Summary
Мы описываем ценный диагностический анализ, которые потенциально могут быть использованы для вывода решить иммуносупрессии после трансплантации без повышенного риска отторжения трансплантата. Анализ использует принципы гиперчувствительность замедленного типа и обеспечивает точную оценку как доноров, так и конкретные нормативные эффекторных иммунных реакций установлен получателями.
Abstract
Гиперчувствительности замедленного типа ответа (DTH) является быстрым в естественных условиях проявления Т-клетками иммунного ответа на чужеродный антиген (Ag), что иммунная система хозяина пережила в недавнем прошлом. DTH реакции часто делятся на фаза сенсибилизации, ссылаясь на начальный опыт антигена, и вызов фазу, которая обычно следует несколько дней после сенсибилизации. Отсутствие гиперчувствительности замедленного типа ответ на отзыве Ag свидетельствует тестирование кожи часто рассматривается как свидетельство анергии. Традиционный анализ DTH была эффективно использована в диагностике многих микробных инфекций.
Несмотря схожими иммунной функции, такие как инфильтрацией лимфоцитами, отек и некроз тканей, прямой DTH не является возможным методом диагностики у пациентов после трансплантации из-за возможности прямого впрыска в результате сенсибилизации к антигенам донора и потери трансплантата. Чтобы избежать этой проблемы, гулк мыши "Транс-естественных" DTH был разработан анализ 1,2. Данный тест является по существу анализом передачи DTH, в котором человеческие мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) и специфических антигенов вводили подкожно в ушных раковин или подушечку из наивных мыши и DTH, как набухание измеряется после 18-24 часов 3. Презентация антигена на человека антигенпредставляющих клеток, таких как макрофаги или РСУ Т-клеткам в сильно сосудистой ткани мыши вызывает воспалительный каскад и привлекает мышей иммунные клетки в результате отека ответов. Реакция антиген-специфических и требует предварительной сенсибилизации антигеном. Положительное донора-реактивного DTH ответ в Tv-DTH анализа отражает, что пересадка пациенту разработала провоспалительных иммунных предрасположенность к аллоантигенам трансплантата.
Наиболее важной особенностью данного метода является то, что он также может быть использован для обнаружения регуляторных Т-клеток, которые вызывают подавление наблюдателем. Свидетеля подавленияDTH отзыве ответа в присутствии донора антигена характерно для реципиентов с принятыми аллотрансплантатами 2,4-14. Мониторинг реципиентов для аллореактивность и регулирования Tv-DTH может идентифицировать подгруппе пациентов, которые могли бы выиграть от снижения иммуносупрессии без повышенного риска отказа или ухудшения функции почек.
Перспективным направлением является применение Tv-DTH анализа в мониторинге аутоиммунных 15,16, а также в иммунологии опухолей 17.
Protocol
1. Подготовка лимфоцитов
- Сбор крови в ACD (кислый цитрат декстроза) труб.
- Изолят PBMC из свежей человеческой периферической крови с использованием среды для отделения лимфоцитов в соответствии со стандартными методами.
- Вымойте РВМС три раза PBS для удаления загрязняющих тромбоцитов. Тромбоциты были обнаружены помехи транс-естественных DTH анализа. Максимально допустимая тромбоцитов загрязнения МПК препарата ≤ 1x10 7 / инъекций.
- Если есть заметные красные клетки крови загрязнения, производят лизис эритроцитов использованием ACK буфера для лизиса после первой стирки. Удалить ACK буфера путем промывания 2 раза ЗФР.
2. Подготовка Аллоантиген
- Изолировать РВМС от донора периферической крови с помощью процедуры показано выше.
- Ресуспендируют доноров PBMC в PBS при концентрации 120x10 6 клеток / мл (4х10 6 клеток / 30 мкл).
- Добавить 1 мкМ PMSF к смеси, чтобы предотвратить белокдеградации.
- Обрабатывают ультразвуком суспензию клеток с использованием семи 1-вторых импульсов с 2 мм ультразвукового зонда. (Примечание: Сохраните материал холодной и избежать чрезмерного пузыри Если происходит вспенивание, пусть клеточной суспензии на лед на 2-3 мин.).
- Убедитесь, что нарушение> 90% клеток с использованием гемоцитометра.
- Центрифуга смеси при 14000 оборотов в минуту при температуре 4 ° С в течение 20 мин в охлажденный микроцентрифуге.
- Передача супернатант в новую 2,0 мл Safe-Lock трубку и определяют концентрацию белка.
3. Подготовка клеток для инъекций
- Для каждой инъекции аликвотой 7x10 6 МПК в 2,0 мл Safe-Lock труб.
- Центрифуга при 6000 оборотов в минуту на минуту в микроцентрифужную и удалить супернатант.
- Ресуспендируют клеток в PBS с или без антигена. Отрегулируйте объемом впрыска до 35 мкл PBS. Следующая схема используется для инъекций:
Отрицательный контроль: МПК + PBS
Положительный контроль: МПК + TT / DT (25 & му; Г / инъекций)
Экспериментальные Антиген специфическая реакция: МПК + тест Ag (4-8 мкг / инъекций)
Экспериментальные Антиген Конкретные регуляции: МПК + тест Ag + TT / DT
4. Предварительно измерения, инъекции, и после измерения
- Обезболить СВ17 SCID мышей изофлураном. Измерение толщины задних лап помощью подпружиненных суппорта. Поместите измеритель в центре подушечку лапы с одним краем касается последнего площадку ходьбе стопы, чтобы служить ориентиром сохранить место измерения последовательно. Footpad толщины записывается при манометра стабилизировалась.
- Медленно введите клеточные суспензии подкожно в Сапоги мышей с использованием ½ шприцы CC инсулина с 28-иглы. Осуществляет литье с иглой по направлению к пальцам, и конические вверх. (Примечание: убедитесь, что нет утечки).
- 18-24 ч после инъекции, анестезия мыши изофлураном и повторить измерение набухания подушечку.
- Subtrдействовать толщина каждой лапы перед инъекцией с поста значение инъекций, чтобы получить отек лапы значение, выражающее данные в единицах 10 -4 дюймов. Рассчитать антиген-специфические отек чистая путем вычитания управления подушечку набухание (МПК + PBS) от отека лапы значения, полученные из процедуры (МПК + донор аллоантигена, TT / DT, или донора аллоантигена TT + / ТД). Положительный ответ управления вспомнить TT антиген / DT из ≥ 25x10 дюймов -4 на фоне ответ на PBS требуется для теста, чтобы считаться действительным.
- Определение ингибирования напомнить реакции в присутствии донора антигенов путем сравнения чистых набухание каждой инъекции с использованием следующей формулы:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1. Оценка трансплантации почек донора для антиген-специфической ответ, используя TV-DTH анализа
Для проверки доноров-реактивного клеточного иммунитета при трансплантации почек мы вводили МПК у этих пациентов с донорскими антигенами в одиночку или с напомним антиген столбняка (TT). В качестве положительного контрол клетки были введены с TT в покое. Отметим три основные модели гиперчувствительности замедленного типа у реципиентов трансплантатов (рис. 1). Все пациенты ответили сильно Напомним, Ag (TT). Пациент № 62 показан регулирующий модель, которая характеризуется слабым ответом на антиген донора и заметное подавление связана (67%) вспомнить антиген ответ в присутствии донора антигена. Это образец, который был найден, связаны с органом толерантность аллотрансплантата. Пациент № 48 экспонатов nonregulatory схеме, которая отличается особенностью слабый ответ на донора, но не связаны подавления (или ссылки подавления <50%). Этокартина была часто наблюдается у пациентов, принимающих иммунодепрессанты. Однако некоторые пациенты все еще получает после трансплантации иммуносупрессором может отображать донора антигена связанных подавления их аллергическую реакцию замедленного типа. Пациент № 8 экспонатов донора Сенсибилизированные модель, характеризуется высокой ответ на антиген донора и не связаны подавления. Этот отклик, связанный с отторжением трансплантата в клинических исследований 8.
2. Роль конкретных доноров регулирования в клинический мониторинг в трансплантации почки
РВМС от субъектов поступил в ITN507ST обсервационного исследования ("Идентификация и Механистические Исследования толерантного больных трансплантации почек") были протестированы на конкретных доноров косвенные пути эффекторных Т и Т нормативных ответы с помощью TV-DTH анализа и донора (или донора HLA- соответствует суррогатной) антигена. Как показано на рисунке 2А, косвенные пути эффекторных Т-ответов на антигены донора показываетСпектр различных по регистрации групп; подушечку отек увеличивается пациентов клинического статуса диапазоны от тех, которые толерантны к тем, которые хронически отказа. МНПК от терпимого получателей индуцированных Понижен или отсутствует DTH ответов тогда МНПК отклонить лица не вызвало сильной реакции отек.
Измерение анти-доноров путем косвенного Т регуляторный ответ на связанный анализ показал, что подавление иммунной регуляции является важным механизмом для принятия почечных аллотрансплантатов. Фиг.2В показывает снижение регулирующий ответов в диапазоне от наиболее (Тол) через промежуточные (моно и SI) наименее терпимы (КР) 14 пациентов.
3. Мониторинг аутоиммунные использованием DTH TV-анализа
Перспективным направлением является применение Tv-DTH анализа в мониторинге аутоиммунные. BOS, процесс фиброзно-облитерирующий окклюзии малых дыхательных путей впересаживать легкие, является наиболее распространенной причиной отказа легких трансплантации.
При тестировании роли клеточного иммунитета к коллагену типа V в этом процессе, мы обнаружили, что самый высокий относительный риск синдрома облитерирующего бронхиолита (BOS) развитие наблюдалось у пациентов, у которых развился положительный Tv-DTH ответ на коллаген типа V в их периферической крови.
На рисунке 3 показано, что РВМС от получателей трансплантации легких, но не от здоровых людей или синдром коллаген IV-реактивного Гудпасчера пациентов после трансплантации почки, часто были коллаген V реактивный 15.
4. Применение в иммунологии опухолей
Транс-естественных DTH открывает новые возможности в исследовании рака, чтобы приоритеты больных раком простаты для вакцинации терапии. Поскольку регуляторные Т-клетки играют важную роль в развитии и прогрессировании рака, мы использовали TV-DTH для проверки реактивности РВМСы от рака пациентов, получавших вакцину ДНК, кодирующий простаты кислой фосфатазы (PAP). Мы использовали свидетелем подавления ответа вспомнить антигена для определения антигена конкретной нормативной деятельности в настоящее время вызвало в ответ на вакцинацию. Мы обнаружили, что PAP-специфических регуляторных Т-клеток спонтанно возникают у некоторых больных раком простаты, сохранится в течение иммунизации и предотвращения обнаружения PAP-конкретные реакции эффекторных после иммунизации. У некоторых пациентов мы определили PAP-конкретных регулируемых реакции Т-клеток перед иммунизацией. Ранее существовавшие регуляторных Т-клеток специфическими для PAP может быть связано с неспособностью развивать антиген-специфических Th1-типа иммунного ответа после вакцинации. Альтернативно уже существующих регуляторных Т-клеточного ответа на ППА выявления пациентов вероятность развития реакции эффекторных после несколько иммунизации. В любом случае, этот анализ является важным наблюдением, так как это может предложить средства по приоритетам или исключить индивидуумовidual пациентов с антиген-специфической оценки вакцин 17.
Рисунок 1. Примеры три основные модели гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) обнаружили у реципиентов трансплантатов почки. МНПК пациентов вводили в подушечки лап в СВ17 SCID мышей либо отзыве антигена (TT), донорские антигены или с обоими донор + напомним антигена. Показать это чистая отек ответом на фоне.
Рисунок 2. . Косвенные пути Т-клеточного анализа Субъекты поступил на пять групп: близнец, клинически терпимая (Тол), стероидные монотерапии(Моно), стандартный иммуносупрессии (SI) и хронического отторжения (CR), были исследованы на эффекторных Т-ответов (А) и Т нормативных ответов (В) Tv-DTH анализа. Все панели: Индивидуальные результаты от каждого субъекта (индивидуальные символы) и группе медиана (горизонтальная линия) с квартилями показаны. Значительные различия между группами показаны, * р <0,05, ** р <0,01 *** р <0,001, # р = 0,04, # # р = 0,03, # # # р = 0,008.
Рисунок 3. Измерение коллагена типа V-конкретные аутоиммунные по DTH TV-анализа. Tv-DTH ответы МНПК получены от нормальных здоровых людей, трансплантации почек с GPS или получателей пересадке легких. Все 3 группы были положительные ответы (≥ 25x10 дюймов -4 чистая отек) вспомнить антигена, полковник (яI), Мышечный коллагена специфичные для суставного хряща, не вызывают Tv-аллергическую реакцию у пациентов или элементов управления. Трансплантации почек с GPS был высокий средний отек ответов на Col (IV). Получателей пересадке легких не ответил на Col (IV), но не ответила Col (V).
Рисунок 4. Использование TV-DTH анализа для оценки опухоли индуцированной иммунорегуляции. МКПК от пациентов рака простаты вводили простатической кислой фосфатазы (PAP) отдельно или вместе с напомним антиген TT / DT и в качестве контроля простатического специфического антигена (ПСА) вводили с или без Напомним антигена TT / DT. Инъекции PAP + TT / ТД определены PAP антиген-специфических регуляторных клеток, а совместное введение PSA не был способен подавлять DTH ответ на ТТ / ТД напомнить антигена.
Рисунок 5. Воспроизводимость Tv-DTH анализа. Криоконсервированных клеток получить лейкаферезом на 1/15/2007 оттаивают, промывают PBS, смешанный с PBS или EBV или p37-TE + EBV (Self пептид) или p37-МА + EBV (донор пептид) и вводится в сапоги. Элементы испытывали в следующее время: 7/29/2008, 2/23/2010, 9/1/2011, 10/11/2011, 12/15/2011.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Транс-естественных DTH анализа является новым диагностическим тестом с потенциальным клиническое применение при оценке клеточного ответа в трансплантации, рака и аутоиммунных пациентов. Она ценна тем, что это не только полезны для мониторинга отзыве реакции эффекторных T, но и он может обнаружить Т нормативных ответов. Надежный способ распознавания человеческих регулирования DTH может предсказать безопасности иммуносупрессии отмена у больных, которые являются кандидатами для монотерапии или терпимости испытаний.
Tv-DTH очень чувствителен для выявления косвенных пути аллогенное распознавание МНС. Однако TV-DTH может быть модифицирован для обнаружения прямых аллоиммунный ответ против интактных молекул MHC донора. Для обнаружения антигена донора связанных подавление DTH, EBV-LCL клетки, экспрессирующие одного донора HLA класса I или класса II может быть coinjected с пациентом МПК. Когда EBV-LCL были использованы в качестве источника антигена в DTH анализа клетки были гамма-облученный с 10000 рад, а 200000 клетки совместновводили МПК в пяти SCID мышей.
В ходе разработки Tv-DTH мы находим, что несколько условий могут повлиять на результаты анализа. Наиболее важным является требование для обнаружения наблюдателем подавления. Мы предоставили доказательства того, что в целях выявления ингибирования отзыве DTH в ответ на колокализуются донора антигена, как вызов, и сайт иммунокомпетенции мыши приемных хозяев являются критическим фактором, ограничивающим чувствительность DTH TV-тест. РВМС от толерантный реципиентов опосредовано наблюдателем подавление только тогда, когда РВМС вводили в подушечки лап, а не ушами, и только у иммунодефицитных, не иммунокомпетентных мышах 3.
Как и все анализы Tv-DTH тест имеет сильные и слабые стороны. Огромные преимущества DTH TV-анализа включают следующее: 1) очень чувствительны и могут надежно обнаруживать человека регуляторных Т-клеток, 2) он обнаруживает регуляторных Т-клеток, по своим функциям не тНаследник фенотипа, 3) он обнаруживает как Th-1 и Th-17 реакции эффекторных 4) сырой лизатов клетки может быть использован для обнаружения регулирования отсутствие сенсибилизации пациентов для доноров антигена 5) этого анализа представляет высокую воспроизводимость / стабильности (рис. 5). Недостатки: 1) он требует относительно большого количества РВМС на инъекцию, 2) метод требует обширных подготовки, в частности в анализе подавление наблюдателем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы этой рукописи не имеют конфликта интересов раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы отметить вклад AM VanBuskirk в развитие нашего понимания регулируемых ответ DTH реципиентов. Эта работа была поддержана грантами NIH PO1AI084853 и R01AI066219-06, а также при финансовой поддержке ЕС одном исследовании.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACD tube for blood collection | BD | 02-684-26 | |
| Lymphocyte Separation Medium | Cellgro | 25-072-CV | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Cellgro | 21-031-CM | Without calcium & magnesium |
| ACK Lysis Buffer | BioWhittaker | 10-548E | |
| TT/DT or EBV | Sanofi Pasteur Inc./ Meridian Life Science, Inc. | TT/DT 25 μg/injection EBV 8 μg/injection | |
| Protease inhibitor PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | |
| Eosine for cell count | Sigma-Aldrich | E-6003 | |
| Alloantigen | Purified HLA antigens, synthetic allopeptides can be used instead of donor cell-free lysates | ||
| 50 ml sterile centrifuge tubes | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| 10 ml pipettes and pipettor | BD Falcon | 13-675-20 | |
| 2 ml safe-lock tubes | Costar | 3213 | |
| 1000 μl, 100 μl , 10 μl pipettes with sterile tips | |||
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
| Full size centrifuge and microfuge | Beckman Coulter/Eppendorf | ||
| 1/2cc or 1cc insulin syringes | Becton Dickinson | 14-826-79 | 28 gauge |
| Vibracell sonicator | Divtech Equipment Co. Sonocs Materials Inc | 2 mm probe | |
| Dial thickness gauge | Mitutoyo, Japan | ||
| SCID mice | Harlan | ||
| Isoflurane | Piramal Healthcare | Inhalant anesthesia |
References
- Carrodeguas, L., et al. Trans vivo analysis of human delayed-type hypersensitivity reactivity. Hum. Immunol. 60, 640-651 (1999).
- VanBuskirk, A. M., et al. Human allograft acceptance is associated with immune regulation. J. Clin. Invest. 106, 145-155 (2000).
- Burlingham, W. J., Jankowska-Gan, E. Mouse strain and injection site are crucial for detecting linked suppression in transplant recipients by trans-vivo DTH assay. Am. J. Transplant. 7, 466-470 (2007).
- Burlingham, W. J., et al. Loss of tolerance to a maternal kidney transplant is selective for HLA class II: Evidence from trans-vivo DTH and alloantibody analysis. Human Immunology. 61, 1395-1402 (2000).
- Geissler, F., et al. Human liver allograft acceptance and the 'tolerance assay': In vitro anti-donor T cell assays show hyporeactivity to donor cells but, unlike DTH, fail to detect linked suppression. Transplantation. 72, 571-580 (2001).
- Jankowska-Gan, E., et al. Human liver allograft acceptance and the 'tolerance assay'. II. donor HLA-A, -B but not DR antigens are able to trigger regulation of DTH. Hum. Immunol. 63, 862 (2002).
- Minor H Antigen HA-1-specific Regulator and Effector CD8+ T Cells, and HA-1 Microchimerism, in Allograft Tolerance. J. Exp. Med. Cai, J., et al. 199, 1017-1023 (2004).
- Rodriguez, D. S., et al. Immune regulation and graft survival in kidney transplant recipients are both enhanced by human leukocyte antigen matching. Am. J. Transplant. 4, 537-543 (2004).
- Xu, Q., et al. Human CD4+CD25low adaptive T regulatory cells suppress delayed-type hypersensitivity during transplant tolerance. J. Immunol. 178, 3983-3995 (2007).
- Derks, R. A., Jankowska-Gan, E., Xu, Q., Burlingham, W. J. Dendritic cell type determines the mechanism of bystander suppression by adaptive T regulatory cells specific for the minor antigen HA-1. J. Immunol. 179, 3443-3451 (2007).
- Jankowska-Gan, E., et al. Successful reduction of immunosuppression in older renal transplant recipients who exhibit donor-specific regulation. Transplantation. 88, 533-541 (2009).
- Jankowska-Gan, E., et al. Pretransplant immune regulation predicts allograft outcome: bidirectional regulation correlates with excellent renal transplant function in living-related donor-recipient pairs. Transplantation. 93, 283-290 (2012).
- Knechtle, S. J., et al. Early and limited use of tacrolimus to avoid rejection in an alemtuzumab and sirolimus regimen for kidney transplantation: clinical results and immune monitoring. Am. J. Transplant. 9, 1087-1098 (2009).
- Haynes, L. D., et al. Donor-specific indirect pathway analysis reveals a B-cell-independent signature which reflects outcomes in kidney transplant recipients. Am. J. Transplant. 12, 640-648 (2012).
- Burlingham, W. J., et al. IL-17-dependent cellular immunity to collagen type V predisposes to obliterative bronchiolitis in human lung transplants. J. Clin. Invest. 117, 3498-3506 (2007).
- Bobadilla, J. L., et al. TH-17, Monokines, Collagen Type V, and Primary Graft Dysfunction in Lung Transplantation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 177 (6), (2008).
- Olson, B. M., et al. Human prostate tumor antigen-specific CD8+ regulatory T cells are inhibited by CTLA-4 or IL-35 blockade. J. Immunol. 189, 5590-5601 (2012).
