutando. PBMC provenienti da destinatari tolleranza indotta ridotti o non risposte DTH mentre PBMC di individui che respingono innescato forti reazioni gonfiore.

La misura di anti-donatore indiretto via T risposta normativa con il test di soppressione linked dimostrato che la regolazione immunitaria era un importante meccanismo per allotrapianto renale accettazione. Figura 2b mostra una diminuzione di risposte regolamentari sopra la gamma di più (Tol) attraverso intermedio (mono e SI) a meno tolleranti (CR) 14 pazienti.

3. Monitoraggio di autoimmunità mediante saggio Tv-DTH

Un settore promettente è l'applicazione del saggio Tv-DTH nel monitoraggio di autoimmunità. BOS, un processo di fibro-obliterativa occlusione delle piccole vie aeree nellapolmone trapiantato, è la causa più comune di insufficienza trapianto di polmone.

Testando il ruolo della immunità cellulo-mediata al collagene di tipo V, in questo processo, abbiamo scoperto che il più alto rischio relativo di bronchiolite obliterante sindrome (BOS), lo sviluppo è stato osservato in pazienti che hanno sviluppato una risposta Tv-DTH positivo per il collagene di tipo V nella loro sangue periferico.

La figura 3 mostra che PBMC dal trapianto polmonare, ma non da controlli sani o pazienti con sindrome di collagene IV-reattiva Goodpasture dopo trapianto renale, sono stati spesso collagene V reattivo 15.

4. Applicazione in immunologia tumorale

Trans-vivo DTH sta aprendo nuove prospettive nella ricerca sul cancro di dare priorità i malati di cancro alla prostata in terapia di vaccinazione. Dal momento che le cellule T regolatorie giocano un ruolo importante nello sviluppo e progressione del cancro, abbiamo usato Tv-DTH per testare la reattività dei PBMCs da pazienti con tumore trattati con un vaccino DNA codificante la fosfatasi acida prostatica (PAP). Abbiamo usato la soppressione astante di risposta a ricordare l'antigene per determinare se le attività di regolamentazione specifici di antigene vengono suscitato in risposta alla vaccinazione. Abbiamo scoperto che le cellule T regolatorie PAP-specifici sorgono spontaneamente in alcuni pazienti affetti da cancro alla prostata, persistono durante l'immunizzazione e impediscono il rilevamento di PAP-specifiche risposte effettrici post-immunizzazione. In alcuni pazienti abbiamo identificato PAP-specifiche risposte delle cellule T regolamentato precedente immunizzazione. Cellule T regolatrici preesistenti specifici per PAP possono essere associati con l'incapacità di sviluppare risposte immunitarie antigene-specifica di tipo TH1 dopo la vaccinazione. In alternativa risposte delle cellule T regolatori preesistenti alla PAP saranno identificare i pazienti che possono sviluppare risposte effettrici a seguito di immunizzazione multipla. In entrambi i casi, questo test fornisce una osservazione importante, come potrebbe suggerire un mezzo per dare priorità o escludere indivpazienti residuali da antigene-specifica valutazione vaccino 17.

Figura 1
Figura 1. Esempio dei tre modelli principali di ipersensibilità di tipo ritardato (DTH) trovati nei riceventi di trapianto renale. PBMC dei pazienti sono state iniettate in pastiglie dei piedi di CB17 topi SCID sia con antigeni di richiamo (TT), gli antigeni del donatore o con donatore antigene + richiamo. Show è la risposta gonfiore rete su sfondo.

Figura 2
Figura 2. . Analisi delle cellule T via indiretta soggetti arruolati in cinque gruppi: gemello identico, clinicamente tolleranti (Tol), in monoterapia steroidea(Mono), immunosoppressione standard (SI) e il rigetto cronico (CR) sono stati studiati per le risposte T effettrici (A) e le risposte T regolatorie (B) mediante saggio Tv-DTH. Tutti i pannelli: i risultati individuali di ogni soggetto (singoli simboli) e di gruppo mediana (linea orizzontale) con i quartili sono mostrati. Differenze significative tra i gruppi sono mostrati; * p <0.05, ** p <0.01 e *** p <0,001; # p = 0.04, # # p = 0.03, # # # p = 0,008.

Figura 3
Figura 3. Misurazione del collagene di tipo V-specifico autoimmunità mediante test Tv-DTH. Risposte Tv-DTH da PBMC ottenuti da normali controlli sani sottoposti a trapianto renale con GPS o trapianto polmonare. Tutti e 3 i gruppi hanno avuto risposte positive (≥ 25x10 -4 pollici netta gonfiore) per richiamare l'antigene, Col (II), un collagene fibrilar specifico per la cartilagine articolare, non ha provocato una risposta Tv-DTH in pazienti o controlli. Renali trapiantati con GPS avevano elevato significa gonfiore risposte a Col (IV). Trapianto polmonare non hanno risposto al Col (IV), ma ha risposto a Col (V).

Figura 4
Figura 4. Uso di test Tv-DTH per valutare la immunoregolazione indotta tumore. PBMC di pazienti affetti da cancro alla prostata sono stati iniettati con fosfatasi acida prostatica (PAP), da solo o con il richiamo antigene TT / DT e come controllo antigene prostatico specifico (PSA) è stato iniettato con o senza richiamare l'antigene TT / DT. Iniezione di PAP + TT / DT identificato PAP cellule regolatorie antigene-specifiche, come la co-somministrazione di PSA non è stato in grado di sopprimere la risposta DTH per l'antigene di richiamo TT / DT.


Figura 5. Riproducibilità del dosaggio Tv-DTH. Cellule crioconservati ottenere da leucaferesi on 1/15/2007 sono state scongelate, lavate con PBS, mescolato con PBS o EBV o p37-TE + EBV (auto-peptide) o p37-MA + EBV (donatore peptide) e iniettato in briganti. Le cellule sono state testate in seguenti punti di tempo: 2008/07/29, 2010/02/23, 2011/09/01, 2011/10/11, 2011/12/15.

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Discussion

Il saggio DTH trans-vivo è un test diagnostico romanzo con un potenziale applicazione clinica nella valutazione risposte mediate da cellule nel trapianto, cancro e pazienti autoimmuni. E 'prezioso perché non solo è utile nel monitoraggio delle risposte effettrici richiamo T, ma anche in grado di rilevare le risposte T regolatorie. Un modo affidabile per rilevare regolamento DTH umano potrebbe predire la sicurezza di recesso dell'immunosoppressione in pazienti che sono candidati per studi clinici in monoterapia o tolleranza.

La Tv-DTH è molto sensibile per rilevare la via indiretta di allorecognition di MHC. Tuttavia-TV DTH può essere modificato per rilevare alloresponse diretto contro intatte molecole MHC donatori. Per rilevare donatore soppressione antigene-linked di DTH, le cellule EBV-LCL esprimenti donatore HLA di classe I e di classe II possono essere coinjected con PBMC paziente. EBV-LCL quando sono stati utilizzati come fonte di antigene nel saggio DTH, cellule erano gamma irradiati con 10.000 rad, e 200.000 cellule sono state coiniettato con PBMC nella zampa di topi SCID.

Nel corso dello sviluppo della Tv-DTH troviamo che numerose condizioni possono influenzare questo test. La più importante è requisito per il rilevamento di soppressione astanti. Abbiamo fornito prove che al fine di rilevare l'inibizione di una DTH richiamo in risposta ad antigeni donatori co-localizzato, sia il sito e la sfida immunocompetence del mouse dell'host adottiva sono fattori critici che limitano la sensibilità del test Tv-DTH. PBMC da pazienti trapiantati tolleranti mediata soppressione spettatore solo quando PBMC sono stati iniettati nel briganti, e non le orecchie, e solo in topi immunodeficienti, non immunocompetenti 3.

Come tutti i test della prova Tv-DTH ha forza e di debolezza. Gli enormi vantaggi del test Tv-DTH sono i seguenti: 1) è molto sensibile e in grado di rilevare in modo affidabile le cellule T regolatorie umane, 2) che rileva le cellule T regolatorie per la loro funzione non da terede fenotipo, 3) si rileva sia Th-1 e le risposte effettrici Th-17 4) lisati cellulari grezzi possono essere utilizzati per rilevare regolamento senza sensibilizzante pazienti per i donatori antigene 5) questo saggio presenta elevata riproducibilità / stabilità (Figura 5). Gli svantaggi sono: 1) richiede un numero relativamente grande di PBMC per iniezione, 2) la tecnica richiede una formazione, in particolare nel saggio di soppressione astanti.

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Disclosures

Gli autori di questo manoscritto non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Acknowledgments

Gli autori vorrebbero riconoscere i contributi di AM VanBuskirk allo sviluppo della nostra comprensione della risposta DTH regolamentato nei destinatari del trapianto. Questo lavoro è stato supportato sovvenzioni NIH PO1AI084853 e R01AI066219-06, e dalla UE sponsorizzato uno studio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACD tube for blood collection BD 02-684-26
Lymphocyte Separation Medium Cellgro 25-072-CV
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Cellgro 21-031-CM Without calcium & magnesium
ACK Lysis Buffer BioWhittaker 10-548E
TT/DT or EBV Sanofi Pasteur Inc./ Meridian Life Science, Inc. TT/DT 25 μg/injection EBV 8 μg/injection
Protease inhibitor PMSF Sigma-Aldrich 78830
Eosine for cell count Sigma-Aldrich E-6003
Alloantigen Purified HLA antigens, synthetic allopeptides can be used instead of donor cell-free lysates
50 ml sterile centrifuge tubes Fisher Scientific 06-443-18
10 ml pipettes and pipettor BD Falcon 13-675-20
2 ml safe-lock tubes Costar 3213
1000 μl, 100 μl , 10 μl pipettes with sterile tips
Hemocytometer Fisher 02-671-10
Full size centrifuge and microfuge Beckman Coulter/Eppendorf
1/2cc or 1cc insulin syringes Becton Dickinson 14-826-79 28 gauge
Vibracell sonicator Divtech Equipment Co. Sonocs Materials Inc 2 mm probe
Dial thickness gauge Mitutoyo, Japan
SCID mice Harlan
Isoflurane Piramal Healthcare Inhalant anesthesia

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References

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Jankowska-Gan, E., Hegde, S.,More

Jankowska-Gan, E., Hegde, S., Burlingham, W. J. Trans-vivo Delayed Type Hypersensitivity Assay for Antigen Specific Regulation. J. Vis. Exp. (75), e4454, doi:10.3791/4454 (2013).

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