Summary
Den skæbne af en individuel embryocelle kan påvirkes af arvelige molekyler og / eller ved hjælp af signaler fra naboceller. Anvendelse skæbne kort over spaltning fase Xenopus embryo, kan enkelte blastomeres identificeres til dyrkning isoleret for at vurdere bidraget af nedarvede molekyler versus celle-celle interaktioner.
Abstract
Skæbne kort, konstrueret af slægt spore alle celler af et embryon, afslører hvilke væv ned fra hver celle af embryoet. Selvom skæbne maps er meget nyttige til at identificere de forstadier til et organ og til at belyse udviklingsmæssige bane, hvorved efterkommere celler befolker dette organ i den normale foster, de ikke viser det fulde udviklingspotentiale en precursorcelle eller identificere de mekanismer, som sin skæbne bestemmes. For at teste for celle skæbne engagement, man sammenligner en celle normale repertoire af efterkommere i den intakte embryo (den skæbne kort) med dem, der udtrykkes efter en eksperimentel manipulation. Er cellens skæbne fastsat (engagerede), uanset det omgivende cellulære miljø, eller er det påvirket af eksterne faktorer, som sine naboer? Brug af omfattende skæbne kort over Xenopus foster, vi beskriver, hvordan at identificere, isolere og kultur enkelt spaltningsprodukter fase forstadier, kaldet blastoMeres. Denne tilgang gør det muligt at vurdere, om disse tidlige celler er forpligtet til den skæbne, de får deres normale miljø i den intakte embryo, kræver interaktion med deres naboceller, eller kan påvirkes til at udtrykke alternative skæbner, hvis de udsættes for andre typer signaler.
Introduction
Xenopus laevis embryoer er blevet anvendt i vid udstrækning til at identificere de mekanismer, som embryonale celler erhverver deres specifikke skæbner fordi deres æg er store nok til at tillade mikrokirurgiske tilgange. Desuden udvikler de eksternt uden behov for kosttilskud af dyrkningsmediet, da hver celle indeholder en rig intracellulær forsyning af æggeblomme blodplader, der giver en iboende energilager. Et vigtigt aktiv for at studere de mekanismer, der celle skæbne bestemmes, er det omfattende sæt af skæbne kort over de spalt fase blastomeres (fra 2 - via 32-celle faser) 1, 2, 3, 4, 5, 6. Disse kort blev konstrueret ved microinjecting et påviseligt molekyle i et enkelt, identificerbar blastomer og overvåge senere i udvikling, som væv er befolket af det mærkede afkom. Konsekvent skæbne maps er muligt, fordi de kardinale akser embryoner kan identificeres pålideligt i mange EmbryOS. Først i alle vildtype embryoner dyret halvkugle er pigmenteret, hvorimod vegetabilsk halvkugle ikke er. For det andet indførelsen af sperm ved befrugtningen forårsager en sammentrækning af dyret halvkugle pigmentering hen imod den fremtidige ventrale side, i mange fostre en pigmentering forskel kan derfor anvendes til at skelne mellem dorsale og ventrale sider. For det tredje den første spaltning fure tilnærmer midten af sagittalplanet i de fleste embryoner og kan således anvendes til at identificere de højre og venstre side af embryoet. Den skæbne maps også påberåbe sig, at naturligt befrugtede æg ofte spaltes i regelmæssige mønstre, der gør hver blastomer identificeres på tværs af en stor population af embryoner. Mens der er variation inden for og mellem kløerne på æg om pigmentforandringer og spaltning mønstre, ved hjælp af udvælgelsesprocedurer beskrevet heri tillader celler med foreskrevne skæbner at blive identificeret med omkring 90% nøjagtighed.
Celleskæbner kan afskrækkebestemmes under embryogenese ved adskillige mekanismer. Intrinsic faktorer, såsom differentielt nedarvede cytoplasmiske mRNA'er eller proteiner, bidrager til flere aspekter af tidlig mønster. For eksempel fastlægge specifikke maternelle mRNA'er hvilke celler der bidrager til kimcellelinjen, bliver endoderm eller bidrager til den dorsale organ akse (revideret i 7). Eksterne faktorer, der er fastsat lokalt af tilstødende celler eller mere fjernt fra et embryonisk fjernstyringscentral, er ansvarlige for at inducere specifikke vævstyper og mønster næsten alle organsystemer. Eksempler på signalering centre omfatter rejsearrangøren / node i gastrula der inducerer det neurale ektoderm og mønstre mesoderm, og zonen for polariserende aktivitet, mønstre anterior-posteriore akse lem-knop. Selvom skæbne maps identificere forstadier til de forskellige organer og afsløre den udviklingsmæssige bane, som deres efterkommere i den normale foster, kan de ikke skelne mellem iboendeog ekstrinsiske indflydelse på disse celler. De har heller ikke afsløre det fulde udviklingspotentiale af en celle, hvis efterkommere differentiere i komplekset signalering miljø af embryoet. To eksperimentelle tilgange kan teste, om en celles skæbne bestemmes af iboende faktorer eller efterfølgende afhængig af eksterne faktorer: 1) transplantation af cellen til en ny placering i embryoet, eller 2) at fjerne en celle fra embryonet efterfulgt af dyrkning i fravær af exogene signaler.
Både eksperimentelle fremgangsmåder har været mulig i Xenopus fordi cellerne er store nok til at blive manuelt adskilt. For eksempel har adskillige undersøgelser udgår enkelte celler fra embryoer (for at ændre celle-celle interaktioner) eller transplanterede celler til nye steder i værts-embryoer at teste for skæbne ændringer (revideret i 7, 8, 9). Hertil kommer, i den anden tilgang eksplanteres små antal af celler fra forskellige egne af embryonto kultur at belyse induktive væv interaktioner i fravær af exogene faktorer er muligt, fordi cellerne i Xenopus embryo er fyldt med en intracellulær næringsstof butik, blommen blodplader. Derfor kan de dyrkes i nogle dage på et defineret salt medium uden ernæringsmæssig eller vækstfaktor supplement af dyrkningsmediet. Vi har anvendt denne metode til at vise, at de dorsale dyr blastomeres har en selvstændig evne til at producere neurale og dorsale mesodermale væv på grund af moderen nedarvet mRNA'er 10, 11, og andre viste, at mesoderm specifikation af 32-celle blastomeres afhængig af både interne og eksterne information 12 . En fordel ved dyrkning af celler som eksplantater er, at mediet også kan suppleres med definerede signalering faktorer til at bestemme, hvilken celle-til-celle kommunikation pathway kan påvirke skæbne af det eksplanterede cellen 12, 13, 14. Desuden kan man injicere blastomer prior dyrkning med mRNA til overudtrykker et gen, eller med antisense-oligonukleotider for at forhindre translation af endogene mRNA'er. Disse, gain-og tab-af-funktion analyser kan identificere, hvilke molekyler er nødvendige for en autonomt udtrykt skæbne. For at analysere skæbne eksplantatet, kan identifikation af specifikke celletyper udføres ved standard-genekspression (fx, in situ hybridisering, RT-PCR) og immuncytokemiske analyser. Denne protokol giver en enkel, men kraftfuld, måde at skelne mellem indre og ydre mekanismer, der regulerer, hvordan en embryonisk celle udvikler sig til specifikke væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Udarbejdelse af Instrumenter, dyrkningsmedier og Dishes
- Skærpe fire pincet under anvendelse aluminiumoxidslibemiddel film. Gør dette under et dissektionsmikroskop at overvåge tip-størrelse. Et par af tang fungerer som en back-up i tilfælde en spids beskadiges under proceduren. Autoklavér alle fire pincet og gemme i en steril beholder.
- Lav 500 ml hver 0,1 x og 1,0 x dyrkningsmedium (enten Marcs Modified Ringers [MFR] eller modificeret Barth saltvand [MBS], opskrifter i 15) og filter sterilisere. Vi anvender rutinemæssigt MBS (1X = 88 mM NaCl, 1 mM KCI, 0,7 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 5 mM HEPES [pH 7,8], 2,5 mM NaHCO3). Opbevares ved 14-18 ° C i flere måneder.
- Foretag en 2% agaroseopløsning i dyrkningsmedium (2 g elektroforese agarose i 100 ml 1X dyrkningsmedium i en skruehætte glasflaske). Autoklaver at opløse agarose. Dette kan opbevares ved 4 ° C i flere måneder, og microwaved at smelte agarosen, når den næste nødvendige.
- Mens agarose er flydende, hældes 0,5 ml på bunden af hver brønd i en steril 24-brønds kulturplade. Dette vil forhindre eksplantaterne klistrer til plast.
- Mens agarose er flydende, hæld ca 2-3 ml på bunden af to til tre 60 mm petriskåle, og bland forsigtigt for at sikre, bunden er dækket. Disse vil fungere som dissektion retter og agarosen forhindrer embryoner klistrer til plast, når deres membraner fjernes.
- Når agarosen er afkølet og hærdet, flamme spidsen af en 6 "Pasteur-pipette, indtil den smelter til en kugle, og lige rører det på overfladen af agarosen i hver brønd på dyrkningspladen. Dette vil skabe en let hulning, hvori eksplantatet vil blive placeret.
- Fyld hver brønd i dyrkningspladen med 1X sterilt dyrkningsmedium.
- Når agarosen er afkølet og størknet, fylde dissektion skål med fortyndet dyrkningsmedium (0,1 X MMR eller 0,1 X MBS) for at lette blastomer separation.
2. Udvælgelse af embryoner
- Opnå befrugtede æg og fjern gelé coats i overensstemmelse med standardprotokoller 15. Overføre dem til 0,5 x dyrkningsmedium i en 100 mm petriskål.
- Når embryoer opfylde 2-celle stadiet, sortere dem, hvor det første spaltningssted fure gennemskærer let pigmenteret område i dyret halvkugle (fig. 1) i en separat skål. Disse vil være donorer eksplantaterne. Holde de resterende 2-celle embryoer i en separat skål ved siden af donor embryoer hele proceduren for at tjene som kontroller søskende til fase eksplantaterne.
3. Fremstilling af Eksplantater
- Anbring 5-10 embryoer i en dissektion skålen, men kun arbejde på en embryo ad gangen.
- Placere den første embryo, så den transparente vitellinmembranen kan ses, men er adskilt af et frit rum (perivitelline space) over overfladen af dyret pol af embryoet. Under anvendelse af en skærpet kraftps i ens subdominant hånd (venstre hånd, hvis man lige er afleveret), fat i vitellinmembranen over perivitelline rummet. Brug en skarp pincet i den anden hånd, tag fat membranen tæt på den første pincet spids, og træk forsigtigt i modsatte retninger at skrælle membranen væk. Den indledende greb i en afstand fra den celle, der skal udskæres, således at målcellen ikke beskadiges under fjernelsen af membranen. Man kan sige, at membranen er blevet fjernet, fordi fosteret vil flade.
- Gribe en nabocelle med pincetten i subdominant hånd og anvende denne celle som en "håndtag" for cellen som skal dissekeret ikke direkte berøring. Med pincetten i den anden hånd trækkes forsigtigt de resterende naboceller væk fra den ønskede blastomer. Hvis midterlinjen celler, som deler den samme skæbne, er målrettet, kan de fjernes sammen som et par. Endelig dissekere væk "håndtag" celle.
- Løft blastomer (eller blastomer par), med en steril, Glas Pasteur-pipette, undgå luftbobler og overdreven udsugning. Pipetten kan være flammepoleret at fjerne skarpe kanter, der kan beskadige cellen, men vi har ikke rutinemæssigt gør dette. Placere spidsen af Pasteur-pipette under overfladen af dyrkningsmediet i en brønd af eksplantatet dyrkningsskålen, og forsigtigt udstøde blastomer. Det skal glide ind i let hulning af tyngdekraften. Den samme blastomer fra mere end et embryon kan kombineres i et enkelt eksplantat.
- Gentag denne procedure med de resterende embryoner i dissektion skålen, én efter én. Efter omkring 10 embryoer vil dissektion skålen fyldes med celleaffald. Når dette sker, skifter til en ny dissektion skål.
- Når alle dissektioner er færdig, skal du kontrollere, om eksplantaterne er i de lavvandede fordybninger. Hvis ikke, kan de forsigtigt skubbet ind i depression med et hår løkke, der er blevet steriliseret i 70% ethanol og lufttørret.
- Ca. en time efter den sidste dissektion, fjerne debris surrounde de helbredte eksplantater med en steril, glas Pasteur-pipette.
- Kultur pladen af eksplantater ved 14-20 ° C ved siden af petriskålen indeholdende søskende, kontrol embryoner. Sibling embryoer vil indikere fase af udviklingen af de blastomer eksplantater.
4. Høst Eksplantater til analyse
- Høste eksplantaterne når søskende når den ønskede udviklingstrin. Disse eksplantater overlever ganske godt, selv om nogle af cellerne smuldrer. Derfor, hvis der er en uklar masse i kulturbrønd, udforske den med en hår løkke eller pincet at bestemme, om et sundt eksplantat er begravet inden.
- Saml eksplantater i et lille volumen af kultur opløsning med en glas Pasteur-pipette, og forsigtigt udstøde dem i et fiksativ eller lysebuffer passende til assayet skal udføres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Evnen hos dette assay præcist at vurdere den udviklingsmæssige potentiale af cellen afhængig dissekere den korrekte blastomer baseret på skæbne kort 1, 2, 3, 4, 5, 6. Det er derfor vigtigt at vælge embryoer med den korrekte pigmentering mønster på 2-celle stadiet, som vist i figur 1, som derefter i overensstemmelse med regelmæssige spaltningsmønstrene, som illustreret i figur 2. Hvis man overholder de sorterede embryoner når den krævede spaltning scenen og frasortering af de befrugtede æg viser uregelmæssige skel, nøjagtighed væsentligt forbedret. Som illustreret i figur 2, regelmæssige spaltninger ofte kun forekommer på den ene side af embryoet. Disse embryoner kan anvendes som donorer, hvis donorcellen hidrører fra "normal" side. Fordi regelmæssige spaltningsmønstrene findes i færre embryoner som celledeling skrider frem, sortere omkring fem gange så mange embryoner, som du har til hensigt at dissekere. Naturligvis fertilized æg tendens til at have mere regelmæssige spaltning end in vitro befrugtede æg. Selvom spaltningsmønstrene varierer meget inden for en enkelt klynge af æg, kan man forvente mindst 10-20% at være anvendelige til denne form for en manipulation.
Blastomerer kan dyrkes alene eller i små grupper. Når blastomeres først dissekeret (figur 3A) og overført til kulturen godt (figur 3B, C), de er bløde og skrøbelige. Det er vores erfaring, er animalske og ækvatoriale blastomeres meget lettere at dissekere og kultur end vegetabilske blastomeres (figur 3C). Måske fordi de er mindre, de er lettere at overføre. De synes også at helbrede hurtigere, når nicked med pincetten. Vegetabilske celler ofte synes at fuldføre cytokinese langsommere og dermed bevare cytoplasmatiske broer med søster celler, hvilket gør dem mere "utæt", når dissekeret, og deres cellemembran er mere skrøbelig og lettere at skade.Efter omkring 1-2 timer i kultur, vil det eksplanterede blastomer (er) har opdelt omkring 4 gange og slidt fleste af resterne tilbage fra beskadigede tilgrænsende celler (figur 3D). Efter 20 timer, danner de små robuste kugler af celler (figur 3E). Mens nogle kan være begravet i rester, ofte en sund masse kan ses (figur 3E, venstre).
Selv eksplantaterne er små, de overlever behandling til in situ-hybridisering såvel som de mere almindeligt anvendte dyr cap eksplantater, der tillader en at overvåge senere genekspression. I eksperimentet vist i figur 4A, blev to dorsale blastomeres (D1.1) eller to ventrale blastomeres (V1.1) dissekeret ved 16-cellestadiet og dyrket i 1X MBS ved 14 ° C, indtil søskende embryoner nåede tidlige neurale plade faser (ST12-13, ca 20-22 timer efter dissekering). Hver prøve blev analyseret for ekspressionen af et zygotisk neurale plade gen (Sox2 </ Em>) ved in situ hybridisering (den blå reaktionsprodukt). Dette assay demonstrerer, at størstedelen af dorsale dyr blastomeres, som er forstadier for den neurale plade, kan udtrykke Sox2 autonomt, det vil sige uden yderligere signalering fra andre regioner af embryoet. Disse eksplantater, der ikke udtrykker Sox2 kan være ukorrekt identificeret ved dissektion. Derimod. Ingen af de ventrale dyr blastomeres, som er forstadier for det ventrale epidermis, express Sox2 Således konkluderer vi, at dorsal dyr blastomer har en iboende evne til at danne nervevæv, mens de ventrale dyr blastomeres ikke gør. Bemærk, at nogle af D1.1-eksplantater er også eIongated, en morfologi, der indikerer dorsal mesoderm formation; disse blastomeres også er skæbnesvangre til dannelse af rygstrengen i intakte embryo 3, og i eksplantat kultur udtrykker et notochord markørprotein 10. Blastomer iboende skæbner kan være ältere d ved forudgående mikroinjektion af mRNA'er (gain-of-funktion) eller anti-sense-morpholino oligonukleotider (MOS, tab af funktion). I figur 4B, er den virkning at ændre de endogene niveauer af et maternelt udtrykt neural gen, foxD5 16, 17, testet. Når den endogene niveau af FoxD5 blev forøget ved at injicere foxD5 mRNA'er i de 8-celle prækursor blastomeres af V1.1 (nederste række), hovedparten af V1.1 eksplantater (dyrket til st 12-13) udtrykte Sox2. Omvendt, når den endogene niveau af FoxD5 blev reduceret ved injektion af MOs i de 8-celle prækursor blastomeres af D1.1 (øverste række), kun et par D1.1 eksplantater (dyrket til st 12-13) udtrykte Sox2 (sammenlignet med øverste række af figur 4A). Disse eksperimenter viser, at maternel ekspression af foxD5 spiller en rolle i den iboende evne dorsale blastomeres at erhverve et neuralt skæbne.
ftp_upload/4458/4458fig1.jpg "alt =" Figur 1 "/>
Figur 1. Pigmentering mønstre i 2-celle embryoer fra naturligt befrugtede æg. Den første spaltning fure er angivet med en pil. A) Et eksempel på et embryo, som ikke bør anvendes til at identificere blastomeres på senere trin, fordi den let pigmenteret område af dyret halvkugle af embryonet findes hovedsagelig i én celle (til venstre). Siden den første spaltning fure forudsiger midten af sagittalplanet af embryonet, vil det let pigmenteret område af denne embryo ikke identificere dorsale. B) To eksempler på embryoner, der skal sorteres for eksplantatkulturer. I begge er let pigmenteret område af dyret halvkugle (*) gennemskæres af den første spaltning fure. Embryonet til venstre er tidligt i den første cellecyklus, og den let pigmenteret region er kun synlig i omkring 25% af celleoverfladen. Embryonet til højre nærmer sig slutningen af den første cellecyklus, og pigmentet er flyttet ventrally så de dorsale halvdele af de to celler er lettere. Som følge heraf de let pigmenteret dyreceller på et senere tidspunkt vil forudsige dorsal (d) og mørkere dyreceller vil forudsige ventrale (v).
Figur 2. Eksempler på spalt-embryoer fra naturligt befrugtede æg. Alle embryoer er orienteret med dyret pol vender mod læseren, dorsale til toppen. A) 4-celle embryoer. Embryonet til venstre har netop indgået den anden celle cyklus, så spaltningen furer er overfladiske. Embryonet til højre har næsten afsluttet den anden celle cyklus, så spaltningen furer er dybere og cellerne synes mere afrundet. Sorte pile peger på den første spaltning fure, og røde pile peger på den anden spaltning fure. B) 8-celle embryoer. Embryonet til venstre er tidligt er det tredje cellecyklus og embryoet til højre nærenden af den tredje cellecyklus. C) 16-celle embryoer. C 'er et eksempel på uregelmæssige skel, der skal undgås. C "er et eksempel på regelmæssige skel på den ventrale side, men uregelmæssig på den dorsale side. C'' 'er et eksempel på mere regelmæssige skel på den dorsale side, men ikke på ventrale side. C'''' er et eksempel regelmæssige skel på midterlinjen, men ikke i sideretningen. D) 32-celle embryoer. D 'er et eksempel på regelmæssige skel på den ventrale side, men uregelmæssige på den dorsale side. D'' er et eksempel på regelmæssige skel på den dorsale side, men ikke på ventrale side. D'' 'er et eksempel på regelmæssige skel på højre side, men mere uregelmæssige spaltninger på venstre side. E) 64-celle-embryo. For en skematisk fremstilling af disse faser, henvises der til Den Nieuwkoop og Faber iscenesættelse serie, som kan findes on-line ( http://www.xenbase.org/anatomy/alldev.do ).
Figur 3. Eksplantater fra 16-celle embryoer fra naturligt befrugtede æg. A) En ventrale dyr blastomer kort efter dissektion. Pil angiver resterne af "håndtag" celle. B) En ventrale dyr blastomer overført til en dyrkningsbrønd, der har delt gang. C) En ventral vegetabilske blastomer kort efter dissektion. Sammenlignet med dyr blastomeres, er disse større, og mere vanskeligt at manipulere. D) To ventrale dyr blastomer eksplantater, 2 time efter dissektion, har delt omkring fire gange. Den venstre eksplantat er set fra den oprindelige, pigmenteret ydre overflade af blastomer, retten eksplantat er set fra den oprindelige, upigmenteret indre overflade af blastomer. E) To ventrale dyr blastomer eksplantater dyrket i 24 timer. Den venstre eksplantat sidder i en seng af celleaffald (pile), mens højre eksplantat er fri for enhver efterladenskaber. Alle billeder er ved 50X Magnification.
Fig. 4. In situ hybridiseringsanalyse af genekspression i eksplantater afledt af 16-celle blastomeres dissekeret fra naturligt befrugtede æg. A. 16-celle-embryo til venstre illustrerer den dorsale blastomer par (D1.1), som blev eksplanteret for resultaterne i den øverste række, og den ventrale blastomer par (V1.1), som blev eksplanteret for resultaterne i den nederste række. Dissekeret blastomer par fra ikke-injicerede embryoner blev anbragt i 0,1 X MBS i dyrkningsbrønde og inkuberet ved 14 ° C i omkring 20 timer. De blev opsamlet i rør med fiksativ og behandlet af in situ-hybridisering for ekspression af et zygotisk neural gen, Sox2. B. blastomerer af 8-celle embryoer blev injiceret bilateralt entenmed foxD5 MOS, for at reducere endogen ekspression i dorsale blastomeres, eller med foxD5 mRNA at forøge endogen ekspression i ventrale blastomeres. Når de injicerede embryoner nåede 16-cellestadiet (20-30 minutter senere), blev blastomer par dissekeret, dyrket og analyseret ved in situ hybridisering som i A. Antallet af eksplantater, der udtrykker Sox2 væsentligt reduceret i D1.1-eksplantater, der var injiceret med foxD5 MOS (sammenlignet med øverste række i A). Antallet af eksplantater, der udtrykker Sox2 signifikant forøget i V1.1 eksplantater, der blev injiceret med foxD5 mRNA (sammenlignet med nederste række i A). Klik her for at se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mest kritiske trin for vellykket dyrkning af individuelle blastomerer er: 1) korrekt identifikation af blastomer af interesse, 2) opretholde et sterilt, sund kultur, 3) dissekere celler i den korrekte del af cellecyklus, og 4) at udvikle de nødvendige manuelle fingerfærdighed til at forebygge skader under dissektion og overføre til kulturen godt.
At manipulere bestemte blastomeres, er det vigtigt at være i stand til at identificere de kardinalpunkter akser. I Xenopus embryoer, kan den dorsale side identificeres ved tre metoder: (1) markerer sperm indgang med en vital farvestof 18, 19, (2) deponering in vitro-befrugtede æg og mærkning ene side 18, 19 eller (3) udvælgelse af embryoner i 2-celle stadiet, hvor det første spaltningssted fure gennemskærer let pigmenteret område i dyret halvkugle 20, 21. Vi anvender den tredje metode, som præcist udpeger blastomeres fra naturligt fertilizED 16-celle embryoer i omkring 90% af tilfældene 20, 21. Ved befrugtningen, begynder dyrets halvkugle pigmentering at falde mod sperm indgang på den ventrale side, hvilket får den dorsale dyr region til at blive mindre pigmenteret med et flertal af embryoner (figur 1). Der er betydelig variation i omfanget af dette let pigmenteret region tværs koblinger og endda inden for koblinger af Xenopus æg. Hvis den første spaltning fure halverer dette lysere område ligeligt mellem de to datterceller, så at lysere område kan anvendes som indikator for den dorsale side, og den første spaltning fure angiver midten sagittalplan. Hvis den første spaltning fure adskiller døtre ind i en mørk celle og en lys celle, skal du ikke bruge det til eksplantatet fordi pigmentering på senere stadier vil ikke præcist at identificere den dorsale side. Tidligere undersøgelser har vist, at i den slags fostre den første spaltning fure forblev en markør for than mid-sagittalplan hvorimod den let pigmenteret regionen ikke længere angivet den dorsale side 20, 21. Embryoer kan også vælges på den tidlige del af den 4-cellers spaltning (venstre embryo i figur 2B), når den første og den anden furer på den vegetative pol kan skelnes, den første fure skal være komplet og den anden fure ikke endnu ikke afsluttet. Men hvis man venter indtil slutningen af 4-celle stadiet at vælge embryoner (højre embryo i figur 2B), den første og anden spaltning furer ikke længere kan skelnes, og de let pigmenterede celler kan være dorsale dem i kun ca 70% af embryoner 20, 21. Dette vil gøre rettet mod specifikke blastomeres langt mindre præcis. Det skal bemærkes, at procentdelen af embryoer, hvor den første spaltning fure gennemskærer let pigmenteret region varierer en del tværs af koblinger. I vores erfaring, de kan tegne sig for <50% af æggene i en kobling til> 80% Af æggene i en kobling. Uanset hvad, er der næsten altid er nok æg inden for en kobling af sunde æg, der opfylder dette kriterium til at støtte en eksplantat eksperiment.
De to anbefalede dyrkningsmedier (MMR, MBS) er næsten udskiftelige, præferencer forskellige laboratorier er for det meste historiske. MMR kan gemmes som en 10X løsning i et år eller mere. MBS har en kortere holdbarhed, fordi den er pufret med bicarbonat. Fordi embryoner og eksplantater kan bukke under for bakteriel infektion uden den beskyttende gelé og ægmembraner bør pincet og dyrkningsmedier være sterile. Hvis eksplantater ikke overlever godt, kan antibiotisk sættes til dyrkningsmediet (fx 0,1% gentamicin). Opløsninger indeholdende gentamicin har en kort holdbarhed, og derfor bør frisk den dag, de skal anvendes. Cellerester indeholder proteaser, der vil skade de ubeskyttede eksplantater og fremmer bakterievækst. Derfor bør det være remoat the fra dyrkningsbrønde efter eksplantaterne har haft en chance for at helbrede.
Blastomer dissektioner udføres i fortyndede dyrkningsmedium (0,1 X MBS eller 0,1 x MFR) for at mindske styrken af celle-til-celle-adhæsioner. I Xenopus spaltningsprodukter faser, celleadhæsion mest ved calcium-/magnesium-dependent cadherins. Det er derfor ikke nødvendigt at anvende enzymatisk dissociation, faktisk dette bør undgås, fordi det fjerner overfladeproteiner, som kan være vigtige i skæbne bestemmelse events. Fordi embryonale celler fra forskellige partier af æg klæber med forskellige styrker, kan fortynding af dissektionsmedium nødvendigt at justere på ad hoc-basis. Hvis cellerne er for klæbende at dissekere uden at rive dem, sænke koncentrationen af dissektionsmedium trinvis fra 0,1 x. Omvendt, hvis cellerne falder fra hinanden, når vitellinmembranen fjernes og er meget utætte, forøge koncentrationen af dissection medium trinvis. Du skal dog ikke bruge calcium-/magnesium-free medier, fordi cellerne bliver for skrøbelige til at overføre til dyrkningsbrøndene. Vellykket adskillelse af blastomerer også afhænger af, hvornår under cellecyklussen man udfører dissektion. Som vist i figur 2, tidligt i cellecyklus spaltningen furer er lavvandede og blastomererne er flade. Senere i cyklen spaltningen furer er dybere og cellerne er mere afrundet. Tidligt i cellecyklussen, er der cytoplasmiske broer, der vil forårsage cytoplasmisk lækage, hvis brudt. Derfor celler lettere dissekeret sent i cellecyklus. 4-celle embryoer, 8-celle embryoner og vegetabilske celler i alle faser er sværere at dissekere fordi de cytoplasmatiske broer vare længere. Man kan forudse en høj dødelighed for disse eksplantater, hvilket betyder man skal udføre flere dissektioner for at inddrive en rimelig stikprøvestørrelse. Man kan vente til begyndelsen af næste kavalergang fure at begynde theseIndsatsen af disse celler for at sikre, at de cytoplasmiske broer er lukket. Mens enkelte blastomeres taget fra 8 - og 16-celle embryoer overleve godt i kultur, i vores erfaring ældre blastomeres klarer sig mindre godt som enkelte celler. Selvom vi ikke kender årsagen til dette, kan overlevelse ældre blastomer eksplantater forbedres ved at dissekere flere (2-6) af samme blastomer fra forskellige embryoer og dyrkning dem sammen i en enkelt kultur brønd 10, 13, 14.
Denne procedure kræver øvelse og nogle håndelag. Fordi tiden mellem spaltninger er temperaturafhængig, er det praktisk at opbevare embryoer ved 14-16 ° C for at forsinke spaltning og give mere tid til at udføre de dissektioner. Imidlertid vil embryoer ikke tolerere temperaturer lavere end 14 ° C. Den første udfordring i denne procedure er at fjerne vitellinmembranen. Det er bedst ikke at gå videre til blastomer dissektion indtil dette første skridt er behersket. Når dissekeringud blastomer, er "håndtag" celle sandsynligvis lække og falde fra hinanden. Dette er ikke et problem fordi når alle andre celler er skrællet bort fra den ønskede celle, kan den "håndtag" celle fjernes med pincet. Håndtaget celle rester og andet affald normalt falde bort, når blastomer overføres til kulturbrønd (figur 3B). Blastomerer holder ivrigt til plast, så kun bruge glaspipetter at overføre dem. Bruge minimal sugende tryk på cellen, fordi det kan opløse fra forskydningskræfterne i pipetten. Også undgå luftbobler i pipetten, og at spidsen af pipetten er under overfladen af dyrkningsmediet, når eksplantatet udstødes fordi cellerne vil eksplodere, hvis de rører en luft-vand-grænsefladen.
Protokollen er beskrevet heri bruger umanipulerede embryoner som donorer for eksplantaterne og enkle salt medier til dyrkning. Disse tillader en at teste den iboende evne af eksplantatet til exprEss bestemte skæbner. Denne fremgangsmåde kan eksperimentelt udvides på to måder. For det første kan dyrkningsmediet suppleres med signal / vækstfaktorer for at teste, hvorvidt disse molekyler kan forårsage eksplantatet at udtrykke alternative skæbne. For det andet kan genekspression af donor embryoer ændres ved injektion af enten mRNA'er (gain-of-funktion) eller anti-sense-morpholino oligonukleotider (tab-af-funktion) til specifikke precursorer før blastomer dissektion. Dette kan gøres ved 1-cellestadiet, eller på en mere målrettet måde ved 1-2 celledelinger før dissektion. Denne fremgangsmåde kan man teste, om en bestemt eksogent leveret genet forårsager en blastomer at erhverve en alternativ skæbne, eller om en bestemt endogent gen er nødvendigt for blastomer at udtrykke sin autonome skæbne (f.eks, figur 4B). Disse er stærke eksperimentelle metoder, fordi de fjerner de forstyrrende indflydelse af de andre celler og signalering centers stede i intakte embryo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende den GWU Harlan Fellowship til støtte Paaqua Grant og GWU Luther Rice Fellowship for støtte til Mona Herold. Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation tilskud MCB-1.121.711.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-38 | Course (12 μm), for major repairs of forceps tips |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-46 | Medium (3 μm), for fine sharpening of forceps tips |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-54 | Fine (0.3 μm), for polishing of forceps tips |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | #11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. Corrosive resistant so they can be autoclaved. |
| Gentamicin solution | Sigma | G1397 | Add to medium on same day as use |
References
- Dale, L., Slack, J. M. Fate map of the 32-cell stage of Xenopus laevis. Development. 100, 279-295 (1987).
- Masho, R., Kubota, H. Y. Developmental fates of blastomeres of the eight-cell stage Xenopus embryo. Dev. Growth, Diff. 30, 347-359 (1988).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 119, 560-578 (1987).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 122, 300-319 (1987).
- Moody, S. A., Kline, M. J. Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres. Anat. Embryol. 182, 347-362 (1990).
- Takasaki, H. Fates and roles of the presumptive organizer region in the 32-cell embryos in normal development of Xenopus laevis. Dev. Growth, Diff. 29, 141-152 (1987).
- Sullivan, S. A., Moore, K. B., Moody, S. A. Chapter 20 Early events in frog blastomere fate determination. Cell Fate and Lineage Determination. Moody, S. A. , Academic Press. 297-321 (1999).
- Moore, K. B., Moody, S. A. Animal-vegetal asymmetries influence the earliest steps in retinal fate commitment in Xenopus. Dev. Biol. 212, 25-41 (1999).
- Yan, B., Moody, S. A. The competence of Xenopus blastomeres to produce neural and retinal progeny is repressed by two endo-mesoderm promoting pathways. Dev. Biol. 305, 103-119 (2007).
- Gallagher, B. C., Hainski, A. M., Moody, S. A. Autonomous differentiation of dorsal axial structures from an animal cap cleavage stage blastomere in Xenopus. Development. 112, 1103-1114 (1991).
- Hainski, A. M., Moody, S. A. Xenopus maternal mRNAs from a dorsal animal blastomere induce a secondary axis in host embryos. Development. 116, 347-3345 (1992).
- Godsave, S. F., Slack, J. M. Single cell analysis of mesoderm formation in the Xenopus embryo. Development. 111, 523-530 (1991).
- Hainski, A. M., Moody, S. A. An activin-like signal activates a dorsal-specifying RNA between the 8- and 16-cell stages of Xenopus. Dev. Genetics. 19, 210-221 (1996).
- Pandur, P. D., Moody, S. A. Multiple maternal influences on dorsal-ventral fate of Xenopus animal blastomeres. Dev. Dyn. 225, 581-587 (2002).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Sullivan, S. A., Akers, L., Moody, S. A. foxD5a, a Xenopus winged helix gene, maintains an immature neural ectoderm via transcriptional repression that is dependent upon the C-terminal domain. Dev. Biol. 232, 439-457 (2001).
- Yan, B., Neilson, K. M., Moody, S. A. FoxD5 plays a critical upstream role in regulating neural fate and onset of differentiation. Dev. Biol. 329, 80-95 (2009).
- Vincent, J. -P., Gerhart, J. C. Subcortical rotation in Xenopus eggs: an early step in embryonic axis specification. Dev. Biol. 123, 526-539 (1987).
- Peng, H. B. Appendix A: Solutions and Protocols. Methods in Cell Biology. 36, 657-662 (1991).
- Klein, S. L. The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos. Dev. Biol. 120, 299-304 (1987).
- Masho, R. Close correlation between the first cleavage plane and the body axis in early Xenopus embryos. Dev. Growth Diff. 32, 57-64 (1990).
