Summary
Il destino di una singola cellula embrionale può essere influenzata da molecole ereditarie e / o da segnali provenienti da cellule vicine. Utilizzando mappe destino dell'embrione stadio di segmentazione del Xenopus, singoli blastomeri possono essere identificati per la cultura in isolamento per valutare i contributi di molecole ereditarie rispetto interazioni cellula-cellula.
Abstract
Mappe destino, costruiti lineage tracing tutte le cellule di un embrione, rivelano che i tessuti discendere da ciascuna cellula dell'embrione. Sebbene le mappe destino sono molto utili per identificare i precursori di un organo e per chiarire il percorso di sviluppo da cui le cellule discendenti popolano quell'organo nell'embrione normale, non illustrano il potenziale di sviluppo di una cellula precursore o identificare i meccanismi con cui il suo destino è determinato. Per eseguire il test per l'impegno il destino delle cellule, si confrontano normale repertorio di una cellula di discendenti nell'embrione intatto (la mappa destino) con quelli espressi dopo una manipolazione sperimentale. E 'il destino della cellula fissa (impegnato) indipendentemente dall'ambiente circostante cellulare, o è influenzato da fattori esterni, forniti dai suoi vicini? Utilizzando le mappe complete destino dell'embrione Xenopus, si descrive come identificare, isolare e cultura singoli precursori stadio scissione, chiamato blastomeres. Questo approccio permette di valutare se queste cellule precoci sono impegnati nel fato che acquistano nel loro ambiente normale nell'embrione intatta, richiedono interazioni con le loro cellule vicine, o possono essere influenzate esprimere sorti alterne se esposto ad altri tipi di segnali.
Introduction
Xenopus laevis embrioni sono stati utilizzati ampiamente per identificare i meccanismi con cui le cellule embrionali acquisiscono i loro destini, poichè le loro uova sono grandi abbastanza da permettere approcci microchirurgiche. Inoltre, si sviluppano esternamente senza la necessità di integrazione nutrizionale del terreno di coltura in quanto ogni cella contiene una ricca intracellulare di piastrine tuorlo che forniscono un negozio intrinseca energia. Un elemento importante per lo studio dei meccanismi attraverso i quali si determina il destino della cellula è la serie completa di mappe destino dei blastomeri fase a scissione (da 2 - a 32 celle stadi) 1, 2, 3, 4, 5, 6. Queste mappe sono state costruite da una molecola microinjecting rilevabile in un unico, blastomero identificabile e il monitoraggio in seguito allo sviluppo che i tessuti sono popolate dalla progenie etichetta. Mappe destino consistenti sono possibili perché gli assi cardinali degli embrioni possono essere identificati in molti Embryos. In primo luogo, tutti gli embrioni wild type l'emisfero animale è pigmentata, mentre l'emisfero vegetale non lo è. Secondo, l'ingresso dello spermatozoo nella fecondazione provoca una contrazione della pigmentazione animale emisfero verso il lato ventrale futuro, in molti embrioni una differenza pigmentazione pertanto possono essere utilizzati per discriminare i lati dorsale e ventrale. Terzo, il solco prima segmentazione approssima il piano sagittale nella maggior embrioni, e quindi può essere utilizzato per identificare i lati destro e sinistro del embrione. Le mappe destino si basano anche sul fatto che naturalmente fecondato le uova frequentemente aderire nella schemi regolari che rendono ogni blastomero identificabile attraverso una vasta popolazione di embrioni. Mentre non vi è variabilità all'interno e tra le grinfie di uova in materia di modelli di pigmentazione e scissione, con procedure di selezione descritte nel presente documento consente di cellule con destini prescritti da identificare con circa il 90% di accuratezza.
Destini cellulari possono essere dissuadereestratto durante l'embriogenesi da diversi meccanismi. I fattori intrinseci, come differenzialmente ereditati mRNA citoplasmatici o proteine, contribuiscono a diversi aspetti di patterning precoce. Ad esempio, specifici mRNA materni determinare le celle contribuirà alla linea germinale, diventare il endoderma, o contribuire all'asse dorsale del corpo (recensione in 7). I fattori estrinseci forniti a livello locale da parte delle cellule vicine o più distanti da un centro embrionale di segnalazione, sono responsabili di indurre specifici tipi di tessuto ed il modello quasi ogni organo del sistema. Esempi di centri di segnalazione comprendono l'organizzatore / nodo nella gastrula che induce ectoderma neurale e il mesoderma modelli, e la zona di attività polarizzante che il pattern asse anteriore-posteriore del germoglio dell'arto. Sebbene le mappe destino identificare i precursori dei diversi organi e rivelano il percorso di sviluppo adottate dai propri discendenti in embrione normale, non in grado di distinguere tra intrinsecae le influenze estrinseche su tali cellule. Inoltre, non rivelano il potenziale di sviluppo di una cella, i cui discendenti differenziare in un ambiente complesso di segnalazione dell'embrione. Due approcci sperimentali può verificare se il destino di una cellula è determinata da fattori intrinseci o successivamente viene influenzata da fattori esterni: 1) trapianto di cellule in una posizione romanzo nell'embrione, o 2) la rimozione della cellula dall'embrione seguita da coltura in assenza di segnali esogeni.
Entrambi gli approcci sperimentali sono realizzabili in Xenopus perché le cellule sono abbastanza grandi da essere separati manualmente. Per esempio, numerosi studi hanno cancellato singole cellule da embrioni (per cambiare interazioni cellula-cellula) o le cellule trapiantate a posizioni nuove in embrioni di accoglienza per verificare i cambiamenti destino (recensione in 7, 8, 9). Inoltre, il secondo approccio di espianto piccolo numero di cellule provenienti da diverse regioni dell'embrione icultura nto di chiarire le interazioni tissutali induttivi in assenza di fattori esogeni è possibile perché le cellule dell'embrione Xenopus sono riempiti con un archivio intracellulare dei nutrienti, le piastrine tuorlo. Pertanto, essi possono essere coltivate per alcuni giorni in un mezzo definito sale senza integrazione nutrizionale o fattore di crescita del mezzo di coltura. Abbiamo usato questo metodo per dimostrare che blastomeri animali dorsali hanno una capacità autonoma di produrre tessuti mesodermiche neurali e dorsale a causa di ereditarietà materna mRNA 10, 11, e altri hanno dimostrato che le specifiche mesoderma di 32 cellule blastomeri si basa su informazioni sia intrinseco ed estrinseco 12 . Un vantaggio di coltura di cellule come espianti è che il mezzo può anche essere integrato con segnalazione definiti fattori per determinare quale cellula-cellula percorso di comunicazione potrebbe influenzare il destino della cellula espiantato 12, 13, 14. Inoltre, si può iniettare la pr blastomeroior alla cultura con mRNA a un eccesso di esprimere un gene, o con oligonucleotidi anti-senso per evitare la traduzione di mRNA endogeni. Questi, guadagno e perdita di funzione di analisi in grado di identificare le molecole che sono necessarie per un destino autonomamente espressa. Per analizzare il destino della espianto, identificazione di specifici tipi cellulari possono essere eseguite da espressione genica standard (ad esempio, ibridazione in situ, RT-PCR) e saggi di immunocitochimica. Questo protocollo fornisce un semplice, ma potente, modo di distinguere tra i meccanismi intrinseci ed estrinseci che regolano una cellula embrionale si sviluppa nei tessuti specifici.
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Protocol
1. Preparazione di terreni di coltura, strumenti e piatti
- Contrasta con quattro pinze Alumina pellicola abrasiva. Fate questo sotto un microscopio da dissezione per monitorare la grandezza della punta. Una coppia di pinze serve come back-up in caso di una punta è danneggiata durante la procedura. Autoclavare tutte e quattro le pinze e conservare in un contenitore sterile.
- Fai 500 ml ciascuna di terreno di coltura e di 0,1 X. 1.0X (sia di Marc Ringers Modified [MMR] o modifica di Barth Saline [MBS], ricette in 15) e filtro sterilizzare. Noi abitualmente uso MBS (1X = 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM CaCl 2, 1 mM MgSO4, 5 mM HEPES [pH 7,8], 2.5 mM NaHCO 3). Conservare a 14-18 ° C per mesi.
- Fare una soluzione al 2% di agarosio in mezzo di coltura (2 g elettroforesi agarosio in 100 ml 1X mezzo di coltura in una bottiglia di vetro con tappo a vite). Autoclave per sciogliere agarosio. Questo può essere conservato a 4 ° C per mesi, e scaldati per liquefare il agarosio quando è necessario successivo.
- Mentre l'agarosio è liquido, versare circa 0,5 ml sul fondo di ciascun pozzetto di una sterile 24-pozzetti cultura. Questo impedisce l'espianti di attaccarsi alla plastica.
- Mentre l'agarosio è liquido, versare circa 2-3 ml sul fondo di due o tre piatti di 60 millimetri Petri, e agitare delicatamente per assicurarsi che il fondo è coperto. Questi risultati serviranno come piatti dissezione e l'agarosio embrioni impedisce di attaccarsi alla plastica una volta che le loro membrane vengono rimossi.
- Quando l'agarosio si è raffreddato e indurito, fiamma la punta di un 6 "pipetta Pasteur finché non si scioglie in un pallone, e leggermente toccare la superficie del agarosio in ciascun pozzetto della piastra di coltura. Ciò creerà una depressione poco profonda in cui l'espianto sarà posto.
- Riempire ogni pozzetto della piastra di coltura con terreno di coltura 1X sterile.
- Quando l'agarosio si è raffreddato e indurito, riempire il piatto dissezione con terreno di coltura diluita (0,1 X. MMR o 0.1X MBS) per facilitare la separazione blastomeri.
2. Selezione degli embrioni
- Ottenere uova fecondate e rimuovere la gelatina cappotti secondo protocolli standard 15. Trasferirli 0.5X mezzo di coltura in una capsula di Petri 100 millimetri.
- Quando raggiungono embrioni di 2 cellule stadio, ordinare quelli in cui il solco prima segmentazione biseca l'area leggermente pigmentata nell'emisfero animale (Figura 1) in una piastra separata. Questi saranno i donatori per gli espianti. Tenere le restanti 2-cellule di embrioni in un piatto a parte accanto agli embrioni donatori durante l'intera procedura di servire come controlli di pari livello per mettere in scena gli espianti.
3. Preparazione di espianti
- Posizionare embrioni 5-10 in un piatto dissezione, ma solo lavorare su un embrione alla volta.
- Posizionare il primo embrione così la membrana vitellina trasparente può essere visto, è separato da uno spazio libero (spazio perivitellino) sopra la superficie del polo animale dell'embrione. Utilizzando una forza affilataps in mano sottodominante (mano sinistra se si è di mano destra), afferrare la membrana vitellina sopra lo spazio perivitellino. Utilizzando una pinza affilate con l'altra mano, afferrare la membrana vicino alla prima punta pinze, e tirare delicatamente in direzioni opposte a sbucciare la membrana di distanza. Effettuare la presa iniziale ad una distanza dalla cella che deve essere sezionato, in modo che la cellula bersaglio non sia danneggiata durante la rimozione della membrana. Si può dire che la membrana è stato rimosso perché l'embrione si appiattisce.
- Afferrare una cella confinante con la pinza in mano sottodominante e utilizzare questa cella come "maniglia" così la cella da dissezionare non è direttamente toccata. Con la pinza in altra parte, tirare delicatamente le cellule rimanenti vicine dal blastomero desiderato. Se le cellule della linea mediana, che condividono lo stesso destino, sono mirati, possono essere rimossi insieme come una coppia. Infine, sezionare via la cella "maniglia".
- Sollevare il blastomero (o coppia di blastomeri), con una sterile, Vetro pipetta Pasteur, evitando bolle d'aria e di aspirazione eccessiva. La pipetta può essere il fuoco lucidato per eliminare spigoli vivi che possono danneggiare la cellula, ma non di routine farlo. Posizionare la punta della pipetta Pasteur sotto la superficie del terreno di coltura in un pozzetto della piastra di coltura espianto, e delicatamente espellere il blastomero. Dovrebbe scivolare nella depressione poco profonda per gravità. Blastomero stesso da più di un embrione possono essere combinati in un unico espianto.
- Ripetere questa procedura con embrioni rimanenti nel piatto dissezione, uno per uno. Dopo circa 10 embrioni, il piatto dissezione sarà riempita di detriti cellulari. In questo caso, passare a un piatto dissezione fresco.
- Dopo che tutte le dissezioni sono fatti, verificare se gli espianti sono nelle depressioni poco profonde. Se non, possono essere delicatamente spinto nella depressione con un'ansa capelli che è stato sterilizzato in etanolo 70% ed essiccato all'aria.
- Circa un'ora dopo l'ultima dissezione, rimuovere i detriti surrounding espianti guarite con una sterile, vetro pipetta Pasteur.
- Cultura il piatto di espianti a 14-20 ° C vicino alla piastra Petri contenente il fratello, gli embrioni di controllo. Embrioni Sibling indica lo stadio di sviluppo degli espianti blastomeri.
4. Espianti raccolta per l'analisi
- Raccogliere gli espianti quando i fratelli raggiungono la fase di sviluppo desiderato. Questi espianti sopravvivere abbastanza bene anche se alcune delle cellule disintegrarsi. Pertanto, se vi è una massa nuvoloso cultura bene, esplorare con un'ansa capelli o pinze per determinare se un espianto sano è sepolto all'interno.
- Raccogliere espianti in un piccolo volume di soluzione di coltura con una pipetta Pasteur di vetro, e delicatamente espellerli in un tampone di lisi o fissativo appropriato per il saggio sia condotto.
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Representative Results
La capacità di questo test per valutare con precisione il potenziale di sviluppo della cellula si basa su sezionando il blastomero corretta in base al destino mappe 1, 2, 3, 4, 5, 6. Pertanto, è fondamentale scegliere embrioni con il pattern pigmentazione corrette al 2-cellula fase, come illustrato nella figura 1, che successivamente sono conformi ai modelli di scissione regolari, come illustrato nella figura 2. Se si osservano gli embrioni classificate come non giungono alla fase necessaria scissione e separa gli embrioni che presentano fratture irregolari, la precisione è notevolmente migliorata. Come illustrato in figura 2, fenditure regolari spesso si verificano solo su un lato dell'embrione. Questi embrioni possono essere usati come donatori se la cellula donatrice origina dal lato "normale". Poiché i modelli scissione regolari si trovano in minor numero di embrioni come procede la divisione cellulare, ordinare circa cinque volte più embrioni di cui hai intenzione di sezionare. Naturalmente fuova ertilized tendono ad avere fratture più regolare nelle uova fecondate in vitro. Anche se i modelli scissione variare molto all'interno di una singola frizione di uova, ci si può aspettare almeno il 10-20% per essere utili per questo tipo di manipolazione.
Blastomeri possono essere coltivate da soli o in piccoli gruppi. Quando blastomeri sono sezionati prima (Figura 3A), e trasferiti alla cultura pozzo (Figura 3B, C), sono morbidi e fragili. Nella nostra esperienza, blastomeri animali ed equatoriali sono molto più facili da analizzare e la cultura di blastomeri vegetali (Figura 3C). Forse perché sono più piccoli, sono più facili da trasferire. Sembrano anche guarire più rapidamente quando scalfito con le pinze. Cellule vegetali spesso sembrano completare citochinesi più lentamente e quindi mantenere ponti citoplasmatici con celle gemelle, rendendoli più "leaky" quando sezionato, e la loro membrana cellulare è più fragile e più facile da danni.Dopo circa 1-2 ore di cultura, il blastomero espiantato (s) si sono divisi circa 4 volte e sloughed via la maggior parte dei detriti rimanenti dal danneggiato le cellule vicine (Figura 3D). Dopo 20 ore, formano piccole palline robusti delle cellule (Figura 3E). Mentre alcuni possono essere sepolti in macerie, spesso una massa sano può essere trovato (Figura 3E, a sinistra).
Sebbene gli espianti sono piccole, sopravvivono elaborazione per l'ibridazione in situ come pure i più comunemente utilizzati espianti cap animali, che permette di monitorare successivamente l'espressione genica. Nell'esperimento mostrato in Figura 4A, due blastomeri dorsali (D1.1) o due blastomeri ventrale (V1.1) sono stati sezionati a 16-cella stadio e coltivate in 1X MBS a 14 ° C fino embrioni pari livello raggiunto stadi piastra precoce neurali (ST12-13, circa il 20-22 ore dopo dissezione). Ogni campione è stato analizzato per l'espressione di un gene zygotic piastra neurale (Sox2 </ Em>) con l'ibridazione in situ (il prodotto di reazione blu). Questo test dimostra che la maggioranza dei blastomeri animali dorsali, che sono precursori della piastra neurale, possono esprimere Sox2 autonomamente, cioè senza segnalazione supplementari da altre regioni dell'embrione. Tali espianti che non esprimono Sox2 potrebbe essere stato identificato erroneamente al momento della dissezione. Al contrario, nessuno dei blastomeri animali ventrali, che sono precursori dell'epidermide ventrale, espressa Sox2. Quindi, possiamo concludere che blastomero dorsale animale hanno una capacità intrinseca di formare tessuto neurale, mentre le ventrali blastomeri animali non lo fanno. Si noti che alcuni dei D1.1 espianti hanno eIongated, una morfologia indicativo di formazione mesoderma dorsale; questi blastomeri inoltre sono destinati a formare la notocorda nell'embrione intatta 3, e nella cultura esprimono una proteina marker espianto notocorda 10. Blastomero destini intrinseche può essere altere d da microiniezione prima di mRNA (guadagno di funzione) o oligonucleotidi anti-senso morpholino (MOS, perdita-di-funzione). In Figura 4B, l'effetto di modificare i livelli endogeni di un gene espresso maternamente neurale, foxD5 16, 17, viene testato. Quando il livello endogeno di FoxD5 è stato aumentato iniettando foxD5 mRNA nelle 8 celle blastomeri precursori di V1.1 (riga in basso), la maggior parte degli espianti V1.1 (in coltura per st 12-13) espressa Sox2. Al contrario, quando il livello endogeno di FoxD5 è stato ridotto di iniezione di MO nelle 8 celle blastomeri precursori di D1.1 (riga in alto), solo pochi D1.1 (espianti coltivati a st 12-13) espressa Sox2 (confronta riga superiore della Figura 4A). Questi esperimenti indicano che l'espressione di materna foxD5 gioca un ruolo nella capacità intrinseca di blastomeri dorsali di acquisire un destino neurale.
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Figura 1. Modelli di pigmentazione in 2 cellule di embrioni di uova fecondate naturalmente. Il solco prima segmentazione è indicata da una freccia. A) Un esempio di un embrione che non deve essere usato per identificare blastomeri in fasi successive perché la regione leggermente pigmentata dell'emisfero animale dell'embrione è contenuto principalmente in una cella (a sinistra). Dal momento che il solco prima segmentazione prevede il piano sagittale mediano dell'embrione, la regione leggermente pigmentata di questo embrione non identificherà dorsale. B) Due esempi di embrioni che devono essere ordinati per culture espianto. In entrambi i casi, la regione leggermente pigmentata dell'emisfero animale (*) è diviso in due dal solco prima segmentazione. L'embrione a sinistra è all'inizio del ciclo cellulare prima, e la regione leggermente pigmentata è visibile solo in circa il 25% della superficie cellulare. L'embrione a destra si avvicina alla fine del ciclo cellulare prima, e il pigmento è spostato ventrally così le metà dorsale delle due celle sono più leggeri. Come risultato, in fasi successive le cellule animali leggermente pigmentate predire dorsale (d) e cellule animali cupamente pigmentate predire ventrale (v).
Figura 2. Esempi di embrioni allo stadio di dissociazione rispetto alle uova fecondate naturalmente. Tutti gli embrioni sono orientate con il polo animale di fronte al lettore, dorsale alla cima. A) 4 cellule embrioni. L'embrione a sinistra è appena entrato nel secondo ciclo cellulare in modo che il taglio solchi sono poco profonde. L'embrione di destra ha quasi completato il secondo ciclo cellulare in modo che il taglio solchi sono più profonde e le cellule appaiono più arrotondati. Frecce nere indicano il solco prima segmentazione, e le frecce rosse indicano il solco scissione secondo. B) 8-cellule embrioni. L'embrione di sinistra è precoce è il ciclo cellulare e l'embrione terzo sulla destra è vicinoalla fine del ciclo cellulare terza. C) 16-cellule embrioni. C 'è un esempio di fratture irregolari da evitare. C "è un esempio di fratture regolari sul lato ventrale, ma irregolare sul lato dorsale. C'' 'è un altro esempio di fratture regolari sul lato dorsale, ma non sul lato ventrale. C'''' è un esempio di divisioni regolari sulla linea mediana, ma non lateralmente. D) a 32 celle. embrioni D 'è un esempio di divisioni regolari sul lato ventrale, ma irregolari sul lato dorsale. D'' è un esempio di divisioni regolari sulla dorsale lato, ma non sul lato ventrale. D'' 'è un esempio di fratture regolari sul lato destro, ma più irregolari fenditure sul lato sinistro. E) 64 unicellulare. Per una rappresentazione schematica di questi stadi, consultare la messa in scena Nieuwkoop e Faber serie, che si trova on-line ( http://www.xenbase.org/anatomy/alldev.do ).
Espianti Figura 3. Dal 16 cellule di embrioni di uova fecondate naturalmente. A) Un blastomero animale ventrale poco dopo la dissezione. Freccia indica i resti della cellula "manico". B) Un blastomero animale ventrale trasferiti a un pozzo cultura che ha diviso una volta. C) Un blastomero ventrale vegetale poco dopo la dissezione. Rispetto al blastomeri animali, questi sono più grandi e più difficile da manipolare. D) Due ventrali espianti blastomeri animali, 2 ore dopo la dissezione, hanno diviso circa quattro volte. L'espianto è stato visto da sinistra l'originale, superficie pigmentata esterna del blastomero, l'espianto diritto è visto da quello originale, non pigmentato superficie interna del blastomero. E) Due ventrali espianti blastomeri animali in coltura per 24 ore. L'espianto sinistra è seduto in un letto di detriti cellulari (frecce), mentre l'espianto destra è priva di qualsiasi detrito. Tutte le immagini sono in 50X magnificatione.
Figura 4. In situ ibridizzazione analisi di espressione genica in espianti derivati da 16-celle blastomeri dissezionati da uova fecondate naturalmente. A. Il 16 unicellulare sulla sinistra illustra la coppia dorsale blastomero (D1.1) che è stato espiantato per i risultati in nella riga superiore, e la coppia blastomero ventrale (V1.1) che è stato espiantato per i risultati nella riga in basso. Sezionato coppie blastomero da embrioni uninjected stati collocati in MBS 0.1X in pozzetti di coltura e incubate a 14 ° C per circa 20 ore. Sono stati raccolti in provette di fissativo e trattati mediante ibridazione in situ per l'espressione di un gene zygotic neurale, Sox2. Blastomeri B. 8-cellule embrioni allo stadio sono stati iniettati bilateralmente siacon foxD5 MOS, per ridurre l'espressione endogena in blastomeri dorsali, o con foxD5 mRNA per aumentare l'espressione endogena in blastomeri ventrali. Quando gli embrioni iniettati raggiunto il 16-cellula fase (20-30 min più tardi), coppie blastomeri sono stati sezionati, coltura e analizzati mediante ibridazione in situ come in A. Il numero di espianti che esprimono Sox2 è significativamente ridotta in D1.1 espianti che sono stati iniettati con foxD5 MOS (confrontare riga superiore in A). Il numero di espianti che esprimono Sox2 è significativamente aumentata negli espianti V1.1 che sono stati iniettati con foxD5 mRNA (confronta con fila inferiore in A). Clicca qui per ingrandire la figura .
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Discussion
Le fasi più critiche per la coltivazione di successo di singoli blastomeri sono: 1) identificare correttamente il blastomero di interesse; 2) il mantenimento di una sterile, sana cultura; 3) le cellule dissezione presso la parte corretta del ciclo cellulare e 4) a sviluppare la manualità necessaria destrezza per evitare danni durante la dissezione e trasferire alla cultura bene.
Per manipolare blastomeri specifici, è essenziale essere in grado di identificare gli assi cardinali. In embrioni di Xenopus, il lato dorsale può essere identificato da tre metodi: (1) che segna il punto di entrata degli spermatozoi con un colorante vitale 18, 19, (2) ribaltamento in vitro uova fecondate e marcatura di un lato 18, 19, o (3) selezione degli embrioni durante la 2-cella stadio in cui il solco prima segmentazione biseca la regione leggermente pigmentata nell'emisfero animale 20, 21. Usiamo il terzo metodo, che identifica con precisione da blastomeri naturalmente fertilizED 16-cellule embrioni in circa il 90% dei casi 20, 21. Alla fecondazione, la pigmentazione emisfero animale comincia a contrarsi verso il punto di entrata sperma sul lato ventrale, causando la regione dorsale animale a diventare meno pigmentata in una maggioranza di embrioni (Figura 1). Si registrano differenze notevoli nella misura di questa regione leggermente pigmentata in frizioni e anche all'interno di frizioni di uova di Xenopus. Se il solco prima segmentazione biseca questa zona chiara equamente tra le due cellule figlie, allora accendino area può essere utilizzata come indicatore del lato dorsale, e il solco prima segmentazione indica il piano sagittale. Se il solco prima segmentazione separa le figlie in una cella buia e una cella luce, non utilizzarlo per l'espianto, perché la pigmentazione in fasi successive non identificare esattamente il lato dorsale. Studi precedenti hanno mostrato che in questi tipi di embrioni solco prima segmentazione rimasto un marcatore per tegli piano sagittale mediano considerando che la regione leggermente pigmentata non è più indicato il lato dorsale 20, 21. Embrioni possono anche essere selezionati prima parte del 4-celle clivaggio (embrione sinistra in Figura 2B), quando il primo e il secondo solchi al polo vegetale può ancora essere distinta, il primo solco dovrebbe essere completa e non secondo il solco ancora completo. Se, tuttavia, si attende la fine del 4 cellule per selezionare embrioni (embrione destra in Figura 2B), la prima e la seconda scissione solchi possono più essere distinti, e le cellule possono essere leggermente pigmentate quelli dorsali in solo 70% di embrioni 20, 21. Questo renderà il targeting blastomeri specifici meno accurato. Va notato che la percentuale di embrioni in cui il solco prima segmentazione biseca la regione leggermente pigmentata varia molto attraverso frizioni. Nella nostra esperienza si può spiegare <50% delle uova in una frizione a> 80% Delle uova in una frizione. Indipendentemente da ciò, ci sono quasi sempre abbastanza uova all'interno di una frizione di uova sane che soddisfano questo criterio di sostenere un esperimento espianto.
I due terreni di coltura raccomandati (MMR, MBS) sono praticamente intercambiabili, le preferenze dei diversi laboratori sono per lo più storico. MMR può essere memorizzato come una soluzione 10 volte per un anno o più. MBS ha una durata più breve, perché è tamponato con bicarbonato. Poiché gli embrioni e espianti può soccombere alle infezioni batteriche senza protezione gelatina e membrane vitellina, pinze e terreni di coltura devono essere sterili. Se espianti non sopravvivono bene, antibiotico può essere aggiunto al mezzo di coltura (per esempio, gentamicina 0,1%). Soluzioni contenenti gentamicina hanno una vita breve conservazione, e quindi deve essere fatta fresca nel giorno in cui devono essere utilizzati. Detriti cellulari contiene proteasi che danneggiano gli espianti non protetti, e favorisce la crescita batterica. Pertanto, dovrebbe essere remoestratti dalle pozzetti di coltura, dopo gli espianti hanno avuto la possibilità di guarire.
Dissezioni blastomeri sono eseguite in terreno di coltura diluito (0.1X MBS o MMR 0,1 X.) al fine di ridurre la resistenza della cellula-cellula aderenze. Durante le fasi di scissione di Xenopus, l'adesione cellulare è in gran parte compiuta da caderine calcium-/magnesium-dependent. Pertanto, non è necessario utilizzare dissociazione enzimatica: infatti questo dovrebbe essere evitato perché rimuove proteine di superficie che possono essere importanti nella determinazione destino eventi. Poiché le cellule embrionali da diversi lotti di uova aderire con diversi punti di forza, la diluizione del mezzo di dissezione può essere necessario modificare su una base ad hoc. Se le cellule sono troppo aderente a sezionare senza strappare loro, abbassare la concentrazione del mezzo di dissezione gradi da 0,1 X.. Al contrario, se le cellule in pezzi quando la membrana vitellina viene rimosso e sono molto permeabile, aumentare la concentrazione del dissection media graduale. Tuttavia, non utilizzare supporti calcium-/magnesium-free perché le cellule diventano troppo fragili per trasferire ai pozzetti di coltura. Separazione di blastomeri successo dipende anche quando durante il ciclo cellulare uno esegue la dissezione. Come mostrato in figura 2, all'inizio del ciclo cellulare il clivaggio solchi sono bassi e le blastomeri sono appiattite. Successivamente nel ciclo del clivaggio solchi sono più profonde e le cellule sono più arrotondate. All'inizio del ciclo cellulare, ci sono ponti citoplasmatici che causano perdite citoplasmatica in caso di rottura. Pertanto, le cellule sono più facilmente sezionato ritardo nel ciclo cellulare. 4 cellule, embrioni di 8 cellule, embrioni e cellule vegetali in tutte le fasi sono più difficili da analizzare, perché i ponti citoplasmatici persistere più a lungo. Si può prevedere un alto tasso di morte per questi espianti, cioè si ha la necessità di eseguire più dissezioni per recuperare una dimensione ragionevole del campione. Si può attendere l'inizio del solco scissione successiva per iniziare la diffuction di queste cellule per garantire che i ponti citoplasmatici sono chiusi. Mentre blastomeri singolo tratto dal 8 - e 16-cellule embrioni sopravvivono bene nella cultura, nella nostra esperienza più anziani blastomeri meno bene come singole cellule. Anche se non si conosce la causa di questo, la sopravvivenza degli anziani espianti blastomeri possono essere migliorate dissezione più (2-6) del blastomero stesso da embrioni diversi e coltura insieme in una sola cultura ben 10, 13, 14.
Questa procedura richiede un po 'di pratica e destrezza manuale. Poiché il tempo tra spaccature dipende dalla temperatura, è conveniente immagazzinare embrioni a 14-16 ° C per rallentare scissione e più tempo per eseguire la dissezione. Tuttavia, gli embrioni non tollera temperature inferiori a 14 ° C. La prima sfida in questa procedura è la rimozione della membrana vitellina. Non è meglio passare alla dissezione blastomeri fino a questo primo passo è padroneggiata. Quando dissezioneil blastomero, la cella "manico" rischia di perdere e cadere a pezzi. Questo non è un problema in quanto una volta che tutte le altre celle sono staccato dalla cella desiderata, la cella "maniglia" può essere rimosso con una pinza. I resti maniglia cellule così come altri detriti solito cadere quando il blastomero viene trasferito alla cultura pozzo (Figura 3B). Blastomeri bastone avidamente alla plastica, in modo da utilizzare solo le pipette di vetro per trasferirli. Utilizzare pressione minima succhiare sulla cella perché può disintegrare dalle forze di taglio nella pipetta. Inoltre, evitare bolle d'aria nella pipetta e assicurarsi che la punta della pipetta è sotto la superficie del terreno di coltura quando l'espianto viene espulso perché cellule esploderanno se toccano una interfaccia aria-acqua.
Il protocollo descritto nel presente documento utilizza embrioni non manipolata come donatori per gli espianti e media sale semplici per la coltura. Questi permettono di verificare la capacità intrinseca di espianto di exprEss destini particolari. Questo metodo può essere esteso sperimentalmente in due modi. Primo, i mezzi di coltura possono essere integrati con segnalazione / fattori di crescita per verificare se queste molecole possono causare l'espianto di esprimere destini alternativi. Secondo, l'espressione genica degli embrioni donatori possono essere cambiati o iniettando mRNA (guadagno di funzione) o oligonucleotidi antisenso morfolino (perdita di funzione) in precursori specifici prima dissezione blastomero. Questo può essere fatto a 1-cella stadio, o in modo più mirato a 1-2 divisioni cellulari prima dissezione. Con questi metodi, si può verificare se un particolare gene esogeno fornito provoca un blastomero per acquisire un destino alternativo, o se un particolare gene endogeno è necessario per il blastomero di esprimere il proprio destino autonoma (ad esempio, la Figura 4B). Questi sono potenti approcci sperimentali perché eliminano l'influenza confondente delle altre cellule e segnalazione centers presenti nell'embrione intatta.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il GWU Harlan Fellowship per il supporto di Paaqua Grant e il GWU Luther Rice Fellowship per il supporto di Mona Herold. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Foundation concessione MCB-1121711.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-38 | Course (12 μm), for major repairs of forceps tips |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-46 | Medium (3 μm), for fine sharpening of forceps tips |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-54 | Fine (0.3 μm), for polishing of forceps tips |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | #11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. Corrosive resistant so they can be autoclaved. |
| Gentamicin solution | Sigma | G1397 | Add to medium on same day as use |
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