Summary
Le destin d'une cellule individuelle embryonnaire peut être influencé par des molécules héréditaires et / ou par des signaux provenant des cellules voisines. L'utilisation de cartes sort de l'embryon de Xenopus clivage stade, blastomères simples peuvent être identifiés pour la culture en vase clos pour évaluer les contributions des molécules héritées par rapport interactions cellule-cellule.
Abstract
Cartes Destin, construits à partir de la lignée de traçage de toutes les cellules d'un embryon, qui révèlent les tissus descendent de chaque cellule de l'embryon. Bien que les cartes destin sont très utiles pour identifier les précurseurs d'un organe et pour élucider la voie de développement par lequel les cellules descendants peuplent cet organe dans l'embryon normal, ils n'illustrent pas le plein potentiel de développement d'une cellule précurseur ou d'identifier les mécanismes par lesquels son sort est déterminé. Pour tester la volonté du destin cellulaire, on compare répertoire normal d'une cellule de descendants dans l'embryon intact (la carte sort) avec ceux qui sont exprimés après une manipulation expérimentale. Est le destin de la cellule fixe (engagé), indépendamment de l'environnement cellulaire, ou est-elle influencée par des facteurs externes fournis par ses voisins? En utilisant les cartes complètes sort de l'embryon de Xenopus, nous décrivons comment identifier, d'isoler et de culture simples précurseurs stade de division, appelée blastomeres. Cette approche permet d'évaluer si ces premières cellules se sont engagés à le devenir qu'ils acquièrent dans leur environnement normal de l'embryon intact, nécessitent des interactions avec leurs cellules voisines, ou peut être influencée à exprimer destins alternatifs s'ils sont exposés à d'autres types de signaux.
Introduction
Xenopus laevis embryons ont été utilisés à grande échelle pour identifier les mécanismes par lesquels les cellules embryonnaires acquérir leurs destins particuliers parce que leurs œufs sont assez grands pour permettre des approches de microchirurgie. En outre, ils développent l'extérieur sans la nécessité d'une supplémentation nutritionnelle du milieu de culture, parce que chaque cellule contient une alimentation riche intracellulaire de plaquettes vitellines qui fournissent un accumulateur d'énergie intrinsèque. Un atout important pour l'étude des mécanismes par lesquels le destin des cellules est déterminée est l'ensemble complet de cartes sort des blastomères stade de division (à partir de 2 - à 32 cellules étapes) 1, 2, 3, 4, 5, 6. Ces cartes ont été construits par micro-injection d'une molécule détectable en un seul blastomère identifiables et suivi plus tard dans le développement de tissus qui sont peuplées par les descendants étiquetés. Les cartes compatibles sont destin possible parce que les axes cardinaux des embryons peuvent être identifiés de façon fiable dans de nombreux embryos. Tout d'abord, dans tous les embryons de type sauvage de l'hémisphère animal est pigmenté, alors que l'hémisphère végétatif est pas. Deuxièmement, l'entrée des spermatozoïdes lors de la fécondation provoque une contraction de la pigmentation hémisphère animal vers le côté ventral avenir, dans de nombreux embryons une différence de pigmentation peuvent donc être utilisés pour discriminer entre les côtés dorsal et ventral. En troisième lieu, le premier sillon de clivage se rapproche du plan médian sagittal dans la plupart des embryons, et peut donc être utilisée pour identifier les bords droit et gauche de l'embryon. Les cartes sort aussi compter sur le fait que, naturellement, les oeufs fécondés fréquemment fendra par des motifs réguliers qui font que chaque blastomère identifiable à travers une large population d'embryons. Alors il existe une variabilité au sein et entre les couvées d'œufs sur des patrons de pigmentation et le décolleté, en utilisant les procédures de sélection décrite ici permet cellules avec des destins prescrites pour être identifié avec environ 90% de précision.
Destins cellulaires peuvent être dissuader lesextrait au cours de l'embryogenèse par plusieurs mécanismes. Les facteurs intrinsèques, tels que différemment héritées des ARNm cytoplasmiques ou des protéines, contribuent à plusieurs aspects de la structuration précoce. Par exemple, certains ARNm maternels déterminer les cellules qui contribuent à la lignée germinale, devenu l'endoderme, ou de contribuer à l'axe du corps dorsale (pour revue 7). Les facteurs extrinsèques fournis localement par les cellules voisines ou plus lointainement à partir d'un centre embryonnaire de signalisation, sont responsables de l'induction types spécifiques de tissus et de motifs presque tous les systèmes d'organes. Exemples de centres de signalisation incluent l'organisateur / noeud dans la gastrula qui induit l'ectoderme neural et les modèles du mésoderme, et la zone d'activité polarisante que les modèles de l'axe antéro-postérieur du bourgeon de membre. Bien que les cartes destin d'identifier les précurseurs des différents organes et de révéler la voie du développement pris par leurs descendants dans l'embryon normal, ils ne peuvent pas distinguer intrinsèqueet les influences extrinsèques sur ces cellules. Ils ont également ne pas révéler le plein potentiel de développement d'une cellule, dont les descendants se différencier dans l'environnement complexe de signalisation de l'embryon. Deux approches expérimentales pouvez tester si le destin d'une cellule est déterminée par des facteurs intrinsèques ou est ensuite influencée par des facteurs externes: 1) la transplantation de la cellule à un emplacement roman dans l'embryon, ou 2) la suppression de la cellule de l'embryon suivie par la culture dans l'absence de signaux exogènes.
Les deux approches expérimentales ont été faisable chez Xenopus parce que les cellules sont assez grands pour être séparé manuellement. Par exemple, de nombreuses études ont supprimé des cellules individuelles à partir d'embryons (pour changer interactions cellule-cellule) ou des cellules transplantées à des endroits nouveaux dans les embryons d'accueil pour tester les modifications sort (commentaire en 7, 8, 9). En outre, la seconde approche de l'explantation de petits nombres de cellules de différentes régions de l'embryon iculture nto d'élucider les interactions inductives tissulaires en l'absence de facteurs exogènes est possible parce que les cellules de l'embryon de Xenopus sont remplis d'un magasin intracellulaire des nutriments, les plaquettes vitellines. Par conséquent, elles peuvent être cultivées pendant quelques jours dans un milieu défini sans sel supplémentation nutritionnelle ou facteur de croissance du milieu de culture. Nous avons utilisé cette approche pour montrer que les blastomères animaux dorsales ont une capacité autonome pour produire des neurones et des tissus mésodermiques dorsales dues à hérité de la mère ARNm 10, 11, et d'autres ont montré que la spécification du mésoderme de 32 cellules blastomères s'appuie à la fois sur l'information intrinsèque et extrinsèque 12 . Un avantage de la culture de cellules comme explants, c'est que le milieu peut également être complétée par des facteurs de signalisation définis afin de déterminer quelle cellule-à-cellule voie de communication pourrait influer sur le sort de la cellule explanté 12, 13, 14. En outre, on peut injecter le pr blastomèreIOR de culture avec de l'ARNm de surexprimer un gène, ou par des oligonucléotides anti-sens pour prévenir la traduction des ARNm endogènes. Ceux-ci, gain et perte de fonction des analyses permettent d'identifier les molécules sont nécessaires pour un destin autonome exprimé. Pour analyser le sort de l'explant, l'identification des types cellulaires spécifiques peuvent être effectuées par l'expression des gènes standard (par exemple, l'hybridation in situ, RT-PCR) et des tests immunocytochimiques. Ce protocole fournit un moyen simple, mais puissant, moyen de distinguer entre les mécanismes intrinsèques et extrinsèques qui régissent la façon dont une cellule embryonnaire se développe dans des tissus spécifiques.
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Protocol
1. Préparation des instruments, de la Culture et des Médias Plats
- Aiguisez quatre pinces à l'aide de film abrasif d'alumine. Pour ce faire, sous un microscope à dissection pour contrôler la taille de la pointe. Une paire de pince sert de back-up au cas où un embout est endommagé lors de la procédure. Autoclaver les quatre pinces et conserver dans un contenant stérile.
- Assurez 500 ml de milieu de culture 0,1 X 1,0 X et (que ce soit Sonneries Marc jour [MMR] ou modification de Barth Saline [MBS]; recettes à 15) et le filtre à stériliser. Nous utilisons régulièrement MBS (1X = 88 mM de NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM de CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 5 mM d'HEPES [pH 7,8], 2,5 mM NaHCO 3). Entreposer à 14-18 ° C pendant plusieurs mois.
- Faire une solution à 2% d'agarose dans un milieu de culture (2 g d'électrophorèse d'agarose de qualité dans 100 ml de milieu de culture 1X dans une bouteille en verre bouchon à vis). Autoclaver à dissoudre l'agarose. Cela peut être conservé à 4 ° C pendant des mois, et au micro-ondes pour liquéfier la gélose lors de sa prochaine nécessaire.
- Alors que l'agarose est liquide, verser environ 0,5 ml sur le fond de chaque puits d'une plaque de culture de 24 puits stérile. Cela permettra d'éviter les explants de coller au plastique.
- Alors que l'agarose est liquide, verser environ 2-3 ml sur le fond de deux à trois boîtes de Pétri de 60 mm, et agiter doucement pour s'assurer que le fond est couvert. Ils serviront de plats de dissection et l'empêche d'agarose embryons de coller à la fois les membranes en matière plastique sont retirés.
- Lorsque la gélose a refroidi et durci, la flamme de la pointe d'une pipette 6 "Pasteur jusqu'à ce qu'il fonde en boule, et légèrement toucher à la surface de la gélose dans chaque puits de la plaque de culture. Cela va créer une dépression peu profonde dans laquelle l'explant sera placé.
- Remplir chaque puits de la plaque de culture avec 1X milieu de culture stérile.
- Lorsque la gélose a refroidi et durci, remplissez le plat dissection avec un milieu de culture diluée (0,1 X 0,1 X MMR ou MBS) pour faciliter la séparation de blastomères.
2. Sélection des embryons
- Obtenir des œufs fécondés et enlever le manteau de gelée selon les protocoles standard de 15. Les transférer à 0.5X milieu de culture dans une boîte de Petri de 100 mm.
- Lorsque les embryons atteignent le stade 2-cellules, trier ceux dans lesquels le sillon premier clivage divise la zone légèrement pigmenté dans l'hémisphère animal (figure 1) dans un plat à part. Ce seront les bailleurs de fonds pour les explants. Gardez le reste des 2-cellules d'embryons dans un plat séparé à côté des embryons donateurs tout au long de la procédure pour servir de témoins frères et sœurs de mettre en scène les explants.
3. Préparation des explants
- Placez embryons 5-10 dans un plat de dissection, mais ne fonctionne que sur un seul embryon à la fois.
- Positionner le premier embryon de sorte que la membrane vitelline transparent on peut le voir, il est séparé par un espace libre (espace périvitellin) au-dessus de la surface du pôle animal de l'embryon. En utilisant une force aiguiséps dans la main sous-dominante (la main gauche si on est droitier), saisissez la membrane vitelline au-dessus de l'espace périvitellin. En utilisant une pince aiguisée dans l'autre main, saisir la membrane proche de la première pointe pince et tirez doucement dans des directions opposées à peler la membrane de suite. Faire la saisie initiale à une distance à partir de la cellule qui doit être découpé, de sorte que la cellule cible n'est pas endommagé lors du retrait de la membrane. On peut dire que la membrane a été supprimé parce que l'embryon va aplatir.
- Saisir une cellule voisine avec la pince à la main et sous-dominante d'utiliser cette cellule comme une "poignée" si la cellule doit être découpé n'est pas directement touchée. Avec la pince dans l'autre main, tirez doucement sur les cellules restantes voisins loin du blastomère désiré. Si les cellules médianes, qui partagent le même sort, sont ciblés, ils peuvent être enlevés ensemble comme une paire. Enfin, disséquer l'écart de la «poignée» de cellules.
- Décrochez le blastomère (ou une paire blastomère), avec une solution stérile, Pipette Pasteur en verre, en évitant les bulles d'air et d'aspiration excessive. La pipette peut être polie au feu pour éliminer les bords coupants qui pourraient endommager la cellule, mais nous ne sommes pas systématiquement faire. Placer la pointe de la pipette Pasteur sous la surface du milieu de culture dans un puits de la boîte de culture d'explant, et doucement expulser le blastomère. Il doit glisser dans la dépression peu profonde par gravité. Le blastomère même de plus d'un embryon peuvent être combinés en un seul explant.
- Répétez cette procédure avec les embryons restants dans le plat de dissection, un par un. Après environ 10 embryons, le plat de dissection sera rempli de débris cellulaires. Lorsque cela se produit, changez pour un plat de dissection douce.
- Après toutes les dissections sont faites, vérifiez si les explants sont dans les dépressions peu profondes. Sinon, ils peuvent être doucement poussée dans la dépression avec une boucle de cheveux qui a été stérilisé dans de l'éthanol 70% et séché à l'air.
- Environ une heure après la dissection dernière, enlever les débris surrounding les explants guéris avec une solution stérile, une pipette Pasteur en verre.
- Culture de la plaque d'explants à 14-20 ° C à côté de la boîte de Pétri contenant de la fratrie, embryons témoins. Embryons frères et sœurs indiquera le stade de développement des explants blastomères.
4. Les explants de récolte pour l'analyse
- Récolter les explants lorsque les frères et sœurs atteindre le stade de développement souhaité. Ces explants survivent très bien, même si certaines des cellules se désintégrer. Par conséquent, s'il ya une masse nuageuse dans le puits de culture, l'explorer avec une boucle de cheveux ou une pince pour déterminer si un explant de santé est enterré à l'intérieur.
- Procurez-vous des explants dans un petit volume de solution de culture avec une pipette Pasteur en verre, et doucement les expulser dans un tampon de lyse approprié fixateur ou pour le dosage à effectuer.
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Representative Results
La capacité de ce test pour évaluer précisément le potentiel de développement de la cellule repose sur la dissection sur le blastomère correcte basée sur le sort des cartes 1, 2, 3, 4, 5, 6. Par conséquent, il est essentiel de choisir des embryons avec le motif de la pigmentation correcte au stade 2-cellules, comme illustré à la figure 1, qui par la suite se conformer aux habitudes régulières de clivage, comme l'illustre la figure 2. Si l'on observe les embryons triés qu'ils atteignent l'étape de clivage nécessaire et sépare les embryons présentant des clivages irréguliers, la précision est grandement améliorée. Comme le montre la figure 2, les clivages régulières se produisent souvent sur un seul côté de l'embryon. Ces embryons peuvent être utilisés en tant que donneurs si la cellule donneuse est originaire de la "régulière" côté. Parce que les modèles réguliers de clivage se retrouvent dans nombre d'embryons que la division des cellules, trier environ cinq fois plus nombreux embryons que vous avez l'intention de disséquer. Naturellement fertilized oeufs ont tendance à avoir des clivages plus réguliers que dans les œufs fécondés in vitro. Bien que les schémas de clivage varient beaucoup au sein d'un seul embrayage d'œufs, on peut s'attendre à au moins 10-20% pour être utile pour ce genre de manipulation.
Blastomères peuvent être cultivées seules ou en petits groupes. Lorsque blastomères sont d'abord disséqué (figure 3A), et transféré à la culture ainsi (figure 3B, C), ils sont doux et fragile. Dans notre expérience, blastomères animaux et équatoriales sont beaucoup plus faciles à disséquer et à la culture de végétaux blastomères (figure 3C). Peut-être parce qu'ils sont plus petits, ils sont plus faciles à transférer. Ils semblent aussi à guérir plus rapidement lorsque entaillé avec la pince. Cellules végétales semblent souvent compléter la cytokinèse plus lentement et conservent ainsi des ponts cytoplasmiques des cellules sœurs, en les rendant plus «perméable» lorsque disséqué, et leur membrane cellulaire est plus fragile et plus facile à endommager.Après environ 1-2 heures de culture, le blastomère explanté (s) aura divisé environ 4 fois et dépouillées plupart des débris restant de cellules endommagées voisins (figure 3D). Après 20 heures, ils forment de petits boules solides de cellules (figure 3E). Alors que certains peuvent être enterrés dans les débris, souvent une masse en bonne santé peut être trouvée (figure 3E, à gauche).
Bien que les explants sont petits, ils survivent traitement pour l'hybridation in situ ainsi que les explants plus couramment utilisés capitalisation des animaux, ce qui permet de contrôler l'expression des gènes plus tard. Dans l'expérience le montre la figure 4A, deux blastomères dorsaux (D1.1) ou deux blastomères ventraux (V1.1) ont été disséqués au stade de 16 cellules et cultivées dans 1X MBS à 14 ° C jusqu'à ce que les embryons frères et sœurs atteint un stade précoce de plaques neurales (ST12-13; environ 20-22 heures après dissection). Chaque échantillon a été testé pour l'expression d'un gène plaque neurale zygotique (Sox2 </ Em>) par hybridation in situ (le produit de réaction bleu). Ce test démontre que la majorité des blastomères animaux dorsales, qui sont des précurseurs de la plaque neurale, peut exprimer Sox2 de manière autonome, c'est à dire sans signalisation supplémentaires provenant d'autres régions de l'embryon. Ces explants qui n'expriment pas Sox2 pourrait avoir été mal identifiés au moment de la dissection. En revanche, aucun des blastomères animaux ventrales, qui sont des précurseurs de l'épiderme ventral, expresse Sox2. Ainsi, nous concluons que les animaux dorsale blastomères ont une capacité intrinsèque à former le tissu neural, alors que les blastomères animaux ventrales pas. A noter que certains des explants D1.1 ont également eIongated, une morphologie indicatif de la formation du mésoderme dorsal; ces blastomères sont également fatale pour former la notocorde dans l'embryon intact 3, et dans la culture des explants exprimer une protéine marqueur notocorde 10. Blastomères destins intrinsèques peut être altéré d par micro-injection d'ARNm avant (gain-de-fonction) ou oligonucléotides antisens morpholino (OM; perte de fonction). Dans la figure 4B, l'effet de modifier les niveaux endogènes d'un gène exprimé la mère de neurones, foxD5 16, 17, est testé. Lorsque le niveau endogène de FoxD5 a été augmentée par l'injection d'ARNm foxD5 dans les blastomères précurseurs de 8 cellules de V1.1 (rangée du bas), la majorité des explants V1.1 (culture de st 12-13) exprimé Sox2. Inversement, lorsque le niveau endogène de FoxD5 a été réduit par l'injection d'OM dans les blastomères précurseurs de cellules de 8-D1.1 (rangée du haut), à seulement quelques D1.1 explants (cultivées à st 12-13) exprimé Sox2 (à comparer à rangée du haut de la figure 4A). Ces expériences montrent que l'expression de la mère de foxD5 joue un rôle dans la capacité intrinsèque de blastomères dorsaux d'acquérir un destin neuronal.
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Figure 1. Patrons de pigmentation de 2-cellules d'embryons à partir d'œufs fécondés naturellement. Le sillon premier clivage est indiqué par une flèche. A) Un exemple d'un embryon qui ne devraient pas être utilisés pour identifier les blastomères à un stade ultérieur, car la région légèrement pigmentée de l'hémisphère animal de l'embryon est contenue principalement dans une cellule (sur la gauche). Depuis le sillon premier clivage prédit le plan sagittal médian de l'embryon, la zone légèrement pigmentée de cet embryon ne sera pas identifier dorsale. B) Deux exemples d'embryons qui devraient être triés pour des cultures d'explants. Dans les deux cas, la zone légèrement pigmentée de l'hémisphère animal (*) est traversée par le sillon de clivage d'abord. L'embryon sur la gauche est trop tôt dans le cycle de la première cellule, et la région faiblement pigmentée n'est visible que dans environ 25% de la surface de la cellule. L'embryon sur la droite se rapproche de la fin du premier cycle cellulaire, et le pigment s'est déplacé ventrally si les moitiés dorsale des deux cellules sont plus légers. En conséquence, à un stade ultérieur des cellules animales légèrement pigmentées prédire dorsale (d) et les cellules animales sombre pigmentées prédire ventrale (v).
Figure 2. Exemples d'embryons en stade de division à partir d'œufs fécondés naturellement. Tous les embryons sont orientés avec le pôle animal vers le lecteur, dorsale à la partie supérieure. A) 4-cellules d'embryons. L'embryon sur la gauche vient d'entrer dans le cycle de la deuxième cellule de sorte que le clivage sillons sont peu profonds. L'embryon sur le droit a presque achevé le cycle de la deuxième cellule de sorte que le clivage sillons sont plus profonds et les cellules semblent plus arrondi. Les flèches noires indiquent le sillon de clivage d'abord, et les flèches rouges indiquent le sillon de clivage seconde. B) embryons à 8 cellules. L'embryon est sur la gauche est trop tôt du cycle cellulaire troisième et l'embryon sur la droite est prochela fin du cycle cellulaire troisième. C) 16-cellules d'embryons. C 'est un exemple de clivages irréguliers à éviter. C "est un exemple de clivages réguliers sur la face ventrale, mais irrégulière sur la face dorsale. C'' 'est un exemple de plus de clivages réguliers sur la face dorsale, mais pas sur la face ventrale. C'''' est un exemple des clivages réguliers à la ligne médiane, mais pas latéralement. D) 32 cellules d'embryons. D 'est un exemple de clivages réguliers sur la face ventrale, mais irréguliers sur la face dorsale. D'' est un exemple de clivages réguliers sur la dorsale côté, mais pas sur la face ventrale. D'' 'est un exemple de clivages régulières sur le côté droit, mais clivages plus irrégulières sur le côté gauche. E) 64-cellules embryonnaires. Pour une représentation schématique de ces étapes, s'il vous plaît se référer à la série mise en scène Nieuwkoop et Faber, qui peut être trouvé en ligne ( http://www.xenbase.org/anatomy/alldev.do ).
Les explants Figure 3. Partir de 16 cellules d'embryons à partir d'œufs fécondés naturellement. A) Un blastomère ventral animaux peu après dissection. Flèche indique restes de la "poignée" de cellules. B) Un blastomère ventral animaux transfère sur une culture qui a divisé une fois. C) Un blastomère ventral végétale peu de temps après la dissection. Par rapport aux blastomères animaux, ceux-ci sont plus grandes et plus difficiles à manipuler. D) Deux ventrales explants blastomères animaux, 2 h après dissection, ont divisé environ quatre fois. L'explant gauche est vu de l'original, la surface extérieure pigmentée du blastomère, l'explant droit est perçu à partir de l'original, non pigmenté surface intérieure du blastomère. E) Deux ventrales explants blastomères animaux cultivés pendant 24 heures. L'explant gauche est assis sur un lit de débris cellulaires (flèches), alors que l'explant droite est libre de tout débris. Toutes les images sont à 50X magnification.
Figure 4. Lors de l'analyse d'hybridation in situ de l'expression génique dans des explants provenant de 16 cellules blastomères disséqués à partir d'œufs fécondés naturellement. A. L'embryon de 16 cellules sur la gauche illustre la paire blastomère dorsal (D1.1) qui a été explantées pour les résultats en la rangée du haut, et la paire blastomère ventral (V1.1) qui a été explanté les résultats dans la rangée du bas. Disséqués paires blastomères d'embryons non injectée ont été placés dans des MBS 0.1x dans des puits de culture et incubées à 14 ° C pendant environ 20 h. Ils ont été recueillis dans des tubes de fixateur et traitées par hybridation in situ de l'expression d'un gène zygotique neurones, Sox2. Blastomères d'embryons B. stade 8 cellules ont été injectés bilatéralement soitavec foxD5 OM, pour réduire l'expression endogène dans blastomères dorsaux, ou avec foxD5 ARNm pour augmenter l'expression endogène dans blastomères ventraux. Lorsque les embryons injectés atteint le stade de 16 cellules (20-30 min plus tard), les paires de blastomères ont été disséqués, analysés et cultivée par hybridation in situ comme dans A. Le nombre d'explants qui expriment Sox2 est significativement réduite dans D1.1 explants qui ont été injectés avec foxD5 OM (à comparer rangée du haut en A). Le nombre d'explants qui expriment Sox2 est significativement augmentée chez les explants V1.1 qui ont été injectés avec foxD5 ARNm (à comparer à rangée du bas en A). Cliquez ici pour agrandir la figure .
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Discussion
Les étapes les plus importantes pour la culture réussie des blastomères individuels sont les suivants: 1) identifier correctement le blastomère d'intérêts; 2) le maintien d'un stérile, culture saine; 3) les cellules de dissection à la partie appropriée du cycle cellulaire, et 4) l'élaboration du manuel nécessaire dextérité pour éviter des dommages lors de la dissection et de transférer à la culture bien.
Pour manipuler blastomères spécifiques, il est essentiel d'être capable d'identifier les axes cardinaux. Dans les embryons de xénope, la face dorsale peuvent être identifiés par trois méthodes: (1) marque le point d'entrée du sperme avec un colorant vital 18, 19, (2) de basculement fécondés in vitro et le marquage des œufs d'un côté 18, 19, ou (3) sélection d'embryons au stade 2-cellule dans laquelle le premier sillon de clivage divise la région légèrement pigmentée dans l'hémisphère animal 20, 21. Nous utilisons la troisième méthode, qui identifie avec précision les blastomères de fertilisants naturelsed 16 cellules d'embryons dans environ 90% des cas, 20, 21. Lors de la fécondation, la pigmentation hémisphère animal commence à se contracter vers le point d'entrée du sperme sur la face ventrale, provoquant la région dorsale des animaux à devenir de moins pigmentée dans la majorité des embryons (Figure 1). Il existe des variations considérables dans le degré de cette région légèrement pigmentée à travers embrayages et même dans les couvées d'œufs de xénope. Si le sillon premier clivage divise cette zone plus claire à parts égales entre les deux cellules filles, alors que zone plus claire peut être utilisée comme indicateur de la face dorsale, et le sillon de clivage première indique le plan sagittal médian. Si le sillon premier clivage sépare les filles dans une cellule sombre et une cellule lumière, ne pas l'utiliser pour l'explant parce que la pigmentation à des stades ultérieurs ne seront pas identifier avec précision la face dorsale. Des études antérieures ont montré que dans ces sortes d'embryons sillon de clivage d'abord resté un marqueur pour til mi-sagittal tandis que la région légèrement pigmentée n'est plus indiqué sur la face dorsale 20, 21. Les embryons peuvent également être choisis au début du clivage à 4 cellules (embryon gauche de la figure 2B), lorsque le premier et le second sillons au pôle végétatif peuvent encore être distingués: le premier sillon doit être complet et le second sillon pas encore terminé. Si, en revanche, on attend jusqu'à la fin de la phase 4 cellules pour sélectionner des embryons (embryons droite dans la figure 2B), le clivage premier et deuxième sillons ne peuvent plus être distingués, et les cellules légèrement pigmentées peuvent être les dorsales que dans environ 70% des embryons 20, 21. Ceci rendra le ciblage spécifiques blastomères beaucoup moins précis. Il convient de noter que le pourcentage d'embryons dans lequel le sillon premier clivage divise la région faiblement pigmentée varie beaucoup à travers embrayages. Dans notre expérience, ils peuvent représenter <50% des oeufs dans un embrayage à> 80% Des œufs par couvée. Malgré tout, il ya presque toujours assez d'oeufs dans une couvée d'oeufs sains qui répondent à ce critère de soutenir une expérience explant.
Les deux milieux de culture recommandés (RMM, MBS) sont pratiquement interchangeables, les préférences des différents laboratoires sont principalement historiques. ROR peut être stocké sous forme de solution 10X pour un an ou plus. MBS a une durée de conservation plus courte, car elle est tamponnée avec du bicarbonate. Parce que les embryons et les explants peut succomber à une infection bactérienne sans protection gelée et membranes vitellines, des pinces et des milieux de culture doivent être stériles. Si explants ne survivent pas bien, antibiotique peut être ajouté au milieu de culture (par exemple, la gentamicine 0,1%). Les solutions contenant la gentamicine ont une courte durée de conservation, et devrait donc être frais le jour où ils doivent être utilisés. Les débris cellulaires contient des protéases qui peuvent endommager les explants non protégés, et favorise la croissance bactérienne. Par conséquent, il devrait être removed des puits de culture des explants après avoir eu une chance de guérir.
Dissections blastomères sont effectuées dans un milieu de culture dilué (0,1 x 0,1 x MBS ou ROR), afin de réduire la résistance de la cellule à cellule adhérences. Pendant les étapes de clivage de Xenopus, l'adhésion cellulaire se fait essentiellement par les cadhérines calcium-/magnesium-dependent. Par conséquent, il n'est pas nécessaire d'utiliser la dissociation enzymatique, en fait, cela devrait être évité, car il élimine les protéines de surface qui peut être important dans les événements la détermination du destin. Parce que les cellules embryonnaires provenant de différents lots d'œufs adhèrent avec des forces différentes, la dilution du milieu de dissection peut être nécessaire d'ajuster sur une base ad hoc. Si les cellules sont trop adhérente à disséquer sans les déchirer, abaisser la concentration du milieu de dissection par étapes à partir de 0,1 X. A l'inverse, si les cellules se désagréger lorsque la membrane vitelline est enlevée et sont très perméable, augmenter la concentration de la dissection support pas à pas. Cependant, ne pas utiliser les médias calcium-/magnesium-free parce que les cellules deviennent trop fragiles pour transférer aux puits de culture. Séparation réussie de blastomères dépend également du moment au cours du cycle cellulaire on effectue la dissection. Comme le montre la figure 2, au début du cycle cellulaire le clivage sillons sont peu profonds et les blastomères sont aplaties. Plus tard dans le cycle de la coupure sillons sont plus profonds et les cellules sont plus arrondis. Au début du cycle cellulaire, il ya des ponts cytoplasmiques qui provoquent une fuite cytoplasmique cas de bris. Par conséquent, les cellules sont plus facilement disséquée tard dans le cycle cellulaire. 4-cellules d'embryons à 8 cellules, embryons et les cellules végétales à toutes les étapes sont plus difficiles à disséquer parce que les ponts cytoplasmiques persister plus longtemps. On peut s'attendre à un taux de mortalité élevé pour ces explants, ce qui signifie qu'on doit effectuer plus de dissections pour récupérer un échantillon de taille raisonnable. On peut attendre le début du sillon de clivage suivant pour commencer le dissection de ces cellules afin de s'assurer que les ponts cytoplasmiques sont fermés. Alors que blastomères simples prises de 8 - et 16-cellules d'embryons survivent bien dans la culture, dans notre expérience âgées blastomères réussissent moins bien que les cellules individuelles. Bien que nous ne connaissons pas la cause de cela, la survie des explants plus blastomères peuvent être améliorées en disséquant plusieurs (2-6) du blastomère même à partir d'embryons différents et de culture les réunir dans une seule culture puits 10, 13, 14.
Cette procédure nécessite de la pratique et une certaine dextérité manuelle. Parce que le temps entre les clivages dépend de la température, il est commode de conserver des embryons à 14-16 ° C pour ralentir clivage et laisser plus de temps pour effectuer les dissections. Cependant, les embryons ne tolérera pas des températures inférieures à 14 ° C. Le premier défi de cette procédure est de retirer la membrane vitelline. Il est préférable de ne pas passer à la dissection blastomère jusqu'à ce que cette première étape est maîtrisée. Lorsque la dissectionle blastomère, la "poignée" cellule est susceptible de fuir et tomber en morceaux. Ce n'est pas un problème car une fois que toutes les autres cellules sont décollées de la cellule souhaitée, la "poignée" cellule peut être retiré avec une pince. Les débris cellulaires poignée ainsi que d'autres débris tombent habituellement loin quand le blastomère est transféré vers le puits de culture (figure 3B). Blastomères coller avidement en plastique, donc à utiliser des pipettes en verre seulement pour les transférer. Utiliser une pression de succion minime sur la cellule, car il peut se désintégrer par les forces de cisaillement dans la pipette. Aussi, évitez de bulles d'air dans la pipette et assurez-vous que la pointe de la pipette est en dessous de la surface du milieu de culture lorsque l'explant est expulsé parce que les cellules va exploser si elles touchent une interface air-eau.
Le protocole décrit ici utilise des embryons non manipulés comme donneurs pour les explants et des médias de sel simples pour la culture. Ceux-ci permettent de tester la capacité intrinsèque de l'explant à express destins particuliers. Cette méthode peut être expérimentalement étendue de deux façons. Tout d'abord, les milieux de culture peuvent être complétés par de signalisation / facteurs de croissance pour vérifier si ces molécules peuvent provoquer l'explant d'exprimer destins alternatifs. Deuxièmement, l'expression des gènes des embryons donateurs peuvent être modifiés par l'injection d'ARNm soit (gain-de-fonction) ou oligonucléotides antisens morpholino (perte de fonction) en précurseurs spécifiques avant la dissection blastomère. Cela peut être fait au stade 1-cellule, ou d'une manière plus ciblée à 1-2 divisions cellulaires avant la dissection. Avec ces approches, on peut tester si un gène particulier fourni de manière exogène provoque un blastomère d'acquérir un autre sort, ou si un gène particulier endogène est nécessaire pour le blastomère d'exprimer son destin autonome (par exemple, la figure 4B). Ce sont de puissants approches expérimentales, car ils éliminent l'influence confusion des autres cellules et la signalisation CEnters présents dans l'embryon intact.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le GWU Harlan bourse de soutien de Paaqua Grant et le GWU Luther Rice bourse de soutien de Mona Herold. Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation subvention MCB-1121711.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-38 | Course (12 μm), for major repairs of forceps tips |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-46 | Medium (3 μm), for fine sharpening of forceps tips |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-54 | Fine (0.3 μm), for polishing of forceps tips |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | #11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. Corrosive resistant so they can be autoclaved. |
| Gentamicin solution | Sigma | G1397 | Add to medium on same day as use |
References
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