Summary
ويمكن أن يتأثر مصير خلية جنينية عن طريق الجزيئات الفردية الموروثة و / أو عن طريق إشارات من الخلايا المجاورة. استخدام الخرائط مصير الجنين مرحلة الانقسام القيطم، يمكن تحديد blastomeres واحدة للثقافة في عزلة لتقييم مساهمات جزيئات الخلية الموروثة مقابل خلية التفاعلات.
Abstract
خرائط مصير، التي شيدت من النسب تتبع كافة الخلايا من الجنين، التي تكشف الأنسجة ينزل من كل خلية من خلايا الجنين. على الرغم من أن مصير خرائط مفيدة جدا لتحديد السلائف من جهاز لتوضيح والمسار التنموي الذي الخلايا سليل ملء هذا الجهاز في الجنين الطبيعي، فإنها لا توضح الإمكانات الكاملة التنموية للخلية السلائف أو تحديد الآليات التي يتم تحديد مصيرها. لاختبار التزام مصير الخلية، واحدة يقارن مرجع الخلية العادية من أصل أفريقي في الجنين سليمة (خريطة مصير) مع الآراء التي أعرب بعد التلاعب التجريبية. ومصير الخلية ثابتة (الملتزم) بغض النظر عن البيئة المحيطة الخلوية، أم أنها تتأثر بعوامل خارجية المقدمة من جيرانها؟ باستخدام خرائط شاملة مصير الجنين القيطم، ونحن تصف كيفية تحديد وعزل ودعا ثقافة الانقسام المرحلة السلائف واحد، الأرومةمرس. هذا النهج يسمح احد لتقييم ما إذا كانت تلتزم هذه الخلايا في وقت مبكر لمصير يكتسبون في بيئتها الطبيعية في الجنين سليمة، يتطلب التفاعل مع الخلايا المجاورة لها، أو يمكن أن تتأثر للتعبير عن مصائر بديلة إذا تعرضت إلى أنواع أخرى من الإشارات.
Introduction
وقد استخدمت على نطاق واسع المورق القيطم الأجنة للتعرف على الآليات التي الخلايا الجنينية الحصول على مصائرهم محددة لبيضها هي كبيرة بما يكفي للسماح النهج المجهرية. بالإضافة إلى ذلك، فإنها تضع خارجيا دون الحاجة للمكملات الغذائية للثقافة المتوسط لأن كل خلية تحتوي على إمدادات الغنية داخل الخلايا الصفائح الدموية صفار التي توفر مخزن الطاقة الذاتية. رصيدا هاما لدراسة الآليات التي يتم تحديد مصير الخلية هي مجموعة شاملة من خرائط مصير blastomeres مرحلة الانقسام (من 2 - من خلال 32-الخلية مراحل) 1، 2، 3، 4، 5، 6. تم بناء هذه الخرائط من قبل microinjecting جزيء كشف في قسيم أرومي، واحدة للتحديد ورصد في وقت لاحق في التنمية التي يتم ملؤها من قبل الأنسجة ذرية المسمى. خرائط مصير يتفق ممكنة لأنه لا يمكن للمحاور الأساسية للأجنة التي تم تحديدها بشكل صحيح في كثير من امبرينظام التشغيل. أولا، في جميع الأجنة النوع البري نصف الكرة الحيوان مصطبغة، في حين أن نصف الكرة نباتية ليست كذلك. ثانيا، دخول الحيوانات المنوية في الإخصاب يسبب انكماش للحيوان تصبغ نصف الكرة نحو الجانب البطني في المستقبل؛ في الأجنة العديد من الفرق تصبغ بالتالي يمكن استخدامها للتمييز بين الجانبين الظهرية والبطنية. ثالثا، ثلم الانقسام يقارب 1 يمكن استخدام الطائرة منتصف السهمي في معظم الأجنة، وبالتالي لتحديد الجانبين الأيمن والأيسر من الجنين. الخرائط مصير تعتمد أيضا على حقيقة أن البيض المخصب بشكل طبيعي في كثير من الأحيان يلتصق في أنماط منتظمة التي تجعل كل قسيم أرومي التعرف عبر عدد كبير من الأجنة. بينما هناك تفاوتا داخل وبين براثن البيض والانقسام بشأن تصبغ أنماط، وذلك باستخدام إجراءات الاختيار وصف يسمح هنا الكشف عن هويته الخلايا مع مصائر المقررة بدقة حوالي 90٪.
يمكن أن مصير الخلايا ردعالملغومة خلال مرحلة التطور الجنيني من عدة آليات. العوامل الذاتية، مثل mRNAs وحشوية ورثت تفاضلي أو البروتينات، والمساهمة في العديد من جوانب الزخرفة في وقت مبكر. على سبيل المثال، mRNAs والأمهات محددة تحديد الخلايا التي ستسهم في خط الجرثومية، تصبح الأديم الباطن، أو المساهمة في محور الجسم الظهرية (في تاريخ 7). عوامل خارجي المقدمة محليا من قبل الخلايا المجاورة أو أكثر بعيدة من مركز إشارات الجنينية، هي المسؤولة عن إحداث أنواع الأنسجة محددة والزخرفة تقريبا كل نظام الجهاز. أمثلة على مراكز يشير تشمل المنظم / عقدة في المعيدة أن الحث على الأديم الظاهر العصبي وأنماط الطبقة الجرثومية الوسطى، ومنطقة استقطاب نشاط أنماط المحور الأمامي الخلفي من برعم الطرف. على الرغم من أن خرائط تحديد مصير السلائف من مختلف الأجهزة والكشف عن المسار التنموي الذي اتخذته أولادهم في الجنين الطبيعي، فإنها لا يمكن التمييز بين الذاتيةوالتأثيرات الخارجية على تلك الخلايا. كما أنها لا تكشف عن الإمكانات الكاملة التنموية للخلية، التي تفرق أحفاد في بيئة معقدة من الإشارات الجنين. يمكن نهجين التجريبية اختبار ما إذا كان يتم تحديد مصير الخلية من العوامل الجوهرية أو يتأثر لاحقا من قبل العوامل الخارجية: 1) زرع الخلية إلى موقع الرواية في الجنين، أو 2) إزالة الخلايا من الجنين تليها الثقافة في غياب إشارات خارجية.
وكانت كلا النهجين التجريبية الممكنة في القيطم لأن الخلايا هي كبيرة بما يكفي ليمكن فصلها يدويا. على سبيل المثال، قد حذفت العديد من الدراسات الخلايا من أجنة واحدة (لتغيير خلية خلية التفاعلات) أو الخلايا المزروعة إلى مواقع جديدة في الأجنة المضيفة لاختبار التغييرات مصير (مراجعة في 7 و 8 و 9). وبالإضافة إلى ذلك، فإن النهج الثاني من شرحا أعداد صغيرة من الخلايا من مناطق مختلفة من الجنين أناn لثقافة لتوضيح التفاعلات الأنسجة الاستقرائي في غياب عوامل خارجية ممكن لأن تمتلئ خلايا الجنين القيطم مع تخزين المواد الغذائية داخل الخلايا والصفائح الدموية صفار. ولذلك، يمكن تربيتها أنها لبضعة أيام في المتوسط دون تعريف الملح مكملات الغذائية أو عامل نمو ثقافة المتوسط. وقد استخدمنا هذا النهج لإظهار أن blastomeres الحيوان الظهرية لديها قدرة مستقلة لإنتاج الأنسجة العصبية أرومية متوسطة والظهرية بسبب mRNAs ورثت أمهات 10 و 11، وغيرها أظهرت أن مواصفات الأديم المتوسط من 32 خلية blastomeres تعتمد على كل من المعلومات الجوهرية وخارجي 12 . ميزة زراعة الخلايا كما هو إإكسبلنتس التي يمكن أيضا أن تستكمل المتوسطة مع عوامل محددة لتحديد أي إشارة الخلية الى خلية الاتصال مسار قد تؤثر على مصير الخلية explanted 12 و 13 و 14. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء أن حقن العلاقات العامة قسيم أروميIOR للثقافة مع مرنا لجين لأكثر من صريحة، أو مع مضاد للاحساس [أليغنوكليوتيد] لمنع ترجمة mRNAs والمحلية. يمكن لهذه، وزيادة والخسائر من الوظائف التحليلات التي تتطلب تحديد جزيئات لمصير أعرب مستقل. لتحليل مصير يزدرع، يمكن إجراء تحديد أنواع معينة من الخلايا عن طريق التعبير الجيني القياسي (على سبيل المثال، في الموقع التهجين، RT-PCR) والمقايسات immunocytochemical. هذا البروتوكول يوفر بسيطة، لكنها قوية، وسيلة للتمييز بين آليات الجوهرية وخارجي التي تنظم كيفية خلية جنينية تطور الى أنسجة معينة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد وسائل الإعلام أدوات الثقافة، وأطباق
- شحذ 4 ملقط باستخدام الفيلم جلخ الألومينا. القيام بذلك تحت المجهر تشريح لرصد حجم الإكراميات. زوج واحد من الملقط بمثابة احتياطية في حالة تلف معلومات سرية أثناء العملية. الأوتوكلاف جميع ملقط أربعة وتخزينها في وعاء معقم.
- جعل كل 500 مل من مستنبت 0.1X 1.0X و(إما لمارك معدلة قارعو الأجراس [MMR] أو تعديل لبارت المالحة [MBS]؛ صفات في 15) وفلتر تعقيم. نحن نستخدم بشكل روتيني MBS (1X = 88 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملي بوكل، 0.7 ملي CaCl 2، 1 ملم MgSO 4، 5 مم HEPES [الرقم الهيدروجيني 7،8]، 2.5 ملم NaHCO 3). المحل في 14-18 درجة مئوية لمدة شهور.
- جعل حل الاغاروز 2٪ في المتوسط الثقافة (2 ز الكهربائي الاغاروز في الصف 100 مل مستنبت 1X في زجاجة المسمار CAP). الأوتوكلاف حل الاغاروز. يمكن تخزين هذا في C ° 4 أشهر، وميكرووافيد لتسييل عند الحاجة الاغاروز القادمة عليه.
- في حين أن السائل هو الاغاروز، صب حوالي 0.5 مل على الجزء السفلي من كل بئر من لوحة العقيمة الثقافة 24 أيضا. وهذا سيمنع إإكسبلنتس من التمسك البلاستيك.
- في حين أن السائل هو الاغاروز، صب حوالي 2-3 مل على القعر من سنتين إلى ثلاث أطباق بتري 60 مم، وعباب بلطف للتأكد من تغطية القاع. وهذه بمثابة أطباق تشريح والأجنة الاغاروز يمنع من التمسك البلاستيك مرة واحدة تتم إزالة الأغشية.
- عندما الاغاروز قد بردت وتصلبت، اللهب غيض من ماصة باستور 6 "حتى يذوب في الكرة، ولمس طفيفة على سطح الاغاروز في كل بئر من لوحة الثقافة، وهذا سيخلق الاكتئاب الضحلة التي في سيتم وضع يزدرع.
- ملء كل بئر من لوحة الثقافة مع 1X ثقافة المتوسط العقيمة.
- عندما الاغاروز قد بردت وتصلبت، وملء الطبق مع تشريح ثقافة المتوسط المخفف (0.1X 0.1X MMR أو MBS) لتسهيل فصل قسيم أرومي.
2. اختيار الأجنة
- الحصول على البيض المخصب وإزالة هلام المعاطف وفقا لبروتوكولات المعيار 15. نقلها إلى ثقافة المتوسط 0.5X في طبق بتري 100 ملم.
- عندما تصل إلى مرحلة الأجنة 2-الخلية، فرز تلك التي ثلم الانقسام يشطر 1 المنطقة المصطبغة طفيفة في نصف الكرة الحيواني (الشكل 1) في طبق منفصل. وستكون هذه الجهات المانحة للإإكسبلنتس. الحفاظ على ما تبقى من الخلايا 2-الأجنة في طبق منفصل بجانب الأجنة المانحة في جميع أنحاء الداخلي لتكون بمثابة ضوابط الأخوة لاستضافة إإكسبلنتس.
3. إعداد إإكسبلنتس
- وضع الأجنة 5-10 في طبق تشريح، ولكن تعمل فقط على جنين واحد في كل مرة.
- وضع الجنين أولا حتى يمكن رؤية الغشاء المحي شفافة؛ وفصلها بمسافة واضحة (الحيز المحيط بالمح) فوق سطح القطب الحيواني من الجنين. باستخدام القوة شحذفرع فلسطين في يد واحدة subdominant (اليد اليسرى إذا سلم حق واحد)، فهم الغشاء المحي فوق المحيط بالمح الفضاء. باستخدام ملقط تركيزها في جهة أخرى، فهم على مقربة من غشاء ملقط غيض الأولى، وسحب بلطف في اتجاهين معاكسين لتقشير الغشاء بعيدا. جعل فهم الأولي على مسافة من الخلية التي سيتم تشريح، بحيث لا يتم تلف الخلية المستهدفة خلال إزالة الغشاء. يمكن للمرء أن يقول أنه تمت إزالة الغشاء لأن الجنين سوف تتسطح.
- انتزاع واحدة الزنزانة المجاورة مع ملقط في اليد subdominant واستخدام هذه الخلية بأنها "مؤشر" بحيث لا يتم الخلية إلى أن تشريح لمست مباشرة. مع ملقط في ناحية أخرى، وسحب بلطف الخلايا المتبقية المجاورة بعيدا عن قسيم أرومي المطلوب. في حال استهدفت خلايا خط الوسط، التي تتقاسم نفس المصير، ويمكن إزالتها معا كزوج. وأخيرا، تشريح بعيدا "مقبض" الخلية.
- التقاط قسيم أرومي (أو الزوج قسيم أرومي)، مع العقيمةوالزجاج ماصة باستور، وتجنب فقاعات الهواء والشفط الزائد. يمكن أن تكون ماصة النار مصقول لإزالة الحواف الحادة التي يمكن أن تلحق الضرر الخلية، ولكن لم نفعل هذا بشكل روتيني. وضع غيض من ماصة باستور تحت سطح ثقافة المتوسط في بئر الطبق الثقافة يزدرع، وطرد بلطف قسيم أرومي. ينبغي أن ينزلق الى الكساد الضحلة عن طريق الجاذبية. ويمكن الجمع بين قسيم أرومي نفسه من أكثر من جنين واحد إلى واحد يزدرع.
- كرر هذا الإجراء مع الأجنة المتبقية في طبق تشريح، واحدة تلو الأخرى. بعد حوالي 10 الأجنة، سوف تملأ طبق تشريح بالحطام الخلوي. وعندما يحدث هذا، قم بالتغيير إلى طبق تشريح الطازجة.
- بعد الانتهاء من جميع التشريح، تأكد من أن إإكسبلنتس هي في المنخفضات الضحلة. إن لم يكن، يمكن أن يدفع برفق في الاكتئاب مع حلقة الشعر الذي تم تعقيمها في الايثانول 70٪ والهواء المجفف.
- بعد نحو ساعة من تشريح الماضي، إزالة الحطام surrounding في إإكسبلنتس تلتئم مع معقمة، ماصة باستور الزجاج.
- الثقافة لوحة من إإكسبلنتس في 14-20 ° C بجانب طبق بتري تحتوي على الأخوة والأجنة السيطرة. سوف الأجنة الأخوة تشير إلى مرحلة من مراحل تطور إإكسبلنتس قسيم أرومي.
4. حصاد إإكسبلنتس لتحليل
- حصاد إإكسبلنتس عندما تصل إلى مرحلة الأشقاء المطلوب التنموية. هذه إإكسبلنتس البقاء على قيد الحياة بشكل جيد حتى وإن كانت بعض الخلايا تتفكك. ولذلك، إذا كان هناك كتلة غائم في الثقافة جيدا، واستكشاف مع حلقة أو ملقط شعر لتحديد ما إذا دفن يزدرع صحية داخل.
- التقاط إإكسبلنتس في حجم صغير من محلول الثقافة مع ماصة باستور الزجاج، وطرد منهم بلطف إلى المخزن المؤقت مثبت أو تحلل المناسبة لفحص تجرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
قدرة هذا الاختبار إلى تقييم دقيق لإمكانات النمو للخلية يعتمد على تشريح خارج قسيم أرومي الصحيح يعتمد على مصير الخرائط 1، 2، 3، 4، 5، 6. لذا، فمن الأهمية بمكان اختيار الأجنة مع نمط تصبغ الصحيح في المرحلة 2-الخلية، كما هو موضح في الشكل (1)، التي تتوافق مع أنماط لاحقا إلى الانقسام العادية، كما هو موضح في الشكل 2. إذا كان أحد يلاحظ الأجنة مصنفة حيث تصل إلى مرحلة الانقسام المطلوبة ويفصل من الأجنة تظهر انقسامات غير منتظمة، وتحسنت كثيرا دقة. كما هو موضح في الشكل 2، وغالبا ما تحدث الانشقاقات العادية فقط على جانب واحد من الجنين. ويمكن استخدام هذه الأجنة الجهات المانحة إذا كانت الخلية المانحة تنبع من الجانب "العادية". لأن توجد أنماط الانقسام العادية في أقل الأجنة مع تقدم انقسام الخلايا، نوع حوالي خمسة أضعاف العدد الذي الأجنة تنوي تشريح. بطبيعة الحال والبيض ertilized تميل إلى أن تكون أكثر انتظاما من الانشقاقات في المختبر البيض المخصب. على الرغم من أن أنماط الانقسام تختلف كثيرا داخل مخلب واحد من البيض، يمكن للمرء أن يتوقع على الأقل 10-20٪ أن تكون مفيدة لهذا النوع من التلاعب.
يمكن تربيتها Blastomeres وحدها أو في مجموعات صغيرة. عندما يتم تشريح 1 blastomeres (3A الشكل)، ونقل إلى ثقافة جيدة (الشكل 3B، C)، فهي لينة وهشة. في تجربتنا، والحيوانات الاستوائية blastomeres هي أسهل بكثير لتشريح والثقافة من blastomeres نباتية (الشكل 3C). ربما لأنها أصغر حجما، أنها أسهل لنقل. يبدو أنها أيضا للشفاء بسرعة أكبر عندما رصدت مع ملقط. الخلايا النباتية في كثير من الأحيان يبدو لإكمال الانقسام السيتوبلازمي ببطء أكثر، وبالتالي الاحتفاظ الجسور مع خلايا حشوية الشقيقة، مما يجعلها أكثر "المتسرب" عندما تشريح، وغشاء الخلية من هو أكثر هشاشة وأسهل للضرر.بعد حوالي 1-2 ساعة في الثقافة، ستكون قد قسمت قسيم أرومي explanted (ق) عن 4 مرات وتنفصل معظم الحطام المتبقي من الخلايا التالفة المجاورة (الشكل 3D). بعد 20 ساعة، أنها تشكل صغيرة وكرات قوي من الخلايا (الشكل 3E). بينما قد يدفن في بعض الحطام، كثيرا ما يمكن العثور كتلة صحية (الشكل 3E، اليسار).
على الرغم من أن إإكسبلنتس صغيرة، وبقوا على قيد الحياة لمعالجة التهجين في الموقع وكذلك الغطاء الحيواني إإكسبلنتس أكثر شيوعا، الذي يسمح احد لمراقبة التعبير الجيني في وقت لاحق. في التجربة هو موضح في الشكل 4A، تم تشريح 2 blastomeres الظهرية (D1.1) أو اثنين blastomeres بطني (V1.1) في المرحلة 16-الخلية ومثقف في 1X MBS في 14 ° C حتى الأجنة الأخوة وصلت مراحل مبكرة وحة العصبية (st12-13؛ 20-22 ساعة بعد عن تشريح). ويعاير كل عينة للتعبير عن الجين وحة العصبية لاقحي (sox2 </ م>) عن طريق التهجين في الموقع (المنتج رد فعل الأزرق). هذا الاختبار يوضح أن غالبية الحيوانات blastomeres الظهرية، والتي هي السلائف من لوحة العصبية، ويمكن التعبير عن sox2 مستقلة، وهذا هو، دون إشارة إضافية من مناطق أخرى من الجنين. قد تكون تلك إإكسبلنتس لا تعبر sox2 حددت بشكل غير صحيح في وقت تشريح. في المقابل، فإن أيا من الحيوانات blastomeres بطني، والتي هي السلائف من البشرة البطنية، صريحة sox2. وبالتالي، فإننا نخلص إلى أن الظهرية قسيم أرومي الحيوانات لديها القدرة الذاتية على تشكيل الأنسجة العصبية، في حين أن الحيوان blastomeres بطني لا. علما أن بعض eIongated إإكسبلنتس D1.1 أيضا، وهو يدل على مورفولوجيا تشكيل الأديم المتوسط الظهرية، وهذه هي أيضا blastomeres الطالع لتشكيل القردود في الجنين سليما 3، وصريحة في الثقافة يزدرع علامة القردود بروتين 10. يمكن أن يكون مصير الجوهرية قسيم أرومي altere د بواسطة حقن مكروي مسبقة من mRNAs و(مكسب من بين وظيفة) أو مضاد للاحساس [أليغنوكليوتيد] morpholino (موس، وفقدان وظيفة من بين). في الشكل 4B، يتم اختبار تأثير تغيير مستويات الجين الذاتية للأمهات وأعرب العصبية، foxD5 16، 17،. وأعرب غالبية إإكسبلنتس V1.1 (مثقف لشارع 12-13) عندما تمت زيادة مستوى الذاتية للFoxD5 عن طريق حقن mRNAs وfoxD5 في blastomeres السلائف 8-خلية من خلايا V1.1 (الصف السفلي)، sox2. وفي المقابل، أعرب عدد قليل فقط D1.1 إإكسبلنتس (مثقف لشارع 12-13) عندما تم تخفيض مستوى الذاتية للFoxD5 عن طريق الحقن من المنظمات الأعضاء في blastomeres السلائف 8-خلية من D1.1 (الصف العلوي)، sox2 (مقارنة أعلى صف من الشكل 4A). هذه التجارب تشير إلى أن الأمهات من التعبير foxD5 يلعب دورا في القدرة الذاتية للblastomeres الظهرية للحصول على مصير العصبية.
ftp_upload/4458/4458fig1.jpg "بديل =" الشكل 1 "/>
الشكل 1. أنماط التصبغ في الخلية 2-الأجنة من البيض المخصب بشكل طبيعي. يشار إلى ثلم الانقسام الاولى لسهم. A) مثال على الجنين أنه لا ينبغي أن تستخدم لتحديد blastomeres في مراحل لاحقة ليرد المنطقة المصطبغة طفيفة في نصف الكرة الحيواني الجنين معظمها في خلية واحدة (على اليسار). منذ ثلم الانقسام 1 تتوقع الطائرة منتصف سهمي للجنين، فإن المنطقة المصطبغة طفيفة من هذا الجنين لم يحدد الظهرية. B) وهناك مثالان الأجنة يجب أن يتم فرز للثقافات يزدرع. في كل، هو شطر المنطقة المصطبغة طفيفة في نصف الكرة الحيواني (*) من قبل ثلم الانقسام الأول. الجنين على اليسار هو مرحلة مبكرة من دورة الخلية الأولى، ومنطقة مصطبغة قليلا إذ تظهر فقط في حوالي 25٪ من سطح الخلية. الجنين على اليمين يقترب من نهاية دورة الخلية الأولى، وانتقلت الصباغ لقدntrally ذلك نصفين الظهرية من الخلايا هما أخف وزنا. ونتيجة لذلك، في مراحل لاحقة وخلايا الحيوان فاتح اللون التنبؤ الظهرية (د) والخلايا الحيوانية والتنبؤ على نحو مظلم المصطبغة بطني (الخامس).
الشكل 2. أمثلة على الأجنة مرحلة الانقسام من البيض المخصب بشكل طبيعي. جميع الأجنة موجهة مع القطب الحيوانية التي تواجه القارئ، الظهرية إلى الأعلى. A) 4 خلايا الأجنة. دخلت الجنين على اليمين فقط دورة الخلية الثانية حتى الانقسام الأخاديد ضحلة. اكتمال الجنين على اليمين ما يقرب من دورة الخلية الثانية حتى الانقسام الأخاديد هي أعمق وأكثر تنوعا الخلايا تظهر. السهام السوداء إشارة إلى ثلم الانقسام أولا، والسهام الحمراء تشير إلى ثلم الانقسام الثاني. B) 8 خلايا الأجنة. الجنين على اليمين والوقت مبكر للدورة الخلية الثالثة والجنين على اليمين هو القريب نهاية دورة الخلية الثالثة. C) 16 خلية الأجنة. 'C مثال على الانقسامات غير النظامية التي ينبغي تجنبها. C "هو مثال على الانقسامات العادية على الجانب البطني، ولكن غير النظامية على الجانب الظهري. C'' 'هو مثال على الانقسامات أكثر انتظاما على الجانب الظهري، ولكن ليس على الجانب البطني.'''' C مثال من الانشقاقات منتظمة في خط الوسط، ولكن ليس أفقيا. D) 32 خلية الأجنة. 'D مثال على الانقسامات العادية على الجانب البطني، ولكن غير النظامية على الجانب الظهري.'' D مثال على الانقسامات العادية على ظهري الجانب، ولكن ليس على الجانب البطني. D'' 'هو مثال على الانقسامات العادية على الجانب الأيمن، ولكن الانشقاقات أقل انتظاما على الجانب الأيسر. E) 64 خلية الجنين. للحصول على تمثيل تخطيطي مرحلة من هذه المراحل، يرجى الرجوع إلى انطلاق سلسلة Nieuwkoop وفابر، التي يمكن العثور عليها على شبكة الإنترنت ( http://www.xenbase.org/anatomy/alldev.do ).
GE = "دائما"> 
الشكل 3. إإكسبلنتس من 16 خلية من الأجنة المخصبة البيض بشكل طبيعي. A) A قسيم أرومي الحيوان بطني بعد وقت قصير من تشريح. سهم يدل على بقايا الخلية "مقبض". B) A قسيم أرومي الحيوان بطني نقلها إلى بئر الثقافة التي تقسم مرة واحدة. C) A قسيم أرومي بطني نباتية بعد فترة وجيزة تشريح. مقارنة blastomeres الحيوانية، وهذه هي أكبر، وأكثر صعوبة للتلاعب. D) وتنقسم اثنين قسيم أرومي الحيوان بطني إإكسبلنتس، 2 ساعة بعد تشريح، حوالي أربع مرات. ينظر إلى اليسار يزدرع من سطح الأصلي، المصطبغة الخارجي للقسيم أرومي؛ ينظر إلى يزدرع الحق من سطح الأصلي، unpigmented الداخلية للقسيم أرومي. E) اثنين قسيم أرومي الحيوان بطني إإكسبلنتس مثقف لمدة 24 ساعة. ويزدرع اليسار يجلس على سرير من الحطام الخلوية (سهام) في حين أن الصحيح هو يزدرع خالية من أي مخلفات. جميع الصور هي في مانيفيكات 50Xأيون.
الشكل 4. في الموقع التهجين تحليل التعبير الجيني في إإكسبلنتس المستمدة من الخلايا blastomeres 16-تشريح من البيض المخصب بشكل طبيعي. A. الجنين 16-خلية على اليسار يوضح الزوج قسيم أرومي الظهرية (D1.1) الذي تم explanted للنتائج في الصف العلوي، والزوج قسيم أرومي بطني (V1.1) الذي تم explanted للنتائج في الصف السفلي. وضعت أزواج قسيم أرومي تشريح من أجنة uninjected في MBS 0.1X في الآبار الثقافة وحضنت في C ° 14 لمدة 20 ساعة. تم جمعها في أنابيب من تثبيتي، والتي تتم معالجتها بواسطة التهجين في الموقع للتعبير عن الجينات وهناك لاقحي العصبية، sox2. تم حقن Blastomeres B. الأجنة مرحلة 8-الخلية سواء على الصعيد الثنائيمع المنظمات الأعضاء foxD5، للحد من التعبير الذاتية في blastomeres الظهرية، أو مع foxD5 مرنا لزيادة التعبير الذاتية في blastomeres بطني. وعندما حقن الأجنة وصلت إلى مرحلة 16-الخلية (20-30 دقيقة في وقت لاحق)، تشريح أزواج قسيم أرومي، مثقف وتحليلها بواسطة التهجين في الموقع كما هو الحال في A. عدد إإكسبلنتس أن انخفاض كبير في التعبير عن sox2 D1.1 إإكسبلنتس أن حقنوا foxD5 المنظمات الأعضاء (مقارنة في الصف العلوي A). عدد إإكسبلنتس إحداث زيادة كبيرة في التعبير عن sox2 إإكسبلنتس V1.1 أن حقنوا foxD5 مرنا (مقارنة في الصف السفلي A). اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخطوات الأكثر أهمية بالنسبة لزراعة ناجحة لblastomeres الفردية هي: 1) تحديد بشكل صحيح قسيم أرومي المصالح؛ 2) الحفاظ على معقمة، والثقافة الصحية؛ 3) خلايا تشريح في الجزء الصحيح من دورة الخلية، و4) تطوير دليل الضرورية البراعة لمنع الضرر خلال تشريح ونقل إلى الثقافة أيضا.
للتلاعب blastomeres محددة، فمن الضروري أن تكون قادرة على تحديد محاور أساسية. في الأجنة القيطم، يمكن تحديد الجانب الظهري من ثلاث طرق: (1) بمناسبة دخول الحيوانات المنوية نقطة مع صبغة حيوية 18 و 19، (2) التحول المخصبة في المختبر البيض وبمناسبة جانب واحد 18 و 19، أو (3) اختيار الأجنة خلال مرحلة 2-الخلية في الانقسام الذي ثلم 1 يشطر المنطقة المصطبغة طفيفة في نصف الكرة الحيواني 20 و 21. نستخدم الأسلوب الثالث، الذي يحدد بدقة من blastomeres طبيعيا الاسمدةإد 16-الخلية الأجنة في حوالي 90٪ من الحالات 20 و 21. في الإخصاب، وتصبغ نصف الكرة الحيواني يبدأ العقد نحو نقطة دخول الحيوانات المنوية على الجانب البطني، مما تسبب في المنطقة الظهرية الحيوانية لتصبح أقل المصطبغة في معظم الأجنة (الشكل 1). هناك تفاوت كبير في مدى هذه المنطقة المصطبغة طفيفة في براثن ومخالب حتى داخل البيض القيطم. إذا ثلم الانقسام يشطر هذا أخف وزنا 1 المنطقة بالتساوي بين الخلايا الوليدة اثنين، ثم يمكن أن يتم استخدام مساحة أخف كما مؤشر على الجانب الظهري، وثلم الانقسام الأولى سوف تشير إلى الطائرة منتصف السهمي. إذا ثلم الانقسام يفصل بين بنات 1 في خلية واحدة مظلمة وخلية واحدة ضوء، انها لا تستخدم ليزدرع لأن تصبغ في مراحل لاحقة لن تعرف بدقة الجانب الظهري. وأظهرت دراسات سابقة أن في هذه الأنواع من الأجنة في ثلم الانقسام الأولى بقيت علامة لرانه منتصف المستوى السهمي في حين أن المنطقة لم تعد المصطبغة طفيفة وأشار الجانب الظهري 20 و 21. ويمكن أيضا أن يتم اختيار الأجنة في وقت مبكر من انشقاق 4-الخلية (الجنين اليسار في الشكل 2B)، عندما الأولى والثانية والأخاديد في القطب النباتية لا يزال حاليا، وثلم الأولى يجب أن تكون كاملة وليس ثلم 2 تكتمل بعد. ولكن إذا واحد ينتظر حتى نهاية المرحلة 4 خلايا الأجنة لاختيار (الحق في الجنين الشكل 2B)، والانقسام الأول والثاني الأخاديد لم يعد من الممكن تمييزها، والخلايا الصباغية طفيفة قد تكون تلك الظهرية إلا في حوالي 70٪ من الأجنة 20 و 21. وهذا يجعل استهداف blastomeres محددة أقل بكثير دقيقة. تجدر الإشارة إلى أن نسبة الأجنة التي ثلم الانقسام يشطر 1 المنطقة المصطبغة طفيفة يختلف كثيرا عبر براثن. في تجربتنا فإنها يمكن أن تشكل <٪ 50 من البيض في مخلب ل> 80٪ من البيض في مخلب. بغض النظر، هناك تقريبا دائما ما يكفي من البيض في غضون مخلب من البويضات السليمة التي تلبي هذا المعيار لدعم تجربة يزدرع.
وهما وسائل الإعلام الثقافة يوصى به (MMR، MBS) تقريبا قابلة للتبادل، وأفضليات مختلفة هي في معظمها مختبرات التاريخية. ويمكن تخزين MMR كحل 10X لمدة عام أو أكثر. MBS لديها أقصر الجرف الحياة لأن مخزنة مع بيكربونات. لأن الأجنة وإإكسبلنتس يمكن الاستسلام لعدوى بكتيرية دون هلام واقية والأغشية المحية، ينبغي ملقط وسائل الإعلام والثقافة أن تكون معقمة. إذا إإكسبلنتس لا البقاء على قيد الحياة بشكل جيد، يمكن إضافة المضادات الحيوية لثقافة المتوسط (على سبيل المثال، 0.1٪ جنتاميسين). وينبغي بذل الحلول التي تحتوي على جنتاميسين لها عمر تخزين قصير، وبالتالي الطازجة في اليوم هم لاستخدامه. الحطام الخلوية تحتوي على البروتياز التي من شأنها أن تلحق الضرر إإكسبلنتس دون وقاية، ويعزز نمو البكتيريا. ولذلك، ينبغي أن يكون ريموفيد من الآبار الثقافة بعد إإكسبلنتس لقد كانت لديه فرصة للشفاء.
يتم تنفيذ تشريح قسيم أرومي في ثقافة المتوسط المخفف (0.1X 0.1X MBS أو MMR) من أجل تخفيف قوة الخلية الى خلية التصاقات. خلال مراحل الانقسام القيطم، ويتم إنجاز معظمها التصاق الخلية cadherins calcium-/magnesium-dependent. ولذلك، فإنه ليس من الضروري استخدام التفكك الأنزيمية، في الواقع ينبغي تجنب ذلك لأنه يزيل البروتينات السطحية التي قد تكون مهمة في تحديد مصير الأحداث. لأن الخلايا الجنينية من دفعات مختلفة من البيض مع الالتزام القوى المختلفة، قد التخفيف من الوسط تشريح تحتاج إلى تعديل على أساس مخصص. إذا كانت الخلايا الملتصقة جدا لتشريح دون تمزق لهم، وانخفاض تركيز المتوسطة تشريح متدرج من 0.1X. وعلى العكس، إذا كانت الخلايا ينهار عندما تتم إزالة الغشاء المحي وهي راشح جدا، وزيادة تركيز dissectioن المتوسط متدرج. ومع ذلك، لا تستخدم وسائل الإعلام calcium-/magnesium-free لأن الخلايا تصبح هشة جدا لنقل إلى الآبار الثقافة. الفصل بنجاح blastomeres عندما يتوقف أيضا على خلال دورة الخلية احد يؤدي تشريح. كما هو مبين في الشكل 2، في وقت مبكر من دورة الخلية والانقسام الأخاديد ضحلة ودمر blastomeres. في وقت لاحق في دورة الانقسام الأخاديد هي أعمق وأكثر تنوعا الخلايا. في وقت مبكر من دورة الخلية، وهناك جسور حشوية من شأنها أن تسبب تسرب حشوية إذا ما تم كسره. لذلك، يتم تشريح الخلايا بسهولة أكبر في وقت متأخر من دورة الخلية. 4-الخلية الأجنة والأجنة 8-الخلية، وخلايا نباتية في جميع مراحل هي أصعب لتشريح لأن الجسور حشوية تستمر لفترة أطول. يمكن للمرء توقع ارتفاع معدل الوفيات لهذه إإكسبلنتس، وهذا يعني واحد يحتاج إلى أداء أكثر تشريح لاستعادة حجم العينة معقولة. يمكن للمرء أن ينتظر حتى بداية ثلم الانقسام المقبل لبدء dissection من هذه الخلايا للتأكد من أن الجسور وأغلقت حشوية. بينما blastomeres واحدة مأخوذة من 8 - 16-الخلية والأجنة البقاء على قيد الحياة بشكل جيد في الثقافة، في تجربتنا أقدم blastomeres سيعيشون أقل كذلك الخلايا واحدة. على الرغم من أننا لا نعرف سبب هذا، ويمكن تحسين بقاء إإكسبلنتس أقدم قسيم أرومي من تشريح عدة (2-6) من نفس قسيم أرومي مختلفة من الأجنة وزراعة بعضهم البعض في ثقافة واحدة 10 جيد و 13 و 14.
هذا الإجراء يتطلب ممارسة وبعض البراعة اليدوية. لأن الوقت بين الانشقاقات وتعتمد درجة الحرارة، وأنها مريحة لتخزين الأجنة في 14-16 درجة مئوية إلى إبطاء الانقسام وإتاحة مزيد من الوقت لإجراء تشريح. ومع ذلك، فإن الأجنة لا يحتمل درجات حرارة أقل من ° 14 C. التحدي الأول في هذا الإجراء يتم إزالة الغشاء المحي. فمن الأفضل عدم الانتقال إلى تشريح قسيم أرومي حتى يتم يتقن هذه الخطوة الأولى. عندما تشريحقسيم أرومي خارج، و "مؤشر" خلية من المرجح أن يتسرب وينهار. هذا ليس مصدر قلق لأن مقشر مرة كل الخلايا الأخرى بعيدا عن الخلية المطلوبة، يمكن إزالة "مقبض" خلية بالملقط. بقايا الخلايا مقبض وكذلك غيرها من الحطام عادة ما تقع بعيدا عندما يتم نقل قسيم أرومي لثقافة جيدا (الشكل 3B). Blastomeres عصا بشوق إلى البلاستيك، وذلك باستخدام ماصات زجاجية فقط لنقلهم. استخدام الحد الأدنى من الضغط على الخلية مص لأنها يمكن أن تتفكك من قوى القص في ماصة. أيضا، وتجنب فقاعات الهواء في ماصة والتأكد من غيض من ماصة هو تحت سطح ثقافة المتوسط عند طرد يزدرع لأن الخلايا سوف تنفجر اذا كانوا على اتصال واجهة الهواء والماء.
وصف بروتوكول يستخدم هنا الأجنة unmanipulated الجهات المانحة لإإكسبلنتس وسائل الإعلام الملح بسيطة لزراعة. هذه تسمح لأحد لاختبار القدرة الذاتية لليزدرع إلى EXPRوفاق سطيف مصير معين. ويمكن توسيع هذه الطريقة تجريبيا بطريقتين. أولا، يمكن أن تستكمل وسائل الإعلام الثقافة مع إشارات / عوامل النمو لاختبار ما إذا هذه الجزيئات يمكن أن يسبب يزدرع للتعبير عن مصائر البديلة. الثانية، يمكن تغيير التعبير الجيني للأجنة من خلال حقن المانحة إما mRNAs و(مكسب من بين وظيفة) أو مضاد للاحساس [أليغنوكليوتيد] morpholino (الخسارة من وظيفة) في السلائف محددة قبل تشريح قسيم أرومي. ويمكن أن يتم هذا في مرحلة 1-الخلية، أو بطريقة أكثر استهدافا في انقسامات الخلية 1-2 قبل تشريح. مع هذه النهج، يمكن للمرء اختبار ما إذا كان الجين خاصة خارجيا يؤدي إلى توفير قسيم أرومي في الحصول على مصير البديل، أو ما إذا كان جين معين الذاتية ضروري لقسيم أرومي للتعبير عن مصيره الذاتي (على سبيل المثال، الشكل 4B). هذه هي المناهج التجريبية القوية لأنها قضاء على نفوذ التباس من خلايا أخرى ويشير مnters الموجودة في الجنين سليمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أنوه هارلان GWU زمالة لدعم المنح وPaaqua لوثر رايس GWU زمالة لدعم هيرولد منى. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية منحة MCB-1121711.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-38 | Course (12 μm), for major repairs of forceps tips |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-46 | Medium (3 μm), for fine sharpening of forceps tips |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-54 | Fine (0.3 μm), for polishing of forceps tips |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | #11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. Corrosive resistant so they can be autoclaved. |
| Gentamicin solution | Sigma | G1397 | Add to medium on same day as use |
References
- Dale, L., Slack, J. M. Fate map of the 32-cell stage of Xenopus laevis. Development. 100, 279-295 (1987).
- Masho, R., Kubota, H. Y. Developmental fates of blastomeres of the eight-cell stage Xenopus embryo. Dev. Growth, Diff. 30, 347-359 (1988).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 119, 560-578 (1987).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 122, 300-319 (1987).
- Moody, S. A., Kline, M. J. Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres. Anat. Embryol. 182, 347-362 (1990).
- Takasaki, H. Fates and roles of the presumptive organizer region in the 32-cell embryos in normal development of Xenopus laevis. Dev. Growth, Diff. 29, 141-152 (1987).
- Sullivan, S. A., Moore, K. B., Moody, S. A. Chapter 20 Early events in frog blastomere fate determination. Cell Fate and Lineage Determination. Moody, S. A. , Academic Press. 297-321 (1999).
- Moore, K. B., Moody, S. A. Animal-vegetal asymmetries influence the earliest steps in retinal fate commitment in Xenopus. Dev. Biol. 212, 25-41 (1999).
- Yan, B., Moody, S. A. The competence of Xenopus blastomeres to produce neural and retinal progeny is repressed by two endo-mesoderm promoting pathways. Dev. Biol. 305, 103-119 (2007).
- Gallagher, B. C., Hainski, A. M., Moody, S. A. Autonomous differentiation of dorsal axial structures from an animal cap cleavage stage blastomere in Xenopus. Development. 112, 1103-1114 (1991).
- Hainski, A. M., Moody, S. A. Xenopus maternal mRNAs from a dorsal animal blastomere induce a secondary axis in host embryos. Development. 116, 347-3345 (1992).
- Godsave, S. F., Slack, J. M. Single cell analysis of mesoderm formation in the Xenopus embryo. Development. 111, 523-530 (1991).
- Hainski, A. M., Moody, S. A. An activin-like signal activates a dorsal-specifying RNA between the 8- and 16-cell stages of Xenopus. Dev. Genetics. 19, 210-221 (1996).
- Pandur, P. D., Moody, S. A. Multiple maternal influences on dorsal-ventral fate of Xenopus animal blastomeres. Dev. Dyn. 225, 581-587 (2002).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Sullivan, S. A., Akers, L., Moody, S. A. foxD5a, a Xenopus winged helix gene, maintains an immature neural ectoderm via transcriptional repression that is dependent upon the C-terminal domain. Dev. Biol. 232, 439-457 (2001).
- Yan, B., Neilson, K. M., Moody, S. A. FoxD5 plays a critical upstream role in regulating neural fate and onset of differentiation. Dev. Biol. 329, 80-95 (2009).
- Vincent, J. -P., Gerhart, J. C. Subcortical rotation in Xenopus eggs: an early step in embryonic axis specification. Dev. Biol. 123, 526-539 (1987).
- Peng, H. B. Appendix A: Solutions and Protocols. Methods in Cell Biology. 36, 657-662 (1991).
- Klein, S. L. The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos. Dev. Biol. 120, 299-304 (1987).
- Masho, R. Close correlation between the first cleavage plane and the body axis in early Xenopus embryos. Dev. Growth Diff. 32, 57-64 (1990).
