Summary
Vi beskriver ett värdefullt diagnostiskt test som potentiellt skulle kunna användas för att avgöra om återkallande av immunsuppression efter transplantation utan förhöjd risk för transplantatavstötning. Analysen använder principerna för fördröjd överkänslighet och ger korrekt bedömning av både givar-specifika effektor och reglerande immunsvar monteras mottagare.
Abstract
Fördröjd överkänslighet svar (DTH) är en snabb in vivo manifestation av T-cell-beroende immunsvar mot ett främmande antigen (Ag) att värdens immunsystem har upplevt under den senaste tiden. DTH-reaktioner är ofta indelade i sensibiliseringsfas, med hänvisning till det ursprungliga antigenet erfarenhet, och en utmaning fas, som vanligtvis följer flera dagar efter sensibilisering. Avsaknaden av en fördröjd överkänslighet svar på en återkallelse Ag demonstreras genom hudtest ofta betraktas som ett bevis på anergi. Den traditionella DTH-analysen har effektivt använts för att diagnostisera många mikrobiella infektioner.
Trots dela liknande immuna funktioner såsom lymfocytinfiltration, ödem, och vävnadsdöd, är den direkta DTH inte en genomförbar diagnostisk teknik hos transplanterade patienter på grund av möjligheten till direkt injektion resulterar i sensibilisering för donor antigener och graft förlust. För att undvika detta problem, suseten-till-mus "trans-vivo" DTH analys utvecklades 1,2. Detta test är i grunden en överföring DTH-analys, där humana perifera mononukleära blodceller (PBMC) och specifika antigener injicerades subkutant i pinnae eller trampdynan av en naiv mus och DTH-liknande svullnad mäts efter 18-24 tim 3. Den antigenpresentationen av humana antigenpresenterande celler såsom makrofager eller DCS till T-celler i kraftigt vaskulär musvävnad utlöser den inflammatoriska kaskaden och lockar mus immunceller resulterar i svullnad svar. Svaret är antigen-specifika och kräver tidigare antigen sensibilisering. En positiv donator-reaktivt DTH svar i TV-DTH-analysen visar att transplantation patienten har utvecklat en pro-inflammatorisk immun disposition mot transplantat alloantigener.
Den viktigaste egenskapen med denna analys är att det också kan användas för att detektera reglerande T-celler, som orsakar beredskapsundertryckande. Beredskapsundertryckande av enDTH minns respons i närvaro av donatorantigen är kännetecknande för transplanterade med accepterade allografter 2,4-14. Övervakningen av transplanterade för alloreactivity och reglering av tv-DTH kan identifiera en undergrupp av patienter som kan dra nytta av reduktion av immunosuppression utan förhöjd risk för avstötning eller försämrad njurfunktion.
Ett lovande område är tillämpningen av TV-DTH analys i övervakningen av autoimmunitet 15,16 och även i tumörimmunologi 17.
Protocol
Ett. Framställning av lymfocyter
- Samla blod i ACD (Acid citratdextros) rör.
- Isolera PBMC från färskt humant perifert blod med användning av Lymphocyte Separation Medium i enlighet med standardmetoder.
- Tvätta PBMC tre gånger med PBS för att avlägsna kontaminerande blodplättar. Trombocyter befanns störa trans-vivo DTH-analysen. Maximal tillåten blodplättar förorening av PBMC preparatet är ≤ 1x10 7 / injektion.
- Om det finns en märkbar röda blodkroppar kontamination, utföra lys av röda blodkroppar med ACK lyseringsbuffert efter första tvätten. Avlägsna ACK buffert genom tvättning två gånger med PBS.
2. Framställning av Alloantigen
- Isolera PBMC från givaren perifert blod med proceduren ovan.
- Återsuspendera donator PBMC i PBS vid en koncentration av 120x10 6 celler / ml (4x10 6 celler / 30 | il).
- Tillsätt 1 iM PMSF till blandningen för att undvika proteinnedbrytning.
- Sonikera cellsuspension med sju 1-sekund pulser med en 2 mm-sondsonikator. (Obs: Håll materialet kallt och undvika alltför stora bubblor Om skumbildning inträffar, låt cellsuspensionen sitta på is under en 2-3 minuter..)
- Verifiera avbrott i> 90% av cellerna med användning av en hemocytometer.
- Centrifugera blandningen vid 14000 rpm vid 4 ° C under 20 min i kyld mikrofug.
- Överför supernatanten till ett nytt 2,0 ml safe-lock rör och bestämma protein koncentration.
Tre. Cell Förberedelse för injektionsvätskor
- För varje injektion alikvot 7x10 6 PBMC in 2,0 ml safe-lock rör.
- Centrifugera vid 6000 rpm under en minut i mikrofug och avlägsna supernatanten.
- Resuspendera cellerna i PBS med eller utan antigener. Justera injektionsvolym till 35 | il med PBS. Följande schema används för injektioner:
Negativ kontroll: PBMC + PBS
Positiv kontroll: PBMC + TT / DT (25 & mu, G / injektion)
Experimentell Antigenspecifikt Svar: PBMC + testa Ag (4-8 ug / injektion)
Experimentell Antigenspecifikt förordningen: PBMC + testa Ag + TT / DT
4. Pre-mätning, Injection, och Post-mätning
- Söva CB17 SCID mus med isofluran. Mät bakre trampdyna tjocklek med hjälp av en fjäderbelastad bromsok. Sätt tjocklek i mitten av fotsulan, med ena kanten vidrör sista walking pad av foten, för att ge ett riktmärke för att hålla mätplatsen konsekvent. Trampdynan tjocklek redovisas när mätaren mätvärdet stabiliserats.
- Injicera långsamt cellsuspensioner subkutant i trampdynorna hos möss med ½ sprutor cc insulin med 28-gauge nål. Utför injektionen med nålen pekande mot tårna, och avfasningen uppåt. (Obs: kontrollera att inget läckage).
- 18-24 timmar efter injektion, söva musen med isofluran och upprepad mätning av trampdynan svullnad.
- Subtragera tjockleken på varje trampdyna före injektion från posten injektionen värde för att få trampdynan svällningsvärde uttrycker data i enheter om 10 -4 inches. Beräkna antigen-specifika net svullnad genom att subtrahera kontroll trampdynan svullnad (PBMC + PBS) från trampdynan svullnad värden som erhållits från de behandlingar (PBMC + donator alloantigen, TT / DT, eller donator alloantigen + TT / DT). En positiv kontroll respons påminna antigen TT / DT på ≥ 25x10 -4 inches över bakgrunden respons på PBS krävs för att prov skall anses som giltigt.
- Bestäm hämning av recall svar i närvaro av donor-antigener genom att jämföra den netto svallningen av varje injektion med användning av följande formel:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett. Utvärdering av njurtransplanterade för donatorantigen-specifik respons med Tv-DTH-analys
För att testa donator-reaktiva cellulär immunitet i njurtransplanterade vi injicerade PBMC från dessa patienter med givare antigen ensam eller med ett återkallande antigen tetanustoxoid (TT). Som en positiv kontroll-celler injicerades med TT enbart. Vi observerar tre huvudsakliga mönster av fördröjd överkänslighet hos transplanterade patienter (Figur 1). Alla patienter reagerade starkt på Recall Ag (TT). Patient nr 62 visar regleringsmönstret, som kännetecknas av en svag respons på donatorantigen och en markant länkad suppression (67%) för att påminna antigen reaktion i närvaro av donatorantigen. Detta är det mönster som har visat sig vara associerade med orgel allograft tolerans. Patient # 48 uppvisar en nonregulatory mönster, som har funktionen av en svag reaktion på donator men ingen länkad suppression (eller länkade suppression <50%). DettaMönstret har frekvent hos patienter som tar immunsuppressiva läkemedel. Dock kan vissa patienter fortfarande får efter transplantationen immunosuppressiva läkemedel visar donatorantigen-linked undertryckande av deras DTH svar. Patient nr 8 uppvisar donator-sensibiliserade mönster, som kännetecknas av en hög respons på donatorantigen och ingen länkad förtryck. Detta svar är associerad med transplantatavstötning i kliniska fallstudier 8.
2. Roll donator-reglering i klinisk övervakning vid njurtransplantation
PBMC från försökspersonerna i ITN507ST observationsstudie studien, var ("Identifiering och mekanistiska Undersökningar av toleranta njurtransplantationpatienter") testades för donator-specifik indirekt pathway T effektor och T regulatoriska svar med hjälp av TV-DTH analys och givare (eller donator HLA- matchas surrogat) antigen. Som visas i figur 2A, avslöjar indirekta utbildningsavsnitt T effektormolekyler svar på donor antigeneren distinkt spektrum över inskrivning grupper, trampdynan svullnad ökar när patienternas kliniska status varierar från de som är toleranta mot dem som är kroniskt avslag. PBMCer från toleranta mottagare inducerad reducerad eller ingen DTH-svar medan PBMCer att avvisa personer som utlöste kraftiga svullnadsreaktioner.
Mätningen av anti-donator indirekt bana T reglerande svar från länkade visade suppression analys som immunreglering var en viktig mekanism för renal allograft acceptans. Figur 2b visar en minskning i reglerande responser över intervallet mest (Tol) genom intermediär (Mono och SI) till minst toleranta (CR) patienter 14.
Tre. Övervakning av autoimmunitet använder TV-DTH-analys
Ett lovande område är tillämpningen av TV-DTH analys i övervakningen av autoimmunitet. BIM, en process av fibro-obliterativ ocklusion av de små luftvägarna itransplanterade lungan, är den vanligaste orsaken till lungtransplantation misslyckande.
Genom att testa rollen av cell-medierad immunitet mot kollagen typ V i denna process, fann vi att den högsta relativa risken för bronkiolit obliterans-syndrom (BOS) utveckling observerades hos patienter som utvecklade en positiv Tv-DTH svar på kollagen typ V i sin perifert blod.
Figur 3 visar att PBMC från mottagare lungtransplantation, men inte från friska kontroller eller kollagen IV-reaktivt Goodpastures patienter syndrom efter njurtransplantation, var ofta kollagen V reaktiv 15.
4. Ansökan i tumörimmunologi
Trans-vivo DTH öppnar nya möjligheter inom cancerforskningen att prioritera prostatacancer patienter för vaccination terapi. Eftersom regulatoriska T-celler spelar en viktig roll i utvecklingen av cancer och progression, använde vi Tv-DTH att testa reaktiviteten hos PBMCs från cancerpatienter behandlade med ett DNA-vaccin som kodar prostata surt fosfatas (PAP). Vi använde beredskapsundertryckande av svaret till återkalla antigen för att bestämma om antigen-specifika regulatoriska aktiviteter håller på att framkallas som svar på vaccination. Vi fann att PAP-specifika regulatoriska T-celler uppstår spontant hos vissa patienter med prostatacancer, kvarstår under immunisering och förhindra upptäckt av PAP-specifika effektorceller svar efter immunisering. Hos vissa patienter vi identifierat PAP-specifika reglerade T-cells svar före immunisering. Redan existerande reglerande T-celler specifika för PAP kan associeras med oförmågan att utveckla antigenspecifika Th1-typ-immunreaktioner efter vaccination. Alternativt befintliga regulatoriska T-cell svar på PAP kommer att identifiera patienter som sannolikt kommer att utveckla effek-svar efter flera immunisering. Hursomhelst, ger denna analys en viktig iakttagelse, eftersom det skulle kunna föreslå ett sätt att prioritera eller utesluta individual patienter från antigen-specifikt vaccin utvärdering 17.
Figur 1. Exempel på de tre huvudsakliga mönster av fördröjd överkänslighet (DTH) hittades i njurtransplanterade patienter. Patient PBMCer injicerades i trampdynorna på CB17 SCID-möss med antingen recall antigen (TT), antigener donator eller med både givare + recall antigen. Show är nätet svullnad respons över bakgrunden.
Figur 2. . Indirekt bana T-cell analys ämnen inskrivna i fem grupper: identiska tvilling, kliniskt tolerant (Tol), steroid monoterapi(Mono), (CR) standard immunosuppression (SI) och kronisk avstötning undersöktes för T effektormolekyler svar (A) och T reglerande svar (B) genom Tv-DTH-analysen. Alla paneler: Individuella resultat från varje ämne (enskilda symboler) och grupp median (horisontell linje) med kvartiler visas. Betydande skillnader mellan grupper visas, * p <0,05, ** p <0,01 och *** p <0,001; # p = 0,04, # # p = 0,03, # # # p = 0,008.
Figur 3. Mätning av kollagen typ V specifika-autoimmunitet genom Tv-DTH-analysen. Tv-DTH-svar av PBMC erhållna från normala friska kontroller, njurtransplanterade med GPS eller lung mottagare transplantation. Alla tre grupperna hade positiva svar (≥ 25x10 -4 inches netto svullnad) att återkalla antigen, Col (jagI), en fibrilar kollagen specifika för ledbrosk, inte framkalla en Tv-DTH svar hos patienter eller kontroller. Njurtransplanterade med GPS hade förhöjda innebära svullnad svar till Col (IV). Lungtransplantation mottagarna svarade inte Col (IV), men svarade på Col (V).
Figur 4. Användning av Tv-DTH analys för att bedöma tumörinducerad immunreglering. PBMC från prostatacancerpatienter injicerades med prostata surt fosfatas (PAP) ensam eller med recall antigen TT / DT och som kontroll prostataspecifikt antigen (PSA) injicerades med eller utan minns antigen TT / DT. Injektion av PAP + TT / DT identifierade PAP antigen-specifika regulatoriska celler, eftersom samtidig administrering av PSA kunde inte undertrycka en DTH svar på TT / DT recall antigen.
Figur 5. Reproducerbarhet Tv-DTH-analysen. Kryokonserverade celler erhålla genom leukaferes på 2007/01/15 tinades, tvättades med PBS, blandat med PBS eller EBV eller P37-TE + EBV (själv peptid) eller P37-MA + EBV (donator peptid) och injiceras i trampdynorna. Celler testades i följande tidpunkter: 7/29/2008, 2/23/2010, 9/1/2011, 10/11/2011, 12/15/2011.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den trans-vivo DTH-analysen är en roman diagnostiskt test med en potentiell klinisk tillämpning vid bedömningen cell-medierade svar på transplantation, cancer och autoimmuna patienter. Det är värdefullt eftersom det inte bara är användbara för att övervaka recall T effektormolekyler svar, men även den kan detektera T regulatoriska svar. Ett säkert sätt att upptäcka människans DTH reglering kan förutsäga säkerheten av immunosuppression abstinens hos patienter som är kandidater för monoterapi eller tolerans prövningar.
Tv-DTH är väldigt känslig för att detektera den indirekta vägen för allorecognition av MHC. Men TV-DTH kan modifieras för att detektera direkt alloresponse mot intakta molekyler donor MHC. För att detektera donatorantigen-linked suppression av DTH, kan EBV-LCL-celler som uttrycker enskilda givaren HLA klass I eller klass II saminjicerades med patienten PBMC. När EBV-LCL användes som en källa för antigen i DTH-analysen, var celler gamma-bestrålade med 10.000 rad, och 200 tusen celler saminjiceras med PBMC in i trampdynan hos SCID-möss.
Under utveckla Tv-DTH finner vi att flera villkor kan påverka denna analys. Det viktigaste en är krav för detektering av beredskapsundertryckande. Vi gav belägg för att för att upptäcka hämning av ett återkallande DTH svar på samlokaliserade donatorantigen, både utmaningen webbplatsen och immunokompetens av musen adoptiv värden är kritiska faktorer som begränsar känsligheten av TV-DTH testet. PBMC från toleranta transplantatmottagare medieras beredskapsundertryckande endast när PBMC injicerades i trampdynorna, och inte öron, och endast i immunbrist, inte immunkompetenta möss 3.
Liksom alla analyser av Tv-DTH testet har styrka och svagheter. De enorma fördelar av TV-DTH-analysen är följande: 1) är mycket känslig och kan tillförlitligt upptäcka humana regulatoriska T-celler, 2) den upptäcker regulatoriska T-celler genom deras funktion inte genom tarvinge fenotyp, 3) den upptäcker både Th-1-och Th-17 effektormolekyler svar 4) råa cellysat kan användas för att detektera regleringen utan sensibiliserande patienterna för donatorantigen 5) denna analys presenteras hög reproducerbarhet / stabilitet (figur 5). Nackdelarna är: 1) det kräver ett relativt stort antal PBMC per injektion, 2) tekniken kräver omfattande utbildning, särskilt i beredskapsundertryckande analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna av detta manuskript har inga intressekonflikter att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för bidragen från AM VanBuskirk till utvecklingen av vår förståelse av den reglerade DTH svar hos transplanterade patienter. Detta arbete stöddes NIH bidrag PO1AI084853 och R01AI066219-06, och av EU-sponsrade en studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACD tube for blood collection | BD | 02-684-26 | |
| Lymphocyte Separation Medium | Cellgro | 25-072-CV | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Cellgro | 21-031-CM | Without calcium & magnesium |
| ACK Lysis Buffer | BioWhittaker | 10-548E | |
| TT/DT or EBV | Sanofi Pasteur Inc./ Meridian Life Science, Inc. | TT/DT 25 μg/injection EBV 8 μg/injection | |
| Protease inhibitor PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | |
| Eosine for cell count | Sigma-Aldrich | E-6003 | |
| Alloantigen | Purified HLA antigens, synthetic allopeptides can be used instead of donor cell-free lysates | ||
| 50 ml sterile centrifuge tubes | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| 10 ml pipettes and pipettor | BD Falcon | 13-675-20 | |
| 2 ml safe-lock tubes | Costar | 3213 | |
| 1000 μl, 100 μl , 10 μl pipettes with sterile tips | |||
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
| Full size centrifuge and microfuge | Beckman Coulter/Eppendorf | ||
| 1/2cc or 1cc insulin syringes | Becton Dickinson | 14-826-79 | 28 gauge |
| Vibracell sonicator | Divtech Equipment Co. Sonocs Materials Inc | 2 mm probe | |
| Dial thickness gauge | Mitutoyo, Japan | ||
| SCID mice | Harlan | ||
| Isoflurane | Piramal Healthcare | Inhalant anesthesia |
References
- Carrodeguas, L., et al. Trans vivo analysis of human delayed-type hypersensitivity reactivity. Hum. Immunol. 60, 640-651 (1999).
- VanBuskirk, A. M., et al. Human allograft acceptance is associated with immune regulation. J. Clin. Invest. 106, 145-155 (2000).
- Burlingham, W. J., Jankowska-Gan, E. Mouse strain and injection site are crucial for detecting linked suppression in transplant recipients by trans-vivo DTH assay. Am. J. Transplant. 7, 466-470 (2007).
- Burlingham, W. J., et al. Loss of tolerance to a maternal kidney transplant is selective for HLA class II: Evidence from trans-vivo DTH and alloantibody analysis. Human Immunology. 61, 1395-1402 (2000).
- Geissler, F., et al. Human liver allograft acceptance and the 'tolerance assay': In vitro anti-donor T cell assays show hyporeactivity to donor cells but, unlike DTH, fail to detect linked suppression. Transplantation. 72, 571-580 (2001).
- Jankowska-Gan, E., et al. Human liver allograft acceptance and the 'tolerance assay'. II. donor HLA-A, -B but not DR antigens are able to trigger regulation of DTH. Hum. Immunol. 63, 862 (2002).
- Minor H Antigen HA-1-specific Regulator and Effector CD8+ T Cells, and HA-1 Microchimerism, in Allograft Tolerance. J. Exp. Med. Cai, J., et al. 199, 1017-1023 (2004).
- Rodriguez, D. S., et al. Immune regulation and graft survival in kidney transplant recipients are both enhanced by human leukocyte antigen matching. Am. J. Transplant. 4, 537-543 (2004).
- Xu, Q., et al. Human CD4+CD25low adaptive T regulatory cells suppress delayed-type hypersensitivity during transplant tolerance. J. Immunol. 178, 3983-3995 (2007).
- Derks, R. A., Jankowska-Gan, E., Xu, Q., Burlingham, W. J. Dendritic cell type determines the mechanism of bystander suppression by adaptive T regulatory cells specific for the minor antigen HA-1. J. Immunol. 179, 3443-3451 (2007).
- Jankowska-Gan, E., et al. Successful reduction of immunosuppression in older renal transplant recipients who exhibit donor-specific regulation. Transplantation. 88, 533-541 (2009).
- Jankowska-Gan, E., et al. Pretransplant immune regulation predicts allograft outcome: bidirectional regulation correlates with excellent renal transplant function in living-related donor-recipient pairs. Transplantation. 93, 283-290 (2012).
- Knechtle, S. J., et al. Early and limited use of tacrolimus to avoid rejection in an alemtuzumab and sirolimus regimen for kidney transplantation: clinical results and immune monitoring. Am. J. Transplant. 9, 1087-1098 (2009).
- Haynes, L. D., et al. Donor-specific indirect pathway analysis reveals a B-cell-independent signature which reflects outcomes in kidney transplant recipients. Am. J. Transplant. 12, 640-648 (2012).
- Burlingham, W. J., et al. IL-17-dependent cellular immunity to collagen type V predisposes to obliterative bronchiolitis in human lung transplants. J. Clin. Invest. 117, 3498-3506 (2007).
- Bobadilla, J. L., et al. TH-17, Monokines, Collagen Type V, and Primary Graft Dysfunction in Lung Transplantation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 177 (6), (2008).
- Olson, B. M., et al. Human prostate tumor antigen-specific CD8+ regulatory T cells are inhibited by CTLA-4 or IL-35 blockade. J. Immunol. 189, 5590-5601 (2012).
