Summary
Das Schicksal einer einzelnen embryonalen Zelle kann durch vererbte Moleküle und / oder durch Signale von benachbarten Zellen beeinflusst werden. Mit Hilfe Schicksal Karten der Spaltung der Bühne Xenopus Embryos können einzelne Blastomeren für Kultur isoliert identifiziert werden, um die Beiträge der ererbten Moleküle gegenüber Zell-Zell-Interaktionen zu beurteilen.
Abstract
Schicksal Karten, von Abstammungslinie Tracing alle Zellen eines Embryos konstruiert, offenbaren die Gewebe von jeder Zelle des Embryos abstammen. Obwohl das Schicksal Karten sehr nützlich sind für die Identifizierung der Vorläufer eines Organs und zur Erläuterung der Entwicklungsweg, mit denen die Nachkommen Zellen bevölkern dieses Organs im normalen Embryo, sie nicht zeigen, das volle Entwicklungspotenzial einer Vorläuferzelle oder Identifizierung der Mechanismen, mit denen sein Schicksal bestimmt. Um das Schicksal der Zelle Engagement testen, vergleicht man einer Zelle normalen Repertoire von Nachkommen im intakten Embryo (das Schicksal Karte) mit denen nach einer experimentellen Manipulation ausgedrückt. Wird die Zelle Schicksal fixiert (gebunden), unabhängig von der umgebenden zellulären Umgebung, oder ist es durch externe Faktoren von seinen Nachbarn zur Verfügung gestellt beeinflusst? Mit den umfassenden Schicksal Karten des Xenopus Embryo, beschreiben wir, wie zu identifizieren, zu isolieren und Kultur einzigen Furchungsstadium Vorläufer namens Blastomeres. Dieser Ansatz erlaubt es, festzustellen, ob diese frühen Zellen mit dem Schicksal sie in ihrer normalen Umgebung erwerben im intakten Embryo, erfordern Interaktionen mit ihren Nachbarzellen begangen werden, oder kann auf alternative beeinflusst Schicksale auszudrücken, wenn auf andere Arten von Signalen ausgesetzt werden.
Introduction
Xenopus laevis Embryonen wurden ausführlich die Mechanismen, durch die embryonalen Zellen erhalten ihre spezifische Schicksal, weil ihre Eier groß genug, um mikrochirurgische Ansätze erlauben identifizieren genutzt. Zusätzlich entwickeln sie extern ohne Nahrungsergänzung des Kulturmediums weil jede Zelle enthält einen reichen intrazellulären Zufuhr von Eigelb Blutplättchen, die eine intrinsische Energiespeicher bereitzustellen. Ein wichtiges Asset für die Untersuchung der Mechanismen, mit denen das Schicksal der Zelle bestimmt wird, ist die umfassende Reihe von Schicksal Karten der Spaltung der Bühne Blastomeren (von 2 - bis 32-Zell-Stadium) 1, 2, 3, 4, 5, 6. Diese Karten wurden durch Mikroinjektion ein detektierbares Molekül in eine einzige, identifizierbare Blastomere und Überwachen später in der Entwicklung, welches Gewebe durch das markierte Nachkommen bestückt sind konstruiert. Konsequente Schicksal Karten sind möglich, da die Hauptachsen der Embryonen zuverlässig in vielen embry identifiziert werdenos. Erstens, in allen Wildtyp Embryonen das Tier Hemisphäre ist pigmentiert, während die pflanzlichen Hemisphäre ist es nicht. Zweitens verursacht der Eintrag der Spermien bei der Befruchtung einer Kontraktion des Tieres Halbkugel Pigmentierung Richtung Zukunft Bauchseite, in vielen Embryonen eine Pigmentierung Unterschied daher kann zwischen dorsalen und ventralen Seiten diskriminieren. Dritte, nähert sich die erste Teilungsfurche Mitte der Sagittalebene in den meisten Embryonen und somit verwendet werden können, um die rechte und linke Seite des Embryos zu identifizieren. Das Schicksal Karten stützen sich auch auf die Tatsache, dass natürlich befruchtete Eier häufig spalten in regelmäßigen Mustern, die jeweils Blastomeren identifizierbaren über eine große Population von Embryonen zu machen. Während es Variabilität innerhalb und zwischen Gelege bezüglich Pigmentierung und Spaltmuster mit Auswahlverfahren hierin beschriebenen Zellen ermöglicht vorgeschriebener Schicksalen um mit etwa 90% Genauigkeit identifiziert werden.
Zellschicksale kann abzuschreckenabgebaut während der Embryogenese durch verschiedene Mechanismen. Intrinsische Faktoren wie differentiell geerbt cytoplasmatischen mRNAs oder Proteine, um verschiedene Aspekte der frühen Strukturieren beitragen. Beispielsweise bestimmen spezifischen mütterlichen mRNAs, welche Zellen der Keimbahn beitragen, sich das Entoderm, oder dazu beitragen, den dorsalen Körperachse (bewertet in 7). Extrinsische Faktoren lokal von benachbarten Zellen oder entfernter aus einer embryonalen Meldezentrale vorgesehen, sind verantwortlich für die Bildung spezifischer Gewebetypen und Strukturieren fast jedes Organsystem. Beispiele der Signalisierung Zentren gehören die Veranstalter / Knoten in der Gastrula, die neuronalen Ektoderm und Muster das Mesoderm induziert, und die Zone polarisierender Aktivität, dass die Muster der anterior-posterioren Achse des Gliedmaßenknospe. Obwohl das Schicksal Karten identifizieren die Vorläufer der verschiedenen Organe und zeigen die Entwicklungsweg von ihren Nachkommen im normalen Embryo entnommen, können sie nicht zwischen intrinsischen unterscheidenund extrinsische Einflüsse auf den Zellen. Sie haben auch nicht offenbaren die volle Entwicklungspotential einer Zelle, deren Nachkommen zu differenzieren in der komplexen Signalisierung Umfeld des Embryos. Zwei Versuchsansätze kann getestet werden, ob einer Zelle Schicksal durch intrinsische Faktoren bestimmt wird oder anschließend durch äußere Faktoren beeinflusst: 1) Transplantation der Zelle auf eine neuartige Lage im Embryo, oder 2) Entfernen der Zelle aus dem Embryo durch Kultur in gefolgt die Abwesenheit von exogener Signale.
Sowohl experimentelle Ansätze wurden in Xenopus machbar, weil die Zellen groß genug, um manuell getrennt werden sollen. Zum Beispiel haben zahlreiche Studien einzelner Zellen aus Embryonen (um Zell-Zell-Wechselwirkungen zu ändern) oder transplantierten Zellen, neue Stellen in Host Embryonen für Schicksal Änderungen (in 7 bewertet, 8, 9) zu testen gelöscht. Darüber hinaus ist die zweite Ansatz von Explantieren kleine Zahl von Zellen, die aus unterschiedlichen Bereichen des Embryos into Kultur zur induktiven Gewebeinteraktionen in Abwesenheit von exogenen Faktoren aufzuklären ist möglich, weil die Zellen des Embryos Xenopus mit einem intrazellulären Nährstoffdepot die Dotter Blutplättchen gefüllt sind. Daher können sie für einige Tage in einem definierten Medium ohne Nährwert Salz oder Wachstumsfaktor Ergänzung des Kulturmediums kultiviert werden. Wir haben diesen Ansatz verwendet zu zeigen, dass dorsalen Tier Blastomeren haben eine autonome Fähigkeit, neuronale und dorsalen mesodermalen Gewebe aufgrund mütterlich vererbten mRNAs 10, 11 zu produzieren, und andere haben gezeigt, dass Mesoderm Spezifikation 32-Zell-Blastomeren beruht sowohl auf intrinsische und extrinsische Informationen 12 . Ein Vorteil der Kultivierung von Zellen als Explantate ist, dass das Medium auch mit definierten Signalisieren Faktoren zu bestimmen, welche Zelle zu Zelle Kommunikationspfad könnte das Schicksal des explantierten Zelle 12, 13, 14 beeinflussen ergänzt werden. Darüber hinaus kann ein injizieren Blastomere prior die Kultur mit mRNA über-express eines Gens, oder mit anti-sense-Oligonukleotide, die Übersetzung von endogenen mRNAs zu verhindern. Diese, Verstärkungs-und Verlust-of-function-Analysen können Moleküle identifizieren, welche für eine autonom ausgedrückt Schicksal erforderlich. Um das Schicksal des Explantats zu analysieren, kann die Identifikation von spezifischen Zelltypen nach Standard Genexpression (zB In-situ-Hybridisierung, RT-PCR) und immuncytochemische Assays durchgeführt werden. Dieses Protokoll bietet eine einfache, aber leistungsstarke Möglichkeit, zwischen innerer und äußerer Mechanismen, wie eine embryonale Zelle in bestimmten Geweben entwickelt Regulierung unterscheiden.
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Protocol
Ein. Vorbereitung des Instruments, Kultur, Medien und Gerichte
- Schärfen vier Zangenelemente mit Alumina Schleiffolie. Tun Sie dies unter einem Binokular, um die Größe der Spitze zu überwachen. Eine Zange dient als ein Back-up für den Fall einer Spitze wird während des Verfahrens geschädigt. Autoklavieren alle vier Zangen und lagern in einem sterilen Behälter.
- Stellen Sie 500 ml jeweils 0,1 X und 1,0 X Kulturmedium (entweder Marcs Modified Ringers [MMR] oder Modified Barths Saline [MBS]; Rezepten in 15) und Filter zu sterilisieren. Wir verwenden routinemäßig MBS (1X = 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 5 mM HEPES [pH 7,8], 2,5 mM NaHCO 3). Lagerung bei 14-18 ° C für Monate.
- Einen 2% Agaroselösung in Kulturmedium (2 g Agarose-Elektrophorese Grade in 100 ml 1X Kulturmedium in einer Schraubkappe Glasflasche). Autoklavieren eine Agarose aufzulösen. Dies kann bei 4 ° C über Monate gelagert werden, und der Mikrowelle, um die Agarose zu verflüssigen, wenn es weiter erforderlich ist.
- Während die Agarose flüssig ist, gießen etwa 0,5 ml auf den Boden jeder Vertiefung einer sterilen 24-Well-Kulturplatte. Dadurch werden die Explantate vom Kleben an der Kunststoff verhindern.
- Während die Agarose flüssig ist, gießen Sie etwa 2-3 ml auf den Boden von zwei bis drei 60 mm Petrischalen und behutsam schwenken, um sicherzustellen, dass der Boden bedeckt ist. Diese werden als Dissektion Gerichte servieren und die Agarose verhindert Embryonen aus Festhalten an der Kunststoff einmal ihre Membranen entfernt werden.
- Wenn die Agarose wurde abgekühlt und ausgehärtet, Flamme die Spitze eines 6 "Pasteurpipette bis es schmilzt zu einer Kugel, leicht berühren und ihn auf der Oberfläche der Agarose in jede Vertiefung der Kulturplatte. Dadurch wird eine flache Vertiefung schaffen, in die das Explantat platziert wird.
- Füllen Sie jedes Well der Kulturschale mit 1X sterile Kulturmedium.
- Wenn die Agarose abgekühlt und ausgehärtet ist, füllen die Dissektion Schale mit verdünnter Kulturmedium (0,1 x MMR oder 0,1 x MBS) an Blastomeren Trennung zu erleichtern.
2. Selektion von Embryonen
- Erhalten befruchteten Eier und entfernen Sie das Gelee Mäntel nach Standardprotokollen 15. Übertragen auf 0,5 X Kulturmedium in einer 100 mm Petrischale.
- Wenn die Embryonen 2-Zellen-Stadium erreichen, zu sortieren, in denen der erste Teilungsfurche halbiert den leicht pigmentiert Bereich in dem Tier Halbkugel (Abbildung 1) in einem separaten Teller. Diese werden die Geber für die Explantate sein. Halten Sie die verbleibenden 2-Zell-Embryonen in einem separaten Teller neben den Spenderembryonen während des gesamten Verfahrens als Geschwister Kontrollen dienen dazu, die Explantate zu inszenieren.
3. Herstellung Explantate
- Zeigen 5-10 Embryonen in einer Dissektion Gericht, aber nur auf einer Embryos gleichzeitig arbeiten.
- Positionieren des ersten Embryo, so dass die transparente Dotterhaut ersichtlich, es ist durch einen freien Bereich (perivitellinen Raum) über der Oberfläche des Tieres Pol des Embryos getrennt. Mit einem geschärften Kraftps in einem der Subdominante Hand (linke Hand, wenn man rechts übergeben), fassen Sie die Dotterhaut über dem perivitellinen Raum. Verwendung einer geschärften Pinzette in der anderen Hand die Membran dicht an dem ersten Zange Spitze, und sanft in entgegengesetzten Richtungen ziehen, um die Membran Schale entfernt. Machen den anfänglichen Griff in einem Abstand von der Zelle, die zu seziert werden, so dass die Zielzelle nicht während der Entfernung der Membran beschädigt wird. Man kann sagen, dass die Membran entfernt wurde, weil der Embryo zu glätten.
- Schnappen Sie eine Nachbarzelle mit der Zange in der Subdominante Hand und diese Zelle als "Griff", so die Zelle zerlegt werden nicht direkt berührt. Mit der Zange in der anderen Hand, ziehen die verbleibenden benachbarten Zellen weg von der gewünschten Blastomere. Wenn Mittellinie Zellen, die das gleiche Schicksal teilen, ausgerichtet sind, können sie als Paar zusammen entfernt werden. Schließlich sezieren entfernt den "Griff" Zelle.
- Nehmen Sie den Blastomeren (oder Blastomeren Paar), mit einem sterilen, Glas Pasteurpipette luftblasenfrei und übermäßige Absaugung. Die Pipette kann feuerpolierte um scharfe Kanten, die die Zelle schädigen können zu entfernen, aber wir wissen nicht routinemäßig tun. Setzen Sie die Spitze des Pasteurpipette unter der Oberfläche des Kulturmediums in einer Vertiefung der Explantat Kulturschale und sanft vertreiben die Blastomeren. Es sollte in der flachen Mulde durch die Schwerkraft gleiten. Dasselbe Blastomere aus mehr als einem Embryo kann in einem einzigen Explantat kombiniert werden.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang mit den restlichen Embryonen bei der Dissektion Gericht, one-by-one. Nach etwa 10 Embryonen, wird die Dissektion Gericht mit Zelltrümmern gefüllt werden. Wenn dies auftritt, in ein frisches Dissektion Schale zu verändern.
- Nachdem alle Sektionen fertig sind, überprüfen, ob die Explantate in den flachen Vertiefungen sind. Wenn nicht, können sie leicht in die Vertiefung werden mit einem Haar-Schleife, die in 70% Ethanol und luftgetrocknet wurde sterilisiert geschoben.
- Etwa eine Stunde nach der letzten Dissektion, entfernen Sie Schmutz surrounden die geheilt Explantate mit einer sterilen, Glas Pasteur Pipette.
- Kultur die Platte von Explantaten bei 14-20 ° C neben dem Petrischale mit den Geschwistern, Kontrolle Embryonen. Sibling Embryonen zeigt den Stand der Entwicklung der Blastomeren Explantate.
4. Harvesting Explantate für die Analyse
- Ernten Sie die Explantate, wenn die Geschwister die gewünschte Entwicklungsstadium erreichen. Diese Explantate überleben recht gut, selbst wenn einige der Zellen zerfallen. Deshalb, wenn es eine trübe Masse auch in der Kultur, erkunden es mit einem Haar-Schleife oder einer Zange, um zu bestimmen, wenn ein gesunder Explantat innerhalb begraben ist.
- Abzuholen Explantate in einem kleinen Volumen von Kultur-Lösung mit einer Pasteurpipette aus Glas, und sanft auszustoßen sie in einem Fixiermittel oder Lysepuffer entsprechenden für den Assay durchgeführt werden.
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Representative Results
Die Fähigkeit dieses Tests, genau zu beurteilen das Entwicklungspotenzial der Zelle beruht auf sezieren die korrekte Blastomeren über das Schicksal der Basis Karten 1, 2, 3, 4, 5, 6. Daher ist es entscheidend, Embryonen mit der korrekten Pigmentierung Muster an der 2-Zellen-Stadium zu wählen, wie in Abbildung 1, die anschließend entsprechen regelmäßigen Spaltmuster, wie in 2 veranschaulicht dargestellt. Wenn man die sortierten Embryonen beobachtet, wie sie die erforderliche Furchungsstadium erreichen und trennt die Embryonen zeigt unregelmäßige Spaltungen, wird die Genauigkeit deutlich verbessert. Wie in 2 dargestellt, regelmäßige Spaltungen treten häufig nur auf einer Seite des Embryos. Diese Embryonen können als Spender verwendet werden, wenn der Spender-Zelle stammt aus der "normalen" Seite. Weil regelmäßige Spaltmuster in weniger Embryonen die Zellteilung geht, sort etwa fünfmal so viele Embryonen gefunden, wie Sie zu sezieren wollen. Natürlich fertilized Eiern neigen dazu, mehr reguläre Spaltungen als in vitro befruchteten Eizellen haben. Obwohl Spaltmuster viel variieren innerhalb einer einzigen Gelege kann man erwarten, mindestens 10-20% zu sein für diese Art der Manipulation nützlich.
Blastomeren können kultiviert allein oder in kleinen Gruppen. Wenn Blastomeren ersten präpariert (Abb. 3A), und an das Kulturvertiefung (3B, C), sie sind weich und instabil. In unserer Erfahrung sind Tier-und äquatorialen Blastomeren viel einfacher zu sezieren und Kultur als pflanzliche Blastomeren (3C). Vielleicht, weil sie kleiner sind, sind sie leichter zu übertragen. Sie scheinen auch schneller zu heilen, wenn sie mit der Zange geklaut. Vegetal Zellen scheinen oft Zytokinese langsamer und komplettieren so behalten cytoplasmatische Brücken mit Schwester-Zellen, wodurch sie "leaky", wenn seziert und ihre Zellmembran ist zerbrechlich und leichter zu Schaden.Nach etwa 1-2 Stunden in Kultur werden die explantierten Blastomere (e) etwa 4-mal unterteilt sind und abgestoßen meisten der restlichen Verunreinigungen von beschädigten benachbarten Zellen (Abb. 3D). Nach 20 hr, bilden sie klein, robust Kugeln von Zellen (3E). Während einige in Schutt und Asche begraben werden kann, oft eine gesunde Masse gefunden (3E, links).
Obwohl die Explantate klein sind, überleben sie Verarbeitung für die in situ-Hybridisierung sowie der häufig verwendeten animal cap Explantate, die man zu einem späteren Zeitpunkt Genexpression zu überwachen. In dem Experiment in 4A gezeigt, wurden zwei dorsalen Blastomeren (D1.1) oder zwei ventralen Blastomeren (V1.1) in der 16-Zellen-Stadium seziert und kultiviert in 1X MBS bei 14 ° C bis zum Erreichen frühen Embryonen nebengeordneten Neuralplatte Stufen (ST12-13, etwa 20-22 Stunden nach Sezieren). Jede Probe wurde für die Expression eines Gens zygotischen Neuralplatte (Sox2 getestet </ Em>) durch in situ Hybridisierung (die blaue Reaktionsprodukt). Dieser Assay zeigt, dass die Mehrheit der dorsalen tierischen Blastomeren, die Vorstufen der Neuralplatte sind, können Sox2 autonom exprimieren, dh ohne zusätzliche Signalisierung von anderen Regionen des Embryos. Diese Explantate, die nicht exprimieren kann Sox2 falsch zum Zeitpunkt der Dissektion identifiziert haben. Im Gegensatz dazu keine der ventralen tierischen Blastomeren, die Vorstufen des ventralen Epidermis, Express Sox2 sind. Daraus schließen wir, dass dorsalen Tier Blastomeren eine intrinsische Fähigkeit, neuronale Gewebe zu bilden haben, während die ventralen Tier Blastomeren nicht tun. Man beachte, dass einige der D1.1 Explantate wurden ebenfalls eIongated, eine Morphologie anzeigt dorsalen Mesodermbildung; diese Blastomeren auch fated das Notochord in der intakten Embryo 3 zu bilden, und in Explantatkultur express ein Notochord Markerprotein 10. Blastomere inneren Schicksale kann altere d nach vorheriger Mikroinjektion von mRNAs (gain-of-function) oder anti-sense Oligonukleotide Morpholino (MOs; loss-of-function). In 4B wird die Wirkung der Änderung der endogenen Niveaus eines maternal ausgedrückt neuronalen Gen foxD5 16, 17, getestet. Wenn der endogenen Konzentration FoxD5 durch Einspritzen foxD5 mRNAs in die 8-Zell-Vorläufer Blastomeren V1.1 (untere Reihe) erhöht wurde, äußerte die Mehrheit der V1.1 Explantate (kultiviert, um st 12-13) Sox2. Umgekehrt, wenn der endogenen Konzentration FoxD5 durch Injektion von MOs wurde in die 8-Zellen-Vorläufer Blastomeren D1.1 (obere Reihe) reduziert, exprimiert nur wenige D1.1 Explantate (kultiviert, um st 12-13) Sox2 (vergleiche obere Reihe von 4A). Diese Experimente zeigen, dass die Expression von mütterlichen foxD5 eine Rolle spielt in der intrinsischen Fähigkeit dorsalen Blastomeren um ein neuronales Schicksal erwerben.
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Abbildung 1. Pigmentierung Muster in 2-Zell-Embryonen aus natürlich befruchteten Eiern. Der erste Teilungsfurche ist durch einen Pfeil angedeutet. A) Ein Beispiel eines Embryos, die nicht verwendet werden sollte, um in späteren Stadien Blastomeren identifizieren, da die leicht pigmentiert des Tieres Halbkugel der Embryo wird meistens in einer Zelle (links) enthalten ist. Da die erste Teilungsfurche prognostiziert die mittlere Sagittalebene des Embryos wird die leicht pigmentiert Bereich dieser Embryos nicht identifizieren dorsal. B) Zwei Beispiele von Embryonen, sollte Explantatkulturen sortiert werden. In beiden wird die leicht pigmentiert des Tieres Halbkugel (*) durch den ersten Teilungsfurche halbiert. Der Embryo auf der linken Seite ist in der ersten frühen Zellzyklus und die leicht pigmentiert Region ist nur in ca. 25% der Zelloberfläche. Der Embryo auf der rechten Seite kurz vor dem Ende des ersten Zellzyklus und das Pigment umgezogenntrally so die dorsalen Hälften der beiden Zellen sind leichter. Als Ergebnis in späteren Phasen die leicht pigmentiert tierischen Zellen vorherzusagen dorsalen (d) und dunkel pigmentierten tierischen Zellen vorherzusagen ventralen (v).
Abbildung 2. Beispiele der Spaltung Embryonen aus natürlich befruchteten Eiern. Alle Embryonen ausgerichtet sind mit dem Tier zugewandten Pol den Leser, dorsal nach oben. A) 4-Zell-Embryonen. Der Embryo auf der linken hat gerade die zweite Zelle Zyklus eingetreten, so die Spaltung Furchen flach. Der Embryo auf der rechten Seite hat fast den zweiten Zellzyklus abgeschlossen, so die Spaltung Furchen tiefer und die Zellen erscheinen abgerundet. Schwarze Pfeile weisen auf den ersten Teilungsfurche und roten Pfeile zeigen auf die zweite Teilungsfurche. B) 8-Zell-Embryonen. Der Embryo auf der linken Seite ist die dritte frühen Zellzyklus und der Embryo auf der rechten Seite ist in der Nähedas Ende des dritten Zellzyklus. C) 16-Zell-Embryonen. C 'ist ein Beispiel für unregelmäßige Spaltungen zu vermeiden. C "ist ein Beispiel für reguläre Spaltungen auf der Bauchseite, aber unregelmäßig auf der Rückenseite. C'' 'ist ein Beispiel für weitere reguläre Spaltungen auf der dorsalen Seite, jedoch nicht auf Bauchseite. C'''' ist ein Beispiel regelmäßiger Spaltungen an der Mittellinie, aber nicht seitlich. D) 32-Zell-Embryonen. D 'ist ein Beispiel für reguläre Spaltungen auf der Bauchseite, aber unregelmäßig auf der Rückenseite. D'' ist ein Beispiel für reguläre Spaltungen auf der dorsalen Seite, aber nicht am ventralen Seite. D'' 'ist ein Beispiel für reguläre Spaltungen auf der rechten Seite, sondern eher unregelmäßig Spaltungen auf der linken Seite. E) 64-Embryo. Eine schematische Darstellung dieser Stufen, siehe Die Nieuwkoop und Faber Inszenierung Serie, die on-line (gefunden werden kann http://www.xenbase.org/anatomy/alldev.do ).
Abbildung 3. Explantate von 16-Zell-Embryonen aus natürlich befruchteten Eiern. A) Eine ventrale Tier Blastomeren kurz nach Dissektion. Pfeil bezeichnet Reste der "Griff" Zelle. B) A ventral Tier Blastomeren zu einer Kultur auch die einst geteilt hat übertragen. C) Eine ventrale vegetal Blastomeren kurz nach Dissektion. Verglichen mit tierischen Blastomeren, dies sind größer und schwerer zu manipulieren. D) Zwei ventral Tier Blastomeren Explantate, 2 h nach der Dissektion, haben etwa viermal unterteilt. Die linke Explantat aus der ursprünglichen, pigmentierte Außenfläche des Blastomere angesehen, die rechte Explantat aus der ursprünglichen, nicht pigmentierten Innenfläche des Blastomere angesehen. E) Zwei ventral Tier Blastomeren Explantate für 24 Stunden kultiviert. Die linke Explantat wird in einem Bett aus Zelltrümmern (Pfeile) sitzt, während die rechte Explantat ist frei von jeglicher Detritus. Alle Bilder sind auf 50X magnificatIon.
Abbildung 4. In situ Hybridisierung Analyse der Genexpression in Explantaten von 16-Zelle Blastomeren aus natürlich befruchteten Eier seziert abgeleitet. A. Der 16-Embryo links veranschaulicht die dorsale Blastomere Paares (D1.1), die für die Ergebnisse im wurde explantiert die oberste Zeile, und das ventrale Blastomeren Paar (V1.1), die für die Ergebnisse in der unteren Reihe explantiert wurde. Seziert Blastomere paarweise von injizierten Embryonen wurden in 0,1 × MBS in Kultur Vertiefungen gegeben und inkubiert bei 14 ° C für etwa 20 Stunden. Sie wurden in Röhrchen gesammelt und verarbeitet Fixierungsmittel durch in situ Hybridisierung für die Expression eines Gens zygotischen neuronalen, Sox2. B. Blastomeren des 8-Zellen-Embryos wurden bilateral entweder injiziertmit foxD5 MOs, die endogene Expression in dorsalen Blastomeren oder mit foxD5 mRNA reduzieren endogene Expression in ventralen Blastomeren erhöhen. Wenn die injizierten Embryonen die 16-Zell-Stadium (20-30 min später) erreicht hatten, wurden Blastomeren Paaren seziert, kultiviert und analysiert in situ Hybridisierung, wie in A. Die Zahl der Explantate, dass ausdrückliche Sox2 signifikant in D1.1 Explantate, die mit foxD5 MOs (vgl. oben Zeile in A) injiziert wurden reduziert. Die Zahl der Explantate, dass ausdrückliche Sox2 signifikant in V1.1 Explantate, die mit foxD5 mRNA (vergleiche unteren Reihe in A) injiziert wurden erhöht. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
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Discussion
Die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Kultivierung der einzelnen Blastomeren sind: 1) korrekt identifiziert die Blastomeren von Interesse; 2) die Aufrechterhaltung einer sterilen, gesunde Kultur, 3) Sezieren Zellen an der richtigen Teil des Zellzyklus und 4) die Entwicklung der notwendigen manuellen Fingerfertigkeit, um Schäden während der Präparation zu verhindern und Transfer zum Kultur gut.
Um bestimmte Blastomeren zu manipulieren, ist es wichtig, in der Lage sein, um die Hauptachsen zu identifizieren. In Xenopus-Embryos kann die Rückenseite von drei Methoden identifiziert werden: (1) Markieren des Spermas mit einem Einstiegspunkt Vitalfarbstoff 18, 19, (2) Kipp-in vitro befruchteten Eiern und Markieren einer Seite 18, 19, oder (3) Auswählen Embryonen während der 2-Zellen-Stadium, in dem der erste Teilungsfurche halbiert den leicht pigmentiert Region in dem Tier Halbkugel 20, 21. Wir verwenden die dritte Methode, die genau identifiziert Blastomeren aus natürlich-Düngemittelned 16-Zell-Embryonen in ca. 90% der Fälle 20, 21. Bei der Befruchtung beginnt das Tier Halbkugel Pigmentierung zur Kontraktion in Richtung der Spermien Einstiegspunkt auf der Bauchseite, wodurch der dorsale tierischen Region immer weniger pigmentierte in einer Mehrheit der Embryonen (Abbildung 1). Es gibt erhebliche Unterschiede in dem Ausmaß dieser leicht pigmentiert Region über Kupplungen und sogar innerhalb Fängen des Xenopus Eiern. Wenn die erste Teilungsfurche halbiert dieses helleren Bereich gleichmäßig zwischen den zwei Tochterzellen, dann, dass helleren Bereich kann als Indikator für die dorsale Seite verwendet werden, und die erste Teilungsfurche wird die mittlere Sagittalebene anzuzeigen. Wenn die erste Teilungsfurche trennt die Töchter in einer dunklen Zelle und ein Licht Zelle, verwenden Sie es nicht für die Explantation, weil die Pigmentierung in späteren Phasen nicht genau zu identifizieren, die Dorsalseite. Frühere Studien zeigten, dass in dieser Art von Embryonen die erste Teilungsfurche ein Marker für t blieber Mitte Sagittalebene während die leicht pigmentiert Region nicht mehr zeigte die Dorsalseite 20, 21. Embryonen können auch am Anfang des 4-Zellen-Spaltung (links Embryos in 2B), ausgewählt werden, wenn die erste und die zweite Furchen am vegetativen Pol noch unterschieden werden, wobei die erste Furche muss vollständig und die zweite Furche nicht noch nicht vollständig. Wenn jedoch ein bis zum Ende der 4-Zellen-Stadium, Embryonen (rechts Embryos in 2B) auszuwählen wartet, Furchen des ersten und zweiten Spaltung nicht mehr unterschieden werden, und die Zellen können leicht pigmentiert dorsalen Wieder werden nur in etwa 70% der Embryonen 20, 21. Dies macht für bestimmte Blastomeren viel ungenauer. Es sollte beachtet werden, dass der Prozentsatz von Embryonen in der die erste Teilungsfurche halbiert den leicht pigmentiert Region viel über Kupplungen variiert werden. Nach unseren Erfahrungen können sie für <50% der Eier in einer Kupplung auf> 80 entfallen% Der Eier in einer Kupplung. Unabhängig davon gibt fast immer genug Eier in einem Gelege von gesunden Eier, die dieses Kriterium erfüllen, um eine Explantation Experiments unterstützen.
Die beiden empfohlenen Kulturmedien (MMR, MBS) sind praktisch austauschbar, die Präferenzen der verschiedenen Labors sind meist historisch. MMR als 10X Lösung für ein Jahr oder länger gelagert werden. MBS hat eine kürzere Haltbarkeit, weil sie mit Bicarbonat gepuffert wird. Da Embryonen und Explantate können bakterielle Infektion ohne die schützende Gelee und vitelline Membranen erliegen, sollten Zangen und Kulturmedien steril sein. Wenn Explantaten nicht gut überleben können Antibiotikums zum Kulturmedium (z. B. 0,1% Gentamycin) zugegeben werden. Lösungen mit Gentamicin haben eine kurze Haltbarkeit und sollte daher frisch zubereitet am Tag sie verwendet werden. Zelltrümmer enthält Proteasen, die ungeschützten Explantate beschädigt wird, und fördert das Wachstum von Bakterien. Daher sollte es sein removed aus den Kultur-Wells nachdem die Explantate hatten eine Chance zu heilen.
Blastomere Dissektionen sind in verdünnten Kulturmedium (0,1 X 0,1 X MBS oder MMR) durchgeführt, um die Stärke der von Zelle zu Zelle Adhäsionen zu verringern. Während Xenopus Furchungsstadien wird Zelladhäsion meist durch calcium-/magnesium-dependent Cadherine erreicht. Daher ist es nicht notwendig, enzymatische Dissoziation verwenden, vielmehr sollte dies vermieden werden, da es Oberflächenproteine, die wichtig sein können Ereignisse Schicksal Bestimmung entfernt werden. Da embryonale Zellen aus verschiedenen Chargen von Eiern mit unterschiedlichen Stärken haften, kann die Verdünnung der Dissektion Medium muss auf einer Ad-hoc-Basis eingestellt werden. Wenn die Zellen zu verwachsen, ohne zu reißen sie zerlegen sind, verringern die Konzentration der Dissektion Medium stufenweise von 0,1 X. Umgekehrt, wenn die Zellen auseinanderfallen, wenn der Vitellin-Membran entfernt und sind sehr undicht, erhöhen die Konzentration der dissection mittlerer schrittweise. Jedoch nicht nutzen calcium-/magnesium-free Medien, weil die Zellen zu fragil, um zu den Kultur-Wells übertragen werden. Erfolgreichen Trennung von Blastomeren hängt auch wenn während des Zellzyklus ein führt die Dissektion. Wie in 2 gezeigt ist, zu Beginn des Zellzyklus die Spaltung Furchen sind flach und die Blastomeren abgeflacht sind. Später im Zyklus die Spaltung Furchen tiefer sind und die Zellen sind gerundet. Früh in der Zellzyklus gibt es Zytoplasma-brücken, die zytoplasmatische Undichtheiten führen, wenn gebrochen. Daher werden die Zellen leichter seziert spät im Zellzyklus. 4-Zellen-Embryonen, 8-Zell-Embryonen und pflanzlichen Zellen in allen Stadien sind schwerer zu sezieren, weil die cytoplasmatische Brücken länger andauern. Man kann erwarten eine hohe Todesrate für diese Explantate, dh man braucht, um mehr Sezieren zu einer angemessenen Stichprobengröße verfügbar zu machen. Man kann bis zu Beginn des nächsten Teilungsfurche warten, um den Beginn dissection dieser Zellen zu gewährleisten, dass die cytoplasmatischen Brücken geschlossen. Während einzelne Blastomeren von 8 übernommen - und 16-Zell-Embryonen überleben auch in der Kultur, in unserer Erfahrung älterer Blastomeren ergehen weniger gut als einzelne Zellen. Obwohl wir nicht wissen, die Ursache dafür kann das Überleben von älteren Blastomeren Explantate durch Sezieren mehreren (2-6) aus dem gleichen Blastomeren aus verschiedenen Embryonen und Kultivierung sie zusammen in einer einzigen Kultur sowie 10, 13, 14 verbessert werden.
Dieses Verfahren erfordert Übung und etwas handwerkliches Geschick. Da die Zeit zwischen Spaltungen temperaturabhängig ist, ist es zweckmäßig, Embryonen bei 14-16 ° C lagern zu verlangsamen Spaltung und damit mehr Zeit für die Dissektionen durchführen. Allerdings werden Embryonen nicht vertragen Temperaturen unter 14 ° C. Die erste Herausforderung in diesem Verfahren ist das Entfernen der Dotterhaut. Am besten ist es nicht zu bewegen an Blastomeren Dissektion bis dieser erste Schritt ist gemeistert. Wenn Sezierenaus dem Blastomeren, ist der "Griff" Zelle wahrscheinlich auslaufen und auseinander fallen. Dies ist kein Problem, weil, sobald alle anderen Zellen weg von der gewünschten Zelle abgezogen werden, kann der "Griff"-Zelle mit einer Pinzette entfernt werden. Die Handhabe Zellreste sowie andere Verschmutzungen üblicherweise abzufallen, wenn die Blastomere dem Kulturmedium gut (3B) übertragen. Blastomeren bleiben gierig Kunststoff, so verwenden Sie nur Glaspipetten sie zu übertragen. Verwenden minimal Saugen Druck auf die Zelle, weil sie von den Scherkräften in der Pipette kann zerfallen. Auch vermeiden Luftblasen in der Pipette und sicherzustellen, dass die Spitze der Pipette unter die Oberfläche des Kulturmediums, wenn das Explantat ausgestoßen weil Zellen explodiert, wenn sie ein Luft-Wasser-Grenzfläche berühren.
Das Protokoll beschriebenen verwendet unmanipulierten Embryonen als Spender für den Explantaten und einfaches Salz Medien zur Kultivierung. Diese erlauben es, die intrinsische Fähigkeit des Explantat in expr testeness insbesondere Schicksale. Diese Methode kann experimentell auf zwei Arten erweitert werden. Erstens können die Kulturmedien mit Signalisierung / Wachstumsfaktoren ergänzt werden, um zu testen, ob diese Moleküle können bewirken, dass das Explantat auf alternative Schicksale auszudrücken. Zweitens kann die Genexpression der Donor entweder durch Einspritzen von Embryonen mRNAs (gain-of-function) oder anti-sense Oligonukleotide Morpholino (Loss-of-function) in spezifische Vorstufen vor der Dissektion Blastomere geändert werden. Dies kann an der 1-Zell-Stadium oder in gezielter bei 1-2 Zellteilungen vor Dissektion durchgeführt werden. Mit diesen Ansätzen kann man prüfen, ob ein bestimmtes Gen eine exogen zugeführt Blastomere um einen alternativen Schicksal erwerben bewirkt, oder ob eine bestimmte endogene Gen ist für die Blastomere seines autonomen Schicksal exprimieren (zB 4B). Diese sind leistungsfähige experimentelle Ansätze, weil sie die verwirrenden Einfluss der anderen Zellen zu eliminieren und Signalisierung centers präsentieren im intakten Embryo.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren möchten die GWU Harlan Fellowship für die Unterstützung von Paaqua Grant und der GWU Luther Reis Fellowship für die Unterstützung von Mona Herold anzuerkennen. Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation MCB-1121711 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-38 | Course (12 μm), for major repairs of forceps tips |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-46 | Medium (3 μm), for fine sharpening of forceps tips |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-54 | Fine (0.3 μm), for polishing of forceps tips |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | #11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. Corrosive resistant so they can be autoclaved. |
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References
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