Summary
Skjebne av en individuell embryonale celle kan være påvirket av nedarvede molekyler og / eller ved hjelp av signaler fra nabocellene. Utnytte skjebne kart over cleavage scenen Xenopus embryo kan enkle blastomeres identifiseres for kultur i isolasjon for å vurdere bidragene fra arvet molekyler versus celle-celle interaksjoner.
Abstract
Skjebne kart, konstruert fra avstamning sporing alle cellene i et embryo, avsløre hvilke vev ned fra hver celle av embryo. Selv skjebne kart er svært nyttig for å identifisere forløpere til et organ og for å belyse den utviklingsmessige banen der de etterkommer celler fylle det organ i normal embryo, har de ikke illustrere full utviklingsmessige potensialet i en forløper celle eller identifisere mekanismer som sin skjebne bestemmes. For å teste for celle skjebne engasjement, sammenligner man en celle normale repertoar av etterkommere i intakt embryo (skjebnen kart) med de uttrykte etter en eksperimentell manipulasjon. Er cellens skjebne fast (kommitterte) uavhengig av den omkringliggende mobilnettet miljøet, eller er det avhengig av eksterne faktorer levert av sine naboer? Bruke omfattende skjebne kart over Xenopus embryo, beskriver vi hvordan å identifisere, isolere og kultur enkelt cleavage stage forløpere, kalt blastoMeres. Denne fremgangsmåten gjør en å vurdere hvorvidt disse tidlige cellene er forpliktet til skjebne de tilegner i sitt normale miljø i intakt embryo, krever interaksjon med sine nærliggende celler, eller kan bli påvirket til å uttrykke alternative skjebner hvis de utsettes for andre typer signaler.
Introduction
Xenopus laevis embryoer har blitt utnyttet i stor utstrekning for å identifisere mekanismer som embryonale celler skaffe sine spesifikke skjebner fordi eggene sine er store nok til å tillate mikrokirurgiske tilnærminger. Tillegg utvikler de eksternt uten behov for ernæringsmessige supplering av dyrkningsmediet fordi hver celle inneholder en rik intracellulær tilførsel av eggeplomme blodplater som gir en iboende energilager. En viktig ressurs for å studere mekanismer som celle skjebne bestemmes er omfattende sett av skjebnen kart over de cleavage scenen blastomeres (fra 2 - gjennom 32-celle stadier) 1, 2, 3, 4, 5, 6. Disse kartene ble konstruert av microinjecting en påvisbar molekyl i en enkel, identifiserbar blastomere og overvåking senere i utviklingen som vev er befolket av merket avkom. Konsistente skjebne kart er mulig fordi kardinal akser embryoene kan bli pålitelig identifisert i mange Embryos. Først, i alle villtype embryoer dyret halvkule er pigmentert, mens vegetal halvkule er ikke. Sekund, fører oppføring av sædceller ved befruktning en sammentrekning av dyret halvkule pigmentering mot framtiden ventrale siden, men i mange embryoer en pigmentering forskjell kan derfor brukes til å diskriminere mellom dorsal og ventrale sider. Tredje, tilnærmer den første cleavage furen midten sagittalplan i de fleste embryoer, og således kan anvendes for å identifisere de høyre og venstre sider av embryoet. Skjebnen over også stole på at naturlig befruktede egg ofte kutter i vanlige mønstre som gjør hver blastomere identifiserbare over en stor bestand av embryoer. Mens det er variasjon innen og mellom klørne egg om pigmentering og cleavage mønstre, bruker utvelgelsesprosedyrer beskrevet gjør her celler med foreskrevne skjebner å bli identifisert med om lag 90% nøyaktighet.
Cell skjebner kan avskrekkeminelagt under embryogenese av flere mekanismer. Vesentlige faktorer, slik som differensielt arvet cytoplasmatiske mRNAer eller proteiner, bidra til flere aspekter av tidlig mønster. For eksempel spesifikke maternelle mRNAs bestemme hvilke celler vil bidra til kjønnsceller, bli endoderm, eller bidra til dorsal kroppen aksen (anmeldt i 7). Extrinsic faktorer som tilbys lokalt av nabocellene eller mer fjernt fra en embryonale signalering sentrum, er ansvarlig for å indusere spesifikke vevstyper og mønster nesten alle organer system. Eksempler av signalmolekyler sentre inkluderer arrangør / noden i gastrula som induserer nevrale ektoderm og mønstre mesoderm, og sonen med polariserende aktivitet at mønstre anterior-posterior aksen av lem knopp. Selv skjebne kartene identifisere forløperne av de forskjellige organer og avsløre utviklingsmessige banen tatt av deres etterkommere i normal embryo, kan de ikke skille mellom iboendeog ytre påvirkninger på disse cellene. De også ikke avsløre hele utviklingsmessige potensialet i en celle, hvis etterkommere skille i det komplekse signaliserer miljø av embryo. To eksperimentelle tilnærminger kan teste hvorvidt en celle skjebne bestemmes av vesentlige faktorer eller er i ettertid påvirket av ytre faktorer: 1) transplantasjon av cellen til en roman plassering i embryo, eller 2) fjerning av cellen fra embryoet etterfulgt av kultur i fravær av eksogene signaler.
Både eksperimentelle tilnærminger har vært gjennomførbart i Xenopus fordi cellene er store nok til å bli manuelt atskilt. For eksempel har en rekke studier slettet enkeltceller fra embryoer (for å endre celle-celle interaksjoner) eller transplanterte celler til nye steder i vert embryoer å teste for skjebnen endringer (gjennomgått i 7, 8, 9). I tillegg, den andre tilnærming eksplanteres lite antall celler fra forskjellige regioner av embryoet into kultur å belyse induktive vev interaksjoner i fravær av eksogene faktorer er mulig fordi cellene i Xenopus embryoet er fylt med en intracellulær næringsstoff butikk, eggeplomme blodplater. Derfor kan de bli dyrket i noen få dager i en definert salt medium uten ernæringsmessig eller vekstfaktor supplering av dyrkningsmediet. Vi har brukt denne tilnærmingen for å vise at dorsal dyr blastomeres har et autonomt evne til å produsere neurale og dorsal mesodermal vev grunnet mordyret arvet 10 mRNAs, 11, og andre viste at mesoderm spesifikasjon av 32-celle blastomeres avhengig både indre og ytre informasjon 12 . En fordel av dyrkning celler som eksplanter er at mediet kan også suppleres med definerte signalering faktorer for å finne hvilken celle-til-celle-kommunikasjon pathway kan påvirke skjebnen av eksplantert celle 12, 13, 14. I tillegg kan en injisere blastomere prior til kultur med mRNA til over-express et gen, eller med anti-sense oligonukleotider å hindre oversettelse av endogene mRNAs. Disse, gevinst-og tap-av-funksjon analyser kan identifisere hvilke molekyler er nødvendig for en selvstendig uttrykk skjebne. Å analysere skjebnen til eksplantering, kan identifisering av spesifikke celletyper utføres av standard genekspresjon (f.eks in situ hybridisering, RT-PCR) og immuncytokjemisk analyser. Denne protokollen gir en enkel, men kraftig, måten å skille mellom indre og ytre mekanismer som regulerer hvordan en embryonal celle utvikler seg til spesifikke vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse av instrumenter, Dyrkningsmedier og retter
- Skjerpe fire tang med Alumina slipende film. Gjøre dette under en disseksjonsmikroskop å overvåke dysestørrelse. Ett pinsett fungerer som en back-up i tilfelle en dyse skadet under prosedyren. Autoklaveres alle fire pinsett og lagre i en steril beholder.
- Gjør 500 ml hver av 0.1X og 1.0x kultur medium (enten Marc modifiserte Ringers [MMR] eller endret Barth Saline [MBS]; oppskrifter i 15) og filter sterilisere. Vi rutinemessig bruk MBS (1X = 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 5 mM HEPES [pH 7,8], 2,5 mM NaHCO 3). Oppbevares ved 14-18 ° C i månedsvis.
- Gjøre en 2% agarose-løsning i dyrkingsmedium (2 g elektroforese grade agarose i 100 ml 1X dyrkningsmedium i en skrukork glassflaske). Autoklaveres å oppløse agarose. Dette kan lagres ved 4 ° C i flere måneder, og microwaved å kondensere agarosen neste gang det blir nødvendig.
- Mens agarose er flytende, helles ca 0,5 ml på bunnen av hver brønn i en steril 24-brønners kultur-plate. Dette vil hindre at explants fra stikker til plast.
- Mens agarose er flytende, hell ca 2-3 ml på bunnen av to til tre 60 mm petriskåler, og virvel forsiktig for å sikre at bunnen er dekket. Disse vil fungere som disseksjon retter og agarose hindrer befruktede egg fester seg til plasten når deres membraner er fjernet.
- Når agarosen er avkjølt og herdet, flamme tuppen av en 6 "Pasteur pipette til den smelter til en ball, og så vidt berører den på overflaten av agarose i hver brønn på dyrkingsplate. Dette vil opprette en grunn fordypning i hvilken den eksplantering skal plasseres.
- Fyll hver brønn av kulturen plate med 1X sterilt kulturmedium.
- Når agarose er avkjølt og herdet, fyll disseksjon parabolen med fortynnet kultur medium (0.1X MMR eller 0.1X MBS) å legge til rette blastomere separasjon.
2. Valg av embryo
- Skaffe befruktede egg og fjern gelé strøk i henhold til standard protokoller 15. Overføre dem til 0.5x kultur medium i en 100 mm petriskål.
- Når embryoer nå 2-celle stadiet, sortere de hvori første cleavage furen bisects lett pigmentert område i dyret halvkule (figur 1) i en separat form. Disse vil være donorer for explants. Hold de resterende 2-celle embryo i en egen rett ved siden av donor embryoer hele prosedyren for å tjene som søsken kontroller for å iscenesette explants.
3. Utarbeidelse av explants
- Plasser 5-10 embryoer i et disseksjon tallerken, men kan bare utføres på en embryo av gangen.
- Plasser første embryoet så gjennomsiktig vitelline membranen kan sees, det er atskilt med en klaring (perivitelline plass) over overflaten av dyret pol av embryo. Ved hjelp av en skjerpet kraftps i ens subdominant hånd (venstre hånd hvis man er høyrehendt), ta tak i vitelline membran over perivitelline plass. Bruke en skjerpet pinsett i den andre hånden, grip membranen nær den første tang spissen, og trekk i motsatte retninger for å skrelle membranen bort. Gjøre den innledende grep i en avstand fra den celle som skal dissekert, slik at målcellen ikke er skadet under fjerning av membranen. Man kan si at membranen er fjernet fordi fosteret vil flate.
- Hente en nabo celle med pinsett i subdominant hånden og bruke denne cellen som en "håndtak" slik at cellen skal dissekert ikke er direkte berørt. Med pinsettangens i den andre hånden, forsiktig trekke de gjenværende nabocellene vekk fra ønsket blastomere. Hvis midtlinjen celler, som deler samme skjebne, er målrettet, kan de fjernes sammen som et par. Endelig, dissekere bort "håndtaket" cellen.
- Plukke opp blastomere (eller blastomere pair), med en steril, Glass Pasteur pipette, unngå luftbobler og overdreven sug. Pipetten kan være brann-polert for å fjerne skarpe kanter som kan skade cellen, men vi har ikke rutinemessig gjør dette. Plasser tuppen av Pasteur pipette under overflaten av kulturmediet i en brønn av den eksplantasjon kultur parabol, og forsiktig utvise blastomere. Det skal gli inn i den grunn fordypning ved hjelp av tyngdekraften. Samme blastomere fra mer enn ett embryo kan kombineres i en enkelt eksplantasjon.
- Gjenta denne prosedyren med de gjenværende embryo i disseksjon parabolen, en etter en. Etter ca 10 embryoer, vil disseksjon parabolen fylles med celle-debris. Når dette skjer, bytt til en ny disseksjon parabolen.
- Etter at alle disseksjoner er ferdig, sjekk om explants er i grunne forsenkninger. Hvis ikke, kan de bli forsiktig presset inn i forsenkningen med et hår løkke som har blitt sterilisert i 70% etanol og lufttørket.
- Omtrent en time etter siste disseksjon, fjerne rusk surrounding den helbredede eksplanter med en steril, glass Pasteur pipette.
- Kultur plate av explants ved 14-20 ° C ved siden av petriskål inneholder søsken, kontroll embryoer. Søsken embryo vil indikere den fasen av utviklingen av de blastomere explants.
4. Innhøsting explants for analyse
- Høste explants når søsken når ønsket utviklingsstadiet. Disse eksplanter overleve ganske godt selv om noen av cellene i oppløsning. Derfor, hvis det er en uklar masse i kulturen godt, utforske den med et hår loop eller pinsett for å fastslå om en sunn eksplantasjon er begravd innenfor.
- Plukke opp eksplanter i et lite volum av kultur løsning med et glass Pasteur-pipette, og forsiktig utvise dem inn i en eller fiksativ lyseringsbuffer hensiktsmessig for analysen som skal utføres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Evnen av denne analysen for å nøyaktig vurdere utviklingsmessige potensialet av cellen er avhengig dissekere ut riktig blastomere basert på skjebnen 1 kartene, 2, 3, 4, 5, 6. Derfor er det viktig å velge embryoer med riktig pigmentering mønster på det 2-celle stadiet, som illustrert i figur 1, som senere oppfyller vanlige kutteseter mønstre, som vist i figur 2. Hvis man observerer sortert embryoer som de når ønsket cleavage scenen og skiller ut embryoene viser irregulære cleavages, nøyaktighet kraftig forbedret. Som illustrert i figur 2, regelmessige cleavages ofte forekommer bare på én side av embryo. Disse embryoer kan brukes som donorer hvis donorcellen stammer fra den "vanlige" side. Fordi vanlige cleavage mønstre er funnet i færre embryoer som celledeling provenyet, sortere omtrent fem ganger så mange embryoer som du har tenkt å dissekere. Naturligvis fertilized egg tendens til å ha mer regelmessige cleavages enn in vitro befruktede egg. Selv kutteseter mønstre varierer mye innenfor en enkelt clutch av egg, kan en forvente minst 10-20% for å være nyttig for denne typen av en manipulasjon.
Blastomeres kan dyrkes alene eller i små grupper. Når blastomeres blir først dissekert (figur 3A), og overføres til kulturen godt (Figur 3B, C), er de myke og skjøre. I vår erfaring, dyr og ekvator blastomeres er mye lettere å dissekere og kultur enn vegetal blastomeres (figur 3C). Kanskje fordi de er mindre, er de lettere å overføre. De synes også å leges raskere når nicked med pinsett. Vegetal cellene ofte synes å fullføre cytokinese saktere og dermed beholde cytoplasmatiske broer med søsteren celler, noe som gjør dem mer "lekk" når dissekert, og cellemembranen er mer skjøre og lettere til skade.Etter ca 1-2 timer i kultur, vil det eksplanterte blastomere (e) har delt ca 4 ganger og sloughed av det meste av rusk igjen fra skadede nabocellene (figur 3D). Etter 20 timer, danner de små, solide baller av celler (figur 3E). Mens noen kan være begravet i rusk, ofte en sunn masse kan bli funnet (Figur 3E, til venstre).
Selv om eksplanter er små, overlever de prosessering, for in situ hybridisering, så vel som de mer vanlig brukte animal cap eksplanter, som tillater en å overvåke senere genekspresjon. I eksperimentet vist i figur 4A, ble to dorsal blastomeres (D1.1) eller to ventrale blastomeres (V1.1) dissekert ved 16-celle stadiet og kultivert i 1X MBS ved 14 ° C inntil søsken embryoer nådde tidlig nevrale plate stadier (ST12-13, om 20-22 timer etter dissekere). Hver prøve ble analysert for ekspresjon av en zygotic nevrale plate genet (Sox2 </ Em>) ved in situ hybridisering (det blå reaksjonsprodukt). Denne analysen viser at flertallet av dorsal dyr blastomeres, som er forløpere for den nevrale plate, kan uttrykke Sox2 selvstendig, det vil si uten ekstra signalering fra andre regioner av embryo. De eksplanter som ikke uttrykker Sox2 kan ha blitt feilaktig identifisert ved disseksjon. I kontrast, ingen av de ventrale animalske blastomeres, som er forløpere for den ventrale epidermis, ekspress Sox2. Dermed konkluderer vi med at dorsal dyr blastomere har en iboende evne til å danne nevrale vev, mens de ventrale dyr blastomeres ikke. Merk at noen av de D1.1 explants har også eIongated, en morfologi som indikerer dorsal mesoderm formasjon, og disse blastomeres også er skjebnebestemt til å danne notochord i intakt embryo 3, og i eksplantering kultur uttrykker notochord markør protein 10. Blastomere iboende skjebner kan være altere d etter avtale mikroinjeksjon av mRNA (gain-of-funksjon) eller anti-sense morfolino oligonukleotider (MOS, tap-av-funksjon). I figur 4B, er effekten av å endre de endogene nivåene av et mordyret uttrykt neural genet, foxD5 16, 17, testet. Når den endogene nivået av FoxD5 ble økt ved å injisere foxD5 mRNAs inn i 8-cellers forløper blastomeres av V1.1 (nederste rad), uttrykte flertallet av V1.1 explants (dyrket til st 12-13) Sox2. Omvendt, når den endogene nivået FoxD5 ble redusert ved injeksjon av MOS i 8-celle forløperforbindelser blastomeres av D1.1 (øverste rad), uttrykt bare noen D1.1 eksplanter (dyrket til st 12-13) Sox2 (sammenligne toppraden av figur 4A). Disse eksperimentene viser at mors uttrykk for foxD5 spiller en rolle i den iboende evne dorsal blastomeres å få en neural skjebne.
ftp_upload/4458/4458fig1.jpg "alt =" Figur 1 "/>
Figur 1. Pigmentering mønstre i 2-celle embryo fra naturlig befruktede egg. Første cleavage fure er angitt med en pil. A) Et eksempel på et embryo som ikke bør brukes til å identifisere blastomeres på senere stadier fordi lett pigmentert regionen dyret halvkule av embryoet er inneholdt det meste i en celle (til venstre). Siden den første cleavage fure spår midten sagittalplan av embryoet vil lett pigmentert regionen denne embryo ikke identifisere dorsal. B) To eksempler på befruktede egg som bør sorteres for Eksplantasjon kulturer. I begge, er det lett pigmentert regionen av dyret halvkule (*) delt i to av den første cleavage fure. Embryoet til venstre er tidlig i den første cellen syklus, og lett pigmentert området er bare synlig i ca 25% av celleoverflaten. Embryoet på høyre nærmer seg slutten av den første cellen syklus, og at pigmentet har flyttet ventrally slik dorsal halvdeler av de to cellene er lysere. Som et resultat, ved senere stadier de lett pigmenterte dyreceller vil forutsi dorsal (d) og mørkt pigmenterte dyreceller vil forutsi ventrale (v).
Figur 2. Eksempler på cleavage scenen embryoer fra naturlig befruktede egg. Alle embryoer er orientert med dyret polen mot leseren, dorsale til toppen. A) 4-celle embryoer. Embryoet til venstre har nettopp kommet inn andre cellesyklus så cleavage furer er grunne. Embryoet til høyre har nesten fullført den andre cellesyklus så cleavage furer er dypere og cellene vises mer avrundet. Svarte pilene peker til den første cleavage fure, og røde pilene peker til andre cleavage fure. B) 8-celle embryoer. Embryoet til venstre er tidlig tredje cellesyklus og embryoet til høyre er i nærhetenslutten av den tredje cellesyklus. C) 16-celle embryo. C 'er et eksempel av uregelmessige cleavages som må unngås. C "er et eksempel på regulære spaltinger på ventrale side, men uregelmessig på ryggsiden. C'' 'er et eksempel på flere regelmessige spaltinger på dorsal side, men ikke på ventrale siden. C'''' er et eksempel av vanlige spaltinger ved midtlinjen, men ikke sideveis. D) 32-celle embryoer. d 'er et eksempel av vanlige spaltinger på den ventrale siden, men uregelmessig på ryggsiden. D'' er et eksempel av vanlige spaltinger på dorsal side, men ikke på ventrale siden. D'' 'er et eksempel av vanlige spaltinger på høyre side, men mer uregelmessige spaltinger på venstre side. E) 64-celle embryoet. For en skjematisk representasjon av disse trinnene, vennligst se den Nieuwkoop og Faber staging-serien, som kan bli funnet på nettet ( http://www.xenbase.org/anatomy/alldev.do ).
Figur 3. Explants fra 16-celle embryo fra naturlig befruktede egg. A) En ventrale dyr blastomere kort tid etter disseksjon. Arrow betegner rester av "håndtaket" cellen. B) En ventrale dyr blastomere overført til en kultur brønn som har delt en gang. C) En ventrale vegetal blastomere kort tid etter disseksjon. Sammenlignet med dyr blastomeres, disse er større, og vanskeligere å manipulere. D) To ventrale dyr blastomere explants, 2 timer etter disseksjon, har delt omtrent fire ganger. Den venstre eksplantasjon er sett fra den opprinnelige, pigmentert ytre overflate blastomere, riktig eksplantasjon er sett fra den opprinnelige, upigmentert indre overflate blastomere. E) To ventrale dyr blastomere explants dyrket i 24 timer. Den venstre eksplantering sitter i en seng av mobilnettet rusk (piler), mens den høyre eksplantering er fri for enhver detritus. Alle bilder er på 50X Magnification.
Figur 4. In situ hybridisering analyse av genuttrykk i explants stammer fra 16-celle blastomeres dissekert fra naturlig befruktede egg. A. Den 16-cellers embryo på venstre illustrerer dorsal blastomere par (D1.1) som ble eksplantert for resultatene i den øverste raden, og ventrale blastomere par (V1.1) som ble eksplantert for resultatene i den nederste raden. Dissekert blastomere parene fra uninjected embryoer ble plassert i 0.1X MBS i kultur brønner og inkubert ved 14 ° C i ca 20 timer. De ble samlet i rør av fiksativ og behandles ved in situ hybridisering for ekspresjon av et zygotic nevral gen, Sox2. B. blastomeres av 8-celle stadiet embryoer ble injisert bilateralt entenmed foxD5 Mos, for å redusere endogen uttrykk i dorsal blastomeres, eller med foxD5 mRNA å øke endogent uttrykk i ventrale blastomeres. Når det injiserte embryoer nådde 16-celle stadiet (20-30 minutter senere), ble blastomere parene dissekert, dyrket og analysert ved in situ hybridisering som i A. Antallet explants som uttrykker Sox2 er betydelig redusert i D1.1 explants som ble injisert med foxD5 MOS (sammenligne øverste rad i A). Antallet explants som uttrykker Sox2 er betydelig økt i V1.1 explants som ble injisert med foxD5 mRNA (i forhold til nederste rad i A). Klikk her for å se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mest kritiske trinn for vellykket dyrkning av individuelle blastomeres er: 1) fullstendig identifisere blastomere interessante, 2) å opprettholde en steril, sunn kultur, 3) dissecting celler ved den korrekte del av cellesyklusen, og 4) å utvikle den nødvendige manuelle fingerferdighet å unngå skader under disseksjon og overføre til kulturen godt.
Å manipulere spesifikke blastomeres, er det viktig å være i stand til å identifisere kardinal aksene. I Xenopus embryo kan ryggsiden identifiseres ved tre metoder: (1) merking sperm inngangspunkt med en vital 18 fargestoff, 19, (2) tipping i vitro befruktede egg og merking en side 18, 19, eller (3) velge embryoer under den 2 cellestadiet der første cleavage furen bisects lett pigmentert regionen i dyret 20 halvkule, 21. Vi bruker den tredje metoden, som nøyaktig identifiserer blastomeres fra naturlig fertilized 16-celle embryo i ca 90% av tilfellene 20, 21. Ved befruktning, begynner dyret halvkule pigmentering til kontrakt mot sperm inngangspunkt på den ventrale siden, forårsaker dorsal dyret regionen til å bli mindre pigmentert i et flertall av embryoer (figur 1). Det er stor variasjon i omfanget av dette lett pigmentert regionen på tvers av clutcher og selv innenfor klørne Xenopus egg. Hvis den første cleavage furen halverer dette lysere område likt mellom de to dattercellene, deretter at lysere området kan brukes som mål på den dorsale side, og den første cleavage furen vil indikere midten sagittalplan. Hvis den første cleavage fure skiller døtrene til en mørk celle og en lys celle, ikke bruk det for eksplantering fordi pigmentering på senere stadier vil ikke nøyaktig identifisere dorsal side. Tidligere studier viste at i slike embryoer første cleavage fure forble en markør for than mid-sagittalplan mens lett pigmentert regionen ikke lenger indikerte dorsal side 20, 21. Embryo kan også velges på den tidlige del av den 4-cellers cleavage (venstre embryo i figur 2B), når den første og den andre furer ved vegetal pol kan fortsatt være fremstående, den første fure bør være fullført, og den andre furen ikke ennå fullføre. Hvis, derimot, venter en til slutten av den 4-celle stadiet for å velge embryoer (høyre embryo på figur 2B), furer første og andre cleavage kan ikke lenger skilles, og de lett pigmenterte celler kan være dorsal seg i bare ca 70% av embryoer 20, 21. Dette vil gjøre rettet mot bestemte blastomeres mye mindre nøyaktige. Det bør bemerkes at andelen av embryoer der første cleavage furen bisects lett pigmentert regionen varierer mye tvers clutcher. Etter vår erfaring kan de utgjøre <50% av eggene i en clutch til> 80% Av eggene i en clutch. Uansett, det nesten alltid er nok egg i en clutch av sunne egg som oppfyller dette kriteriet for å støtte en eksplantering eksperiment.
De to anbefalte kultur media (MMR, MBS) er tilnærmet utskiftbare; preferanser ulike laboratorier er for det meste historisk. MMR kan lagres som en 10X løsning for et år eller mer. MBS har kortere holdbarhet fordi den er bufret med bikarbonat. Fordi embryo og explants kan bukke under for bakteriell infeksjon uten beskyttende gele og vitelline membraner, bør tang og vekstmedium være steril. Hvis eksplanter ikke overlever godt, kan antibiotika tilsettes kulturmediet (f.eks 0,1% gentamicin). Løsninger inneholdende gentamicin har kort holdbarhet, og dermed bør gjort frisk på dagen de skal benyttes. Mobilnettet rusk inneholder proteaser som vil skade de ubeskyttede explants, og fremmer bakterievekst. Derfor bør det være remoget fra kultur brønner etter at explants har hatt en sjanse til å helbrede.
Blastomere disseksjoner utføres i fortynnet kulturmediet (0.1X MBS eller 0.1X MMR) for å minske styrken av celle-til-celle adhesjon. Under Xenopus cleavage stadier, er celleadhesjon meste oppnås ved calcium-/magnesium-dependent cadherins. Derfor er det ikke nødvendig å bruke enzymatisk dissosiasjon, faktisk dette bør unngås fordi det fjerner overflateproteiner som kan være viktig på skjebnen besluttsomhet hendelser. Fordi embryonale celler fra ulike grupper av egg holder seg med forskjellige styrker, kan utvanning av disseksjon medium må justeres på ad hoc basis. Hvis cellene er for vedheftende å dissekere uten å rive dem, lavere konsentrasjon av disseksjon mediet trinnvis fra 0.1X. Motsatt, hvis cellene falle fra hverandre når den vitelline membranen fjernes og er svært utett, øker konsentrasjonen av dissection medium trinnvis. Men ikke bruk calcium-/magnesium-free media fordi cellene blir for skjør til å overføre til kultur brønner. Vellykket separasjon av blastomeres avhenger også på når under cellesyklusen en utfører disseksjon. Som vist i figur 2, tidlig i cellesyklus spaltingen furer er grunne og blastomeres er flatet. Senere i syklusen cleavage furer er dypere og cellene er mer avrundet. Tidlig i cellesyklus, er det cytoplasmatiske broer som vil føre cytoplasmisk lekkasje hvis brutt. Derfor, blir cellene lettere dissekert sent i cellesyklus. 4-cellers embryo, 8-cellers embryoer, og vegetal celler i alle ledd er vanskeligere å dissekere fordi cytoplasmatiske broer vedvarer lenger. Man kan forutse en høy dødsrate for disse explants, noe som betyr en trenger å utføre flere disseksjoner å gjenopprette en rimelig utvalgsstørrelsen. Man kan vente til begynnelsen av neste cleavage furen å starte dissection av disse cellene for å sikre at de cytoplasmatiske broer har lukket. Mens single blastomeres tatt fra 8 - og 16-celle embryo overlever godt i kultur, i vår erfaring eldre blastomeres fare mindre godt som enkeltceller. Selv om vi ikke vet årsaken til dette, kan overleve eldre blastomere eksplanter forbedres ved å dissekere flere (2-6) av den samme blastomere fra forskjellige embryoer og dyrking dem sammen i en enkelt kultur godt 10, 13, 14.
Denne fremgangsmåten krever praksis og noen fingerferdighet. Fordi tiden mellom cleavages er temperaturavhengig, er det praktisk å lagre embryoer ved 14-16 ° C for å senke spalting og tillate mer tid til å gjennomføre disseksjoner. Imidlertid vil embryoer ikke tolerere temperaturer lavere enn 14 ° C. Den første utfordringen i denne prosedyren er å fjerne vitelline membran. Det er best å ikke gå videre til blastomere disseksjon til dette første trinnet er mestret. Når dissekereut blastomere, er "håndtaket" cellen sannsynligvis lekke og falle fra hverandre. Dette er ikke et problem fordi når alle de andre celler skrelles bort fra den ønskede celle, kan den "håndtaket" cellen fjernes med tang. Håndtaket celle restene samt annet rusk vanligvis faller bort når blastomere overføres til kulturen godt (Figur 3B). Blastomeres holde ivrig til plast, så bruk bare glass pipetter for å overføre dem. Bruk minimalt suger press på cellen, fordi det kan gå i oppløsning fra de skjærkrefter i pipetten. Også unngå luftbobler i pipetten og sørge for at spissen av pipetten er under overflaten av kulturmediet når eksplantasjon er utvist fordi cellene vil eksplodere hvis de kommer en luft-vann-grensesnittet.
Protokollen er beskrevet her bruker unmanipulated embryoer som givere for explants og enkle salt media for dyrking. Disse tillater en å teste den iboende evne til eksplantering til exprESS spesielle skjebner. Denne metoden kan være eksperimentelt utvides på to måter. Først, kan dyrkningsmediet suppleres med signalering / vekst faktorer å teste om disse molekylene kan føre eksplantasjon å uttrykke alternative fates. Sekund, kan genekspresjonen av donor embryoene endres ved å injisere enten mRNAer (gain-of-funksjon) eller anti-sense morfolino oligonukleotider (tap-av-funksjon) til spesifikke forløpere før blastomere disseksjon. Dette kan gjøres ved 1-celle stadiet, eller i en mer målrettet måte ved 1-2 celledelinger før disseksjon. Med disse metodene, kan en teste hvorvidt en bestemt eksogent medfølgende genet fører til en blastomere å erverve en alternativ skjebne, eller om en bestemt endogen gen er nødvendig for å uttrykke sin blastomere autonome skjebne (f.eks, Figur 4B). Dette er kraftige eksperimentelle tilnærminger fordi de eliminere confounding påvirkning av de andre cellene og signalering centers stede i den intakte embryo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å erkjenne GWU Harlan Fellowship for støtte av Paaqua Grant og GWU Luther Rice Fellowship for støtte av Mona Herold. Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation stipend MCB-1121711.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-38 | Course (12 μm), for major repairs of forceps tips |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-46 | Medium (3 μm), for fine sharpening of forceps tips |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-54 | Fine (0.3 μm), for polishing of forceps tips |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | #11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. Corrosive resistant so they can be autoclaved. |
| Gentamicin solution | Sigma | G1397 | Add to medium on same day as use |
References
- Dale, L., Slack, J. M. Fate map of the 32-cell stage of Xenopus laevis. Development. 100, 279-295 (1987).
- Masho, R., Kubota, H. Y. Developmental fates of blastomeres of the eight-cell stage Xenopus embryo. Dev. Growth, Diff. 30, 347-359 (1988).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 119, 560-578 (1987).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 122, 300-319 (1987).
- Moody, S. A., Kline, M. J. Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres. Anat. Embryol. 182, 347-362 (1990).
- Takasaki, H. Fates and roles of the presumptive organizer region in the 32-cell embryos in normal development of Xenopus laevis. Dev. Growth, Diff. 29, 141-152 (1987).
- Sullivan, S. A., Moore, K. B., Moody, S. A. Chapter 20 Early events in frog blastomere fate determination. Cell Fate and Lineage Determination. Moody, S. A. , Academic Press. 297-321 (1999).
- Moore, K. B., Moody, S. A. Animal-vegetal asymmetries influence the earliest steps in retinal fate commitment in Xenopus. Dev. Biol. 212, 25-41 (1999).
- Yan, B., Moody, S. A. The competence of Xenopus blastomeres to produce neural and retinal progeny is repressed by two endo-mesoderm promoting pathways. Dev. Biol. 305, 103-119 (2007).
- Gallagher, B. C., Hainski, A. M., Moody, S. A. Autonomous differentiation of dorsal axial structures from an animal cap cleavage stage blastomere in Xenopus. Development. 112, 1103-1114 (1991).
- Hainski, A. M., Moody, S. A. Xenopus maternal mRNAs from a dorsal animal blastomere induce a secondary axis in host embryos. Development. 116, 347-3345 (1992).
- Godsave, S. F., Slack, J. M. Single cell analysis of mesoderm formation in the Xenopus embryo. Development. 111, 523-530 (1991).
- Hainski, A. M., Moody, S. A. An activin-like signal activates a dorsal-specifying RNA between the 8- and 16-cell stages of Xenopus. Dev. Genetics. 19, 210-221 (1996).
- Pandur, P. D., Moody, S. A. Multiple maternal influences on dorsal-ventral fate of Xenopus animal blastomeres. Dev. Dyn. 225, 581-587 (2002).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Sullivan, S. A., Akers, L., Moody, S. A. foxD5a, a Xenopus winged helix gene, maintains an immature neural ectoderm via transcriptional repression that is dependent upon the C-terminal domain. Dev. Biol. 232, 439-457 (2001).
- Yan, B., Neilson, K. M., Moody, S. A. FoxD5 plays a critical upstream role in regulating neural fate and onset of differentiation. Dev. Biol. 329, 80-95 (2009).
- Vincent, J. -P., Gerhart, J. C. Subcortical rotation in Xenopus eggs: an early step in embryonic axis specification. Dev. Biol. 123, 526-539 (1987).
- Peng, H. B. Appendix A: Solutions and Protocols. Methods in Cell Biology. 36, 657-662 (1991).
- Klein, S. L. The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos. Dev. Biol. 120, 299-304 (1987).
- Masho, R. Close correlation between the first cleavage plane and the body axis in early Xenopus embryos. Dev. Growth Diff. 32, 57-64 (1990).
