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Biology

ब्लास्टोमीयर explants सेल भाग्य प्रतिबद्धता के लिए भ्रूण विकास के दौरान टेस्ट

doi: 10.3791/4458 Published: January 26, 2013

Summary

एक व्यक्ति भ्रूण सेल के भाग्य विरासत में मिला अणुओं और / या पड़ोसी कोशिकाओं से संकेतों से प्रभावित किया जा सकता है. उपयोग दरार चरण Xenopus भ्रूण के भाग्य नक्शे, एकल blastomeres अलगाव में संस्कृति के लिए पहचाना जा सकता है सेल सेल बातचीत के बनाम विरासत अणुओं के योगदान का आकलन करें.

Abstract

किस्मत नक्शे, एक भ्रूण की कोशिकाओं के सभी वंश अनुरेखण से निर्माण से पता चलता है जो ऊतकों भ्रूण की प्रत्येक कोशिका से उतर. हालांकि भाग्य नक्शे के एक अंग के व्यापारियों की पहचान करने के लिए और विकास पथ जिसके द्वारा वंशज कोशिकाओं सामान्य भ्रूण में उस अंग आबाद elucidating के लिए बहुत उपयोगी हैं, वे एक अग्रदूत सेल के पूर्ण विकास क्षमता नहीं उदाहरण देकर स्पष्ट करना या तंत्र की पहचान है जिसके द्वारा अपने भाग्य निर्धारित किया जाता है. करने के लिए सेल भाग्य प्रतिबद्धता के लिए परीक्षण करने के लिए, एक अक्षुण्ण भ्रूण (भाग्य नक्शा) में एक प्रयोगात्मक हेरफेर के बाद व्यक्त की उन लोगों के साथ तुलना एक सेल वंश के सामान्य प्रदर्शनों की सूची. सेल भाग्य (प्रतिबद्ध) आसपास के सेलुलर पर्यावरण की परवाह किए बिना, तय है या यह अपने पड़ोसियों के द्वारा प्रदान की बाहरी कारकों से प्रभावित है? Xenopus भ्रूण के व्यापक भाग्य नक्शे का उपयोग करना, हम वर्णन कैसे पहचान करने के लिए, अलग और संस्कृति एक दरार चरण व्यापारियों, बहुतस से प्राणिविज्ञान संबंधी शब्दों में पहला पद जिसका अर्थ बीज, अंकुआ, अंकुर कली आदि होता है कहा जाता हैमेरेस. इस दृष्टिकोण का आकलन करने के लिए एक है कि क्या इन कोशिकाओं को जल्दी भाग्य वे बरकरार भ्रूण में अपने सामान्य वातावरण में प्राप्त करने के लिए, अपने पड़ोसी की कोशिकाओं के साथ बातचीत की आवश्यकता के लिए प्रतिबद्ध हैं, या वैकल्पिक भाग्य व्यक्त अगर संकेतों के अन्य प्रकार के लिए संपर्क करने के लिए प्रभावित किया जा सकता है की अनुमति देता है.

Introduction

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Xenopus laevis भ्रूण बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है के लिए तंत्र है जिसके द्वारा भ्रूण कोशिकाओं को अपनी विशिष्ट भाग्य प्राप्त क्योंकि उनके अंडे काफी बड़े microsurgical दृष्टिकोण की अनुमति की पहचान. इसके अलावा, वे मध्यम संस्कृति के पोषण अनुपूरण के लिए आवश्यकता के बिना बाहर विकसित क्योंकि प्रत्येक कोशिका जर्दी प्लेटलेट्स कि एक आंतरिक ऊर्जा की दुकान उपलब्ध कराने के एक अमीर intracellular आपूर्ति शामिल है. 1, 2, 3, 4, 5, 6 - तंत्र है जिसके द्वारा सेल भाग्य निर्धारित किया जाता है का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण परिसंपत्ति दरार चरण blastomeres के भाग्य नक्शे (2 से 32 सेल के चरणों के माध्यम से) के व्यापक सेट है. इन मानचित्रों एक एकल, पहचान ब्लास्टोमीयर में एक detectable अणु microinjecting और विकास में बाद में निगरानी है जो ऊतकों लेबल संतान से बसा रहे हैं द्वारा निर्माण किया गया. लगातार भाग्य नक्शे संभव हो रहे हैं, क्योंकि भ्रूण के कार्डिनल अक्षों मज़बूती से कई Embry में पहचाना जा सकता हैओएस. सबसे पहले, सभी जंगली प्रकार के भ्रूण में पशु गोलार्द्ध pigmented है, जबकि वनस्पति गोलार्द्ध नहीं है. दूसरा, शुक्राणु का निषेचन में प्रवेश भविष्य ventral पक्ष की ओर पशु गोलार्द्ध pigmentation के एक संकुचन का कारण बनता है, कई भ्रूण में pigmentation अंतर इसलिए पृष्ठीय और उदर पक्षों के बीच भेदभाव करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. तीसरा, पहली दरार कुंड approximates ज्यादातर भ्रूण में विमान मध्य बाण के समान है, और इस तरह के भ्रूण के दाएँ और बाएँ पक्ष की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. भाग्य नक्शे भी तथ्य यह है कि स्वाभाविक रूप से नियमित पैटर्न है कि प्रत्येक ब्लास्टोमीयर भ्रूण की एक बड़ी आबादी में पहचान बनाने में अंडे अक्सर फोड़ना निषेचित पर भरोसा करते हैं. जबकि वहाँ के भीतर और pigmentation और दरार पैटर्न के बारे में अंडे, चयन प्रक्रिया का उपयोग कर के चंगुल के बीच वर्णित परिवर्तनशीलता है यहाँ निर्धारित भाग्य के साथ कोशिकाओं के बारे में 90% सटीकता के साथ की पहचान करने की अनुमति देता है.

सेल भाग्य रोकते किया जा सकता हैकई तंत्र द्वारा embryogenesis दौरान खनन. Differentially विरासत cytoplasmic mRNAs या प्रोटीन के रूप में इस तरह के आंतरिक कारकों, जल्दी patterning के कई पहलुओं के लिए योगदान करते हैं. उदाहरण के लिए, विशिष्ट मातृ mRNAs निर्धारित जो कोशिकाओं रोगाणु लाइन के लिए योगदान, अन्तस्त्वक् बनने के होगा, या पृष्ठीय शरीर अक्ष (7 में समीक्षा) के लिए योगदान है. बाह्य कारकों पड़ोसी कोशिकाओं या एक भ्रूण संकेत केंद्र से अधिक दूर से स्थानीय स्तर पर प्रदान की, विशिष्ट प्रकार के ऊतक और patterning लगभग हर अंग प्रणाली उत्प्रेरण के लिए जिम्मेदार हैं. संकेत केन्द्रों के उदाहरण / गेसट्रुला है कि तंत्रिका बाहरी झिल्ली और mesoderm पैटर्न लाती में आयोजक नोड, और गतिविधि ध्रुवीकरण के क्षेत्र शामिल हैं है कि पैटर्न अंग कली की धुरी पूर्वकाल - पीछे. हालांकि भाग्य नक्शे विभिन्न अंगों के व्यापारियों की पहचान और विकास सामान्य भ्रूण में उनके वंश द्वारा उठाए गए पथ प्रकट, वे आंतरिक बीच भेद नहीं कर सकतेऔर उन कोशिकाओं पर बाह्य प्रभाव. उन्होंने यह भी एक सेल, जिसका वंश भ्रूण की जटिल संकेत वातावरण में अंतर का पूर्ण विकास क्षमता प्रकट नहीं करते. दो प्रयोगात्मक दृष्टिकोण परीक्षण है कि एक सेल भाग्य आंतरिक कारकों द्वारा निर्धारित किया जाता है या बाद में बाहरी कारकों से प्रभावित कर सकते हैं: 1) भ्रूण में एक उपन्यास स्थान पर सेल के प्रत्यारोपण, या 2) भ्रूण से सेल के हटाने में संस्कृति के द्वारा पीछा exogenous संकेतों के अभाव.

दोनों प्रयोगात्मक दृष्टिकोण Xenopus में संभव हो गया है क्योंकि कोशिकाओं काफी बड़े के लिए मैन्युअल रूप से अलग किया जा रहे हैं. उदाहरण के लिए, कई अध्ययनों मेजबान भ्रूण में उपन्यास स्थानों (सेल सेल बातचीत बदलने) भ्रूण या प्रतिरोपित कोशिकाओं से एकल कक्षों भाग्य (7 में परिवर्तन की समीक्षा, 8, 9) के लिए परीक्षण करने के लिए नष्ट कर दिया है. इसके अलावा भ्रूण के विभिन्न क्षेत्रों से कोशिकाओं के छोटे संख्या explanting के दूसरे दृष्टिकोण मैंNto exogenous कारकों के अभाव में आगमनात्मक ऊतक बातचीत स्पष्ट संस्कृति संभव है क्योंकि Xenopus भ्रूण की कोशिकाओं के एक intracellular पोषक तत्व की दुकान, जर्दी प्लेटलेट्स से भर रहे हैं. इसलिए, वे एक परिभाषित पोषण या मध्यम संस्कृति के विकास कारक अनुपूरण के बिना नमक मध्यम में कुछ दिनों के लिए संवर्धित किया जा सकता है. हम इस दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया है कि पृष्ठीय पशु blastomeres एक स्वायत्त तंत्रिका और पृष्ठीय mesodermal माता के रूप में विरासत में मिला mRNAs 10, 11 के कारण ऊतकों का उत्पादन करने की क्षमता है, और दूसरों से पता चला है 32 सेल blastomeres कि mesoderm विनिर्देश दोनों आंतरिक और बाह्य 12 जानकारी पर निर्भर करता है . Explants के रूप में संवर्धन कोशिकाओं का एक फायदा यह है कि मध्यम भी परिभाषित संकेत निर्धारित करने के लिए जो सेल करने वाली सेल संचार मार्ग explanted सेल 12, 13, 14 के भाग्य को प्रभावित हो सकता है कारकों के साथ पूरक किया जा सकता है. इसके अलावा, एक ब्लास्टोमीयर जनसंपर्क इंजेक्षन कर सकते हैंसंस्कृति को खत्म-the व्यक्त एक जीन, विरोधी भावना oligonucleotides के साथ या अंतर्जात mRNAs का अनुवाद को रोकने के लिए mRNA साथ आईओआर. ये, लाभ और हानि का समारोह विश्लेषण की पहचान कर सकते हैं जो अणुओं एक स्वायत्त व्यक्त भाग्य के लिए आवश्यक हैं. Explant के भाग्य का विश्लेषण करने के लिए विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं की पहचान मानक जीन अभिव्यक्ति (जैसे, स्वस्थानी संकरण में, RT-पीसीआर) और immunocytochemical assays के द्वारा किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल में एक सरल, अभी तक शक्तिशाली, आंतरिक और बाह्य तंत्र है कि विनियमित कैसे एक भ्रूण सेल विशिष्ट ऊतकों में विकसित के बीच अंतर करने के लिए रास्ता प्रदान करता है.

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Protocol

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1. उपकरण, संस्कृति, मीडिया और व्यंजन की तैयारी

  1. चार एल्यूमीना अपघर्षक फिल्म का उपयोग संदंश पैनापन. टिप आकार पर नजर रखने के लिए एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत यह मत करो. संदंश की एक जोड़ी के रूप में कार्य करता है एक बैक अप के मामले में एक टिप प्रक्रिया के दौरान क्षतिग्रस्त है. सभी चार संदंश आटोक्लेव और स्टोर एक बाँझ कंटेनर में.
  2. 500 मिलीलीटर 0.1X और 1.0x संस्कृति के माध्यम से प्रत्येक (या तो मार्क संशोधित Ringers [MMR] या संशोधित बार्थ खारा [एमबीएस], 15 में व्यंजनों) और फिल्टर बाँझ बनाना. हम नियमित एमबीएस (KCl, 1 मिमी, 0.7 मिमी 2 CACL, 1 मिमी MgSO 4, 5 मिमी HEPES [7.8 पीएच], 2.5 मिमी 3 NaHCO 1X = 88 मिमी NaCl) का उपयोग करें. महीनों के लिए 14-18 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
  3. संस्कृति मध्यम (2 ग्राम 100 मिलीग्राम 1X संस्कृति के माध्यम में एक पेंच टोपी कांच की बोतल में वैद्युतकणसंचलन ग्रेड agarose) में 2% agarose समाधान करें. आटोक्लेव agarose भंग. इस महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, और microwaved agarose दव्र जब यह अगले जरूरत है.
  4. जबकि agarose तरल है, एक बाँझ संस्कृति 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से नीचे पर 0.5 मि.ली. डालना. इस प्लास्टिक के लिए चिपके से explants रोकने जाएगा.
  5. जबकि agarose तरल है, दो तीन 60 मिमी पेट्री डिश के तल पर के बारे में 2-3 मिलीलीटर डालना, और ज़ुल्फ़ धीरे करने के लिए सुनिश्चित करें कि नीचे कवर किया जाता है. विच्छेदन व्यंजन के रूप में सेवा और agarose प्लास्टिक के लिए चिपके से भ्रूण को रोकता है एक बार उनके झिल्ली को हटा रहे हैं.
  6. जब agarose ठंडा है और कठोर लौ एक 6 "पाश्चर विंदुक टिप जब तक यह एक गेंद में पिघला देता है, और हल्के से यह संस्कृति की थाली में से प्रत्येक में अच्छी तरह से agarose की सतह पर स्पर्श यह एक उथले अवसाद पैदा करेगा जो में explant रखा जाएगा.
  7. 1X बाँझ संस्कृति के माध्यम से संस्कृति की थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से भरें.
  8. जब agarose ठंडा है और कठोर पतला संस्कृति मध्यम (एमएमआर 0.1X या 0.1X एमबीएस) ब्लास्टोमीयर जुदाई की सुविधा के साथ विच्छेदन थाली भर.

    2. भ्रूण का चयन

    1. प्राप्त निषेचित अंडे और मानक 15 प्रोटोकॉल के अनुसार हटा जेली कोट. उन्हें 0.5X एक 100 मिमी पेट्री डिश में संस्कृति के माध्यम से स्थानांतरण.
    2. जब भ्रूण 2-सेल चरण तक पहुँचते हैं, जो उन में पहली दरार कुंड एक अलग थाली में हल्के ढंग से पशु गोलार्द्ध में pigmented क्षेत्र (1 चित्रा) bisects तरह. Explants के लिए दानदाताओं होगा. एक अलग थाली में शेष 2 सेल भ्रूण प्रक्रिया के दौरान दाता भ्रूण भाई नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए explants मंच के बगल में रखें.

    3. Explants की तैयारी

    1. एक विच्छेदन पकवान में 5-10 भ्रूण जगह है, लेकिन एक बार में केवल एक भ्रूण पर काम.
    2. 1 भ्रूण स्थिति इतनी पारदर्शी पीतक झिल्ली देखा जा सकता है, यह भ्रूण के पशु ध्रुव की सतह के ऊपर एक स्पष्ट अंतरिक्ष (perivitelline अंतरिक्ष) से ​​अलग है. एक तेज बल का उपयोगएक उपबली स्वर हाथ (बाएं हाथ अगर एक सही हाथ है) में ps, perivitelline स्थान से ऊपर पीतक झिल्ली समझ. दूसरे हाथ में एक तेज संदंश का प्रयोग, 1 संदंश टिप करने के लिए करीब झिल्ली समझ, और धीरे से विपरीत दिशाओं में झिल्ली छील दूर खींच. कि सेल dissected, इतना है कि लक्ष्य कोशिका झिल्ली के हटाने के दौरान क्षतिग्रस्त नहीं है से एक दूरी पर प्रारंभिक समझ बनाओ. एक बता सकते हैं कि झिल्ली क्योंकि भ्रूण समतल करना होगा हटा दिया गया है.
    3. उपबली स्वर हाथ में संदंश के साथ एक पड़ोसी सेल पकड़ो और एक "संभाल" के रूप में इस सेल तो dissected किया जा सेल का उपयोग सीधे छुआ तक नहीं है. दूसरे हाथ में संदंश के साथ, धीरे शेष पड़ोसी कोशिकाओं दूर खींच वांछित ब्लास्टोमीयर से. यदि midline कोशिकाओं है, जो एक ही भाग्य का हिस्सा लक्षित कर रहे हैं, वे एक जोड़ी के रूप में एक साथ हटाया जा सकता है. अंत में, "संभाल" सेल काटना.
    4. एक बाँझ के साथ (या ब्लास्टोमीयर जोड़ी) ब्लास्टोमीयर, उठाओ, कांच पाश्चर पिपेट, हवाई बुलबुले और अत्यधिक चूषण से परहेज. विंदुक आग पॉलिश तेज किनारों है कि सेल को नुकसान पहुंचा सकता है को दूर करने के लिए हो सकता है लेकिन हम नियमित रूप से ऐसा नहीं करते हैं. पाश्चर विंदुक टिप explant संस्कृति पकवान की एक अच्छी तरह से संस्कृति के माध्यम की सतह के नीचे रखें, और धीरे ब्लास्टोमीयर को निष्कासित. यह उथले अवसाद में गंभीरता से स्लाइड चाहिए. एक से अधिक भ्रूण से ही ब्लास्टोमीयर एक एकल explant में जोड़ा जा सकता है.
    5. विच्छेदन पकवान, एक से एक में शेष भ्रूण के साथ इस प्रक्रिया को दोहराएँ. 10 भ्रूण के बारे में बाद में, विच्छेदन पकवान सेलुलर मलबे के साथ भरा जाएगा. जब ऐसा होता है, एक ताजा विच्छेदन पकवान बदल जाते हैं.
    6. बाद सभी dissections किया की जांच कर रहे हैं, चाहे explants उथले depressions में हैं. यदि नहीं, तो वे धीरे से एक बाल पाश है कि 70% इथेनॉल और हवा सूखे में निष्फल के साथ किया जा सकता है अवसाद में धकेल दिया.
    7. पिछले विच्छेदन के बाद एक घंटे के बारे में, मलबे surrou निकालेंएक बाँझ, कांच पाश्चर विंदुक के साथ चंगा explants nding.
    8. 14-20 explants की थाली संस्कृति ° C भाई, नियंत्रण भ्रूण युक्त पेट्री डिश के बगल में है. सहोदर भ्रूण ब्लास्टोमीयर explants के विकास के स्तर का संकेत होगा.

    4. विश्लेषण के लिए फसल काटने वाले explants

    1. Explants जल का संग्रहण जब भाई बहन वांछित विकास मंच तक पहुँचने. ये explants काफी अच्छी तरह से जीवित कोशिकाओं में से कुछ भी अगर बिखर. इसलिए, अगर वहाँ संस्कृति में एक बादल जन अच्छी तरह से है, यह एक बाल पाश या संदंश निर्धारित करने के लिए अगर एक स्वस्थ explant भीतर दफन है के साथ पता लगाने.
    2. एक गिलास पाश्चर विंदुक के साथ एक संस्कृति समाधान की छोटी मात्रा में explants उठाओ, और धीरे उन्हें एक लगानेवाला या lysis बफर में आयोजित किया परख के लिए उपयुक्त निष्कासित.

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Representative Results

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इस परख की क्षमता को सही सेल के विकास की क्षमता का आकलन सही नक्शे 1, 2, 3, 4, 5, 6 के भाग्य पर आधारित ब्लास्टोमीयर विदारक पर निर्भर करता है. इसलिए, यह महत्वपूर्ण है कि 2-सेल चरण में सही pigmentation पैटर्न के साथ भ्रूण का चयन करने के लिए, के रूप में चित्रा 1, कि बाद में नियमित रूप से दरार पैटर्न के अनुरूप है, के रूप में चित्रा 2 में सचित्र में सचित्र. यदि एक के रूप में वे आवश्यक दरार स्तर तक पहुँचने के लिए क्रमबद्ध भ्रूण के अनुसार और बाहर अनियमित चोली दिखा भ्रूण अलग है, सटीकता काफी सुधार हुआ है. 2 चित्रा में सचित्र, नियमित रूप से चोली अक्सर भ्रूण के एक पक्ष पर ही होते हैं. ये भ्रूण दाताओं के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है अगर दाता सेल "नियमित" की ओर से निकलती है. क्योंकि नियमित रूप से दरार पैटर्न कई भ्रूण के रूप में पांच बार के बारे में कम कोशिका विभाजन आय, प्रकार के रूप में भ्रूण में पाए जाते हैं के रूप में आप को काटना का इरादा है. स्वाभाविक रूप से चertilized अंडे इन विट्रो निषेचित अंडे की तुलना में अधिक नियमित रूप से चोली हो जाते हैं. हालांकि दरार पैटर्न अंडे की एक एकल क्लच के भीतर एक महान सौदा भिन्न, एक 10-20% कम से कम एक में गड़बड़ी की इस तरह के लिए उपयोगी हो उम्मीद कर सकते हैं.

Blastomeres अकेले या छोटे - छोटे समूहों में संवर्धित किया जा सकता है. जब blastomeres 1 (चित्रा 3A) विच्छेदित कर रहे हैं, और अच्छी तरह से संस्कृति (3B चित्रा, सी) के लिए स्थानांतरित कर, वे नरम और कमजोर हैं. हमारे अनुभव में, पशु और भूमध्यरेखीय blastomeres बहुत आसान को काटना संस्कृति और वनस्पति blastomeres (चित्रा 3C) की तुलना कर रहे हैं. शायद, क्योंकि वे छोटे होते हैं, वे आसानी से हस्तांतरण करने के लिए कर रहे हैं. उन्होंने यह भी करने के लिए और अधिक जल्दी से ठीक हो जब संदंश साथ nicked लगते हैं. वनस्पति कोशिकाओं को अक्सर कोशिका विभाजन में कोशिकाद्रव्य का दो भागों में अलग - अलग हो जाना और अधिक धीरे धीरे और इस प्रकार पूरा बहन कोशिकाओं के साथ cytoplasmic पुलों को बनाए रखने के लिए लगता है, उन्हें और अधिक "टपका हुआ" जब dissected, और अपने सेल झिल्ली अधिक नाजुक और क्षति के लिए आसान है.संस्कृति में के बारे में 1-2 घंटे के बाद, explanted ब्लास्टोमीयर (ओं) को 4 बार के बारे में विभाजित कर दिया है जाएगा और बंद क्षतिग्रस्त पड़ोसी कोशिकाओं (चित्रा 3 डी) से शेष मलबे के सबसे sloughed. 20 घंटा के बाद, वे कोशिकाओं के छोटे, मजबूत गेंदों (3E चित्रा) के रूप में. जबकि कुछ मलबे में दफन हो सकता है, अक्सर एक स्वस्थ जन (3E चित्रा, बाएं) पाया जा सकता है.

हालांकि explants छोटे हैं, वे के लिए स्वस्थानी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संकरण पशु और आमतौर पर इस्तेमाल किया टोपी explants, जो बाद में एक जीन की अभिव्यक्ति की निगरानी करने की अनुमति देता है में प्रसंस्करण के जीवित रहते हैं. 4A चित्र में दिखाया प्रयोग में, दो पृष्ठीय (D1.1) blastomeres या दो उदर blastomeres (V1.1) 16-सेल चरण में dissected किया गया है और 14 में 1X एमबीएस में सुसंस्कृत ° C तक भाई भ्रूण जल्दी तंत्रिका प्लेट चरणों तक पहुँच (ST12-13, विदारक के बाद 20-22 घंटे के बारे में). प्रत्येक नमूना एक युग्मज तंत्रिका प्लेट (जीन Sox2 की अभिव्यक्ति के लिए assayed </ Em>) द्वारा स्वस्थानी संकरण (नीले प्रतिक्रिया उत्पाद). इस परख कि पृष्ठीय पशु blastomeres, जो तंत्रिका प्लेट के व्यापारियों के बहुमत Sox2 autonomously भ्रूण के अन्य क्षेत्रों से अतिरिक्त संकेतन के बिना कर सकते हैं व्यक्त कि है, यह दर्शाता है. उन explants कि Sox2 व्यक्त नहीं कर गलत किया गया हो सकता है विच्छेदन के समय की पहचान की. इसके विपरीत, उदर पशु blastomeres, जो उदर epidermis, एक्सप्रेस Sox2 के व्यापारियों में से कोई भी. इस प्रकार, हम निष्कर्ष है कि की पृष्ठीय पशु ब्लास्टोमीयर एक आंतरिक तंत्रिका ऊतक के रूप में करने की क्षमता है, जबकि नहीं उदर पशु blastomeres. ध्यान दें कि D1.1 explants कुछ भी एक पृष्ठीय mesoderm गठन का संकेत आकारिकी eIongated है, इन blastomeres भी बरकरार 3 भ्रूण में पृष्ठदंड फार्म नसीब हैं, और explant संस्कृति एक्सप्रेस में एक पृष्ठदंड मार्कर 10 प्रोटीन. ब्लास्टोमीयर आंतरिक भाग्य altere हो सकता है mRNAs की पूर्व microinjection (लाभ के समारोह) या विरोधी भावना morpholino oligonucleotides (नुकसान का समारोह राज्यमंत्री) द्वारा घ. 4B चित्रा में एक माता व्यक्त तंत्रिका जीन, foxD5 16, 17, की अंतर्जात स्तर में फेरबदल के प्रभाव का परीक्षण किया है. जब FoxD5 की अंतर्जात स्तर 8-सेल V1.1 (नीचे पंक्ति) के अग्रदूत blastomeres में foxD5 mRNAs इंजेक्शन की वृद्धि हुई थी, V1.1 explants (12-13 सेंट संवर्धित) के बहुमत Sox2 व्यक्त. इसके विपरीत, जब FoxD5 की अंतर्जात स्तर राज्यमंत्री के इंजेक्शन द्वारा 8-सेल D1.1 (शीर्ष पंक्ति) के अग्रदूत blastomeres में कम हो गया था, केवल कुछ एक D1.1 explants (12-13 सेंट संवर्धित) Sox2 (तुलना करने के लिए व्यक्त की 4A चित्रा की शीर्ष पंक्ति). इन प्रयोगों से संकेत मिलता है कि foxD5 की मातृ अभिव्यक्ति पृष्ठीय blastomeres की आंतरिक क्षमता एक तंत्रिका भाग्य प्राप्त करने में एक भूमिका निभाता है.

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चित्रा 1 2 स्वाभाविक रूप से निषेचित अंडे से सेल भ्रूण में Pigmentation पैटर्न. पहली दरार कुंड एक तीर से संकेत दिया है. ए) एक भ्रूण है कि बाद के चरणों में blastomeres की पहचान नहीं किया क्योंकि भ्रूण के पशु गोलार्द्ध के हल्के pigmented क्षेत्र ज्यादातर एक सेल (बाईं ओर) में निहित है की एक उदाहरण. के बाद से पहली दरार कुंड भ्रूण के मध्य बाण के समान विमान भविष्यवाणी, इस भ्रूण के हल्के pigmented क्षेत्र में पृष्ठीय नहीं पहचान करेगा. बी) भ्रूण के दो उदाहरण है कि explant संस्कृतियों के लिए हल किया जाना चाहिए. दोनों में, पशु गोलार्द्ध (*) के हल्के pigmented क्षेत्र के पहली दरार कुंड द्वारा bisected है. बाईं तरफ भ्रूण 1 सेल चक्र में जल्दी है, और हल्के pigmented क्षेत्र कोशिका की सतह के बारे में 25% में ही दिखाई देता है. सही पर भ्रूण पहले कोशिका चक्र के अंत में होने जा रही है, और वर्णक ve ले जाया गया हैntrally दो कोशिकाओं के पृष्ठीय halves हल्का कर रहे हैं. एक परिणाम के रूप में, बाद के चरणों में हल्के pigmented पशु कोशिकाओं पृष्ठीय (घ) की भविष्यवाणी और अंधेरे में pigmented पशु कोशिकाओं उदर की भविष्यवाणी (v).

चित्रा 2
चित्रा 2 दरार चरण भ्रूण के स्वाभाविक रूप से निषेचित अंडे से उदाहरण हैं. सभी भ्रूण जानवर पाठक, शीर्ष पर पृष्ठीय का सामना करना पड़ ध्रुव के साथ उन्मुख होते हैं. ए) भ्रूण 4 सेल. बाईं तरफ भ्रूण सिर्फ दूसरा सेल चक्र में प्रवेश किया है तो दरार furrows उथले हैं. सही पर भ्रूण लगभग 2 कोशिका चक्र पूरा कर लिया है, तो दरार गहरी furrows हैं और कोशिकाओं को अधिक गोल दिखाई देते हैं. काले तीर पहली दरार कुंड की बात है, और लाल तीर 2 दरार कुंड इंगित. बी) 8 सेल भ्रूण. बाईं तरफ भ्रूण जल्दी 3 कोशिका चक्र है और सही पर भ्रूण के पास है3 कोशिका चक्र के अंत. सी) भ्रूण 16-सेल. सी 'अनियमित को टाला जा सकता चोली का एक उदाहरण है. सी "उदर पक्ष पर नियमित रूप से चोली का एक उदाहरण है, लेकिन पृष्ठीय पक्ष पर अनियमित सी'' पृष्ठीय पक्ष पर अधिक नियमित चोली का एक उदाहरण है, लेकिन नहीं उदर पक्ष पर. सी'''' एक उदाहरण है midline में नियमित रूप से चोली की, लेकिन laterally नहीं डी) 32 सेल भ्रूण डी 'ventral पक्ष पर नियमित रूप से चोली का एक उदाहरण है, लेकिन पृष्ठीय पक्ष पर अनियमित डी'' पृष्ठीय पर नियमित रूप से चोली का एक उदाहरण है की तरफ हो रहा है, लेकिन नहीं उदर पक्ष पर डी.'' सही पक्ष पर नियमित रूप से चोली का एक उदाहरण है, लेकिन बाईं ओर अधिक अनियमित चोली ई) 64-सेल भ्रूण इन चरणों के एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व के लिए, कृपया देखें Nieuwkoop एंड फैबर मचान श्रृंखला है, जो (लाइन पर पाया जा सकता है http://www.xenbase.org/anatomy/alldev.do ).


स्वाभाविक रूप से निषेचित अंडे से 16 सेल भ्रूण से चित्रा 3. Explants. ए) विच्छेदन के बाद शीघ्र ही एक उदर पशु ब्लास्टोमीयर. एरो "संभाल" सेल के अवशेष अर्थ. बी) एक उदर का पशु ब्लास्टोमीयर एक संस्कृति अच्छी तरह से विभाजित किया गया है कि एक बार के लिए स्थानांतरित कर दिया. सी) विच्छेदन के बाद शीघ्र ही एक उदर वनस्पति ब्लास्टोमीयर. पशु blastomeres की तुलना में, इन बड़ा है, और अधिक कठिन हेरफेर करने के लिए कर रहे हैं. डी) दो उदर पशु ब्लास्टोमीयर explants, विच्छेदन के बाद 2 घंटा, चार बार के बारे में विभाजित है. बाएं explant मूल, ब्लास्टोमीयर की pigmented बाहरी सतह से देखा जाता है, सही explant मूल, ब्लास्टोमीयर की unpigmented भीतरी सतह से देखा जाता है. ई) दो उदर पशु ब्लास्टोमीयर explants के 24 घंटे के लिए सभ्य. बाएं explant सेलुलर मलबे (तीर) के एक बिस्तर में बैठी है, जबकि सही explant किसी भी कतरे से मुक्त है. सभी छवियों 50X magnificat में हैंआयन.

चित्रा 4
स्वाभाविक रूप से निषेचित अंडे से 16 सेल dissected blastomeres से प्राप्त explants जीन की अभिव्यक्ति में स्वस्थानी संकरण विश्लेषण में 4 चित्रा. ए बाईं तरफ 16 सेल भ्रूण पृष्ठीय ब्लास्टोमीयर (D1.1) जोड़ी है कि परिणाम के लिए में explanted दिखाता है शीर्ष पंक्ति, और उदर ब्लास्टोमीयर (V1.1) जोड़ी है कि नीचे पंक्ति में परिणाम के लिए explanted किया गया था. Dissected uninjected भ्रूण से ब्लास्टोमीयर जोड़े संस्कृति कुओं में 0.1X एमबीएस में रखा गया था और के बारे में 20 घंटे के लिए 14 डिग्री सेल्सियस में incubated. वे लगानेवाला की ट्यूब में एकत्र किए गए थे और एक युग्मज तंत्रिका जीन, Sox2 की अभिव्यक्ति के लिए स्वस्थानी संकरण द्वारा संसाधित आठ कोशिका चरण भ्रूण के बी blastomeres द्विपक्षीय स्तर पर या तो इंजेक्शन थे.foxD5 राज्यमंत्री, पृष्ठीय blastomeres में या foxD5 mRNA के साथ अंतर्जात अभिव्यक्ति को कम करने के लिए उदर blastomeres अंतर्जात अभिव्यक्ति में वृद्धि के साथ. जब इंजेक्शन भ्रूण चरण 16-सेल (20-30 मिनट के बाद) पर पहुंच गया, ब्लास्टोमीयर जोड़े dissected थे, सुसंस्कृत और विश्लेषण से एक के रूप में स्वस्थानी संकरण में. explants की संख्या कि एक्सप्रेस Sox2 D1.1 explants कि foxD5 राज्यमंत्री (ए में शीर्ष पंक्ति तुलना) इंजेक्शन के साथ थे में काफी कम हो जाता है. explants की संख्या है कि एक्सप्रेस Sox2 V1.1 explants कि foxD5 mRNA (एक में नीचे पंक्ति तुलना करने के लिए) के साथ थे इंजेक्शन में काफी वृद्धि हुई है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

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व्यक्तिगत blastomeres के सफल संवर्धन के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) सही ढंग से ब्याज की ब्लास्टोमीयर की पहचान, 2) एक बाँझ, स्वस्थ संस्कृति को बनाए रखने, 3) कोशिका चक्र के सही भाग में विदारक कोशिकाओं, और 4) आवश्यक पुस्तिका विकसित विच्छेदन के दौरान नुकसान को रोकने और संस्कृति के लिए अच्छी तरह से हस्तांतरण निपुणता.

विशिष्ट blastomeres में हेरफेर करने के लिए, यह आवश्यक है के के लिए कार्डिनल अक्षों की पहचान करने में सक्षम हो. Xenopus भ्रूण पृष्ठीय पक्ष तीन विधियों द्वारा पहचाना जा सकता है: (1) एक महत्वपूर्ण 18 डाई, 19 के साथ शुक्राणु प्रवेश बिंदु अंकन, (2) इन विट्रो tipping अंडे निषेचित और एक ओर 18, 19 अंकन, या (3) चरण 2 सेल में जो पहली दरार कुंड पशु गोलार्द्ध 20, 21 में हल्के pigmented क्षेत्र bisects दौरान भ्रूण का चयन. हम 3 विधि है, जो सही स्वाभाविक रूप से fertiliz से blastomeres की पहचान का उपयोगएड 20, 21 मामलों के बारे में 90% में 16 सेल भ्रूण. निषेचन में, पशु गोलार्द्ध pigmentation ventral पक्ष पर शुक्राणु प्रवेश बिंदु की ओर अनुबंध करने के लिए शुरू होता है, पृष्ठीय पशु भ्रूण की एक बहुमत (1 चित्रा) में कम pigmented क्षेत्र बनने के लिए कारण. चंगुल भर में और भी Xenopus अंडे के चंगुल में इस हल्के pigmented क्षेत्र की हद तक में काफी भिन्नता है. अगर पहली दरार कुंड दो बेटी कोशिकाओं के बीच समान रूप से इस हल्का क्षेत्र bisects है, तो है कि हल्का क्षेत्र पृष्ठीय पक्ष के सूचक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, और पहली दरार कुंड मध्य - बाण के समान विमान का संकेत होगा. अगर पहली दरार कुंड एक अंधेरी कोठरी और एक प्रकाश सेल में बेटियों अलग, यह explant के लिए का उपयोग नहीं है क्योंकि बाद के चरणों में pigmentation सही पृष्ठीय पक्ष की पहचान नहीं होगा. पिछले अध्ययनों से पता चला है कि भ्रूण के इन प्रकार में पहली दरार कुंड टी के लिए एक मार्कर रहावह हल्के pigmented क्षेत्र जबकि मध्य बाण के समान विमान अब पृष्ठीय पक्ष 20, 21 का संकेत है. है भ्रूण 4-सेल (चित्रा 2B बाईं भ्रूण) दरार, के शुरुआती हिस्से में भी चुना जा सकता है जब पहले और दूसरे वनस्पति ध्रुव पर furrows अभी भी प्रतिष्ठित हो सकता है, पहला कुंड पूरा किया जाना चाहिए और दूसरा कुंड नहीं अभी तक पूरा करें. अगर, हालांकि, एक 4 सेल भ्रूण (चित्रा 2B में सही भ्रूण) का चयन चरण के अंत तक इंतजार कर रहा है, पहली और दूसरी दरार अब प्रतिष्ठित किया जा सकता है furrows, और हल्के pigmented कोशिकाओं पृष्ठीय लोगों को केवल के बारे में हो सकता है भ्रूण 20, 21 के 70%. यह विशिष्ट blastomeres बहुत कम सटीक लक्ष्य प्रस्तुत करना होगा. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि भ्रूण का प्रतिशत जो में पहली दरार कुंड हल्के pigmented क्षेत्र bisects चंगुल भर में एक महान सौदा बदलता. हमारे अनुभव में वे के लिए 80 <अंडे के 50% के लिए एक क्लच> खाते में कर सकते हैंएक क्लच में अंडे का%. बावजूद, वहाँ लगभग हमेशा स्वस्थ अंडे कि इस कसौटी को पूरा करने के लिए एक explant प्रयोग का समर्थन की एक क्लच के भीतर पर्याप्त अंडे हैं.

दो की सिफारिश की संस्कृति मीडिया (एमएमआर, एमबीएस) वस्तुतः परस्पर विनिमय कर रहे हैं, विभिन्न प्रयोगशालाओं की वरीयताओं ज्यादातर ऐतिहासिक हैं. एमएमआर एक साल या उससे अधिक के लिए एक 10X समाधान के रूप में संग्रहित किया जा सकता है. एमबीएस एक छोटी शैल्फ जीवन है है क्योंकि यह बिकारबोनिट साथ buffered है. क्योंकि भ्रूण और explants सुरक्षात्मक जेली और पीतक झिल्ली बिना जीवाणु संक्रमण के शिकार कर सकते हैं, संदंश और संस्कृति मीडिया बाँझ होना चाहिए. यदि explants अच्छी तरह से जीवित नहीं है, एंटीबायोटिक (उदाहरण के लिए, 0.1% gentamicin) संस्कृति के माध्यम से जोड़ा जा सकता है. Gentamicin युक्त एक छोटी भंडारण जीवन है, और इस तरह दिन वे करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहे हैं पर ताजा समाधान किया जाना चाहिए. सेलुलर मलबे proteases कि असुरक्षित explants नुकसान होगा, और बैक्टीरियल वृद्धि को बढ़ावा देता है. इसलिए, यह रेमो होना चाहिएसंस्कृति कुओं से वेद के बाद explants चंगा करने के लिए एक मौका मिला है.

ब्लास्टोमीयर dissections पतला संस्कृति मध्यम (0.1X एमबीएस या 0.1X एमएमआर) में प्रदर्शन कर रहे हैं क्रम में सेल करने वाली सेल adhesions की ताकत को कम करने के लिए कर रहे हैं. Xenopus दरार चरण के दौरान, कोशिका आसंजन अधिकतर calcium-/magnesium-dependent cadherins द्वारा पूरा किया है. इसलिए, यह enzymatic पृथक्करण का उपयोग करने के लिए आवश्यक नहीं है, वास्तव में यह है क्योंकि यह सतह प्रोटीन है कि भाग्य निर्धारण घटनाओं में महत्वपूर्ण हो सकती है हटा बचा जाना चाहिए. क्योंकि अंडे के विभिन्न समूहों से भ्रूण कोशिकाओं अलग ताकत के साथ पालन करने, विच्छेदन माध्यम के कमजोर पड़ने के लिए एक तदर्थ आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है. यदि कोशिकाओं को भी उन्हें फाड़ के बिना काटना पक्षपाती हैं, 0.1X से विच्छेदन stepwise मध्यम की एकाग्रता कम है. इसके विपरीत, यदि कोशिकाओं अलावा जब पीतक झिल्ली निकाल दिया जाता है और बहुत टपकाया हैं, dissectio की एकाग्रता में वृद्धिn stepwise मध्यम. हालांकि, calcium-/magnesium-free मीडिया का उपयोग नहीं है क्योंकि कोशिकाओं को भी संस्कृति कुओं हस्तांतरण कमजोर हो. Blastomeres के सफल जुदाई पर भी निर्भर करता है जब सेल चक्र के दौरान एक विच्छेदन प्रदर्शन. चित्रा 2 में दिखाया गया है, जल्दी सेल चक्र में दरार furrows उथले हैं और blastomeres चपटा कर रहे हैं. बाद में चक्र में दरार furrows गहरा रहे हैं और कोशिकाओं को और अधिक गोल कर रहे हैं. कोशिका चक्र के प्रारंभिक दिनों में, वहाँ cytoplasmic पुलों कि cytoplasmic रिसाव के कारण अगर टूट जाएगा. इसलिए, कोशिकाओं को और अधिक आसानी से सेल चक्र में देर dissected हैं. 4 सेल भ्रूण, 8 सेल भ्रूण, सभी स्तरों पर और वनस्पति कोशिकाओं को काटना कठिन है क्योंकि cytoplasmic पुलों लंबे समय तक जारी रहती हैं. एक इन explants के लिए एक उच्च मृत्यु दर की आशा है, जिसका अर्थ है एक की जरूरत करने के लिए और अधिक करने के लिए एक उचित नमूना आकार ठीक dissections प्रदर्शन कर सकते हैं. एक अगले दरार कुंड की शुरुआत तक प्रतीक्षा करने के लिए disse शुरू कर सकते हैंइन कोशिकाओं के ction करने के लिए सुनिश्चित करें कि cytoplasmic पुलों को बंद कर दिया है. जबकि एकल blastomeres 8 से लिया और 16 सेल भ्रूण संस्कृति में अच्छी तरह से हमारे अनुभव में, बच पुराने blastomeres कम एकल कक्षों के रूप में अच्छी तरह से किराया. हालांकि हम इस बात का कारण पता नहीं, पुराने ब्लास्टोमीयर explants के अस्तित्व अलग भ्रूण और उन्हें संवर्धन से एक ही ब्लास्टोमीयर के कई (2-6) एक एकल संस्कृति अच्छी तरह से 10, 13, 14 में एक साथ विदारक द्वारा सुधार किया जा सकता है.

इस प्रक्रिया में अभ्यास की आवश्यकता है और कुछ मैनुअल निपुणता. क्योंकि चोली के बीच के समय तापमान निर्भर है, यह करने के लिए 14-16 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण की दुकान करने के लिए नीचे दरार धीमी और dissections प्रदर्शन करने के लिए और अधिक समय की अनुमति के लिए सुविधाजनक है. हालांकि, भ्रूण का तापमान 14 डिग्री सेल्सियस से कम बर्दाश्त नहीं करेंगे इस प्रक्रिया में पहली चुनौती पीतक झिल्ली को हटा रहा है. यह सबसे अच्छा तरीका ब्लास्टोमीयर विच्छेदन पर कदम नहीं है जब तक इस दिशा में पहला कदम में महारत हासिल है. जब विदारकब्लास्टोमीयर बाहर, "संभाल" सेल रिसाव और अलग गिरावट की संभावना है. यह एक चिंता का विषय नहीं है क्योंकि एक बार अन्य सभी कोशिकाओं इच्छित सेल से दूर खुली हैं, "संभाल" सेल संदंश से हटाया जा सकता है. संभाल सेल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अन्य मलबे अवशेष आमतौर पर दूर गिर जब ब्लास्टोमीयर संस्कृति को सौंप दिया है अच्छी तरह से (3B चित्रा). Blastomeres प्लास्टिक को avidly चिपके रहते हैं, तो केवल कांच pipettes का उपयोग करने के लिए उन्हें स्थानांतरित करने के लिए. सेल पर कम से कम चूसने दबाव का प्रयोग है क्योंकि यह विंदुक में कतरनी बलों से बिखर कर सकते हैं. इसके अलावा, विंदुक में हवाई बुलबुले से बचने के लिए और सुनिश्चित करें कि विंदुक टिप मध्यम संस्कृति की सतह के नीचे है, जब explant क्योंकि कोशिकाओं विस्फोट हो जाएगा अगर वे एक अंतरफलक हवा - पानी को छूने के लिए निष्कासित कर दिया है.

प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित explants और संवर्धन के लिए साधारण नमक मीडिया के लिए दानदाताओं रूप में unmanipulated भ्रूण का उपयोग करता है. ये एक expr explant की आंतरिक क्षमता का परीक्षण करने के लिए अनुमति देते हैंईएसएस विशेष भाग्य. इस विधि प्रयोगात्मक दो मायनों में विस्तारित किया जा सकता है. सबसे पहले, संस्कृति मीडिया संकेतन / वृद्धि कारकों के साथ पूरक हो सकता है परीक्षण करने के लिए है कि क्या इन अणुओं explant वैकल्पिक भाग्य को व्यक्त करने के लिए पैदा कर सकता है. दूसरा, दाता भ्रूण के जीन की अभिव्यक्ति विशिष्ट व्यापारियों में या तो (लाभ के समारोह) mRNAs या विरोधी भावना morpholino oligonucleotides (नुकसान का समारोह) ब्लास्टोमीयर विच्छेदन से पहले इंजेक्शन द्वारा बदला जा सकता है. यह मंच एक सेल में, या 1-2 कोशिका विभाजन में एक अधिक लक्षित विच्छेदन के पहले तरीके में किया जा सकता है. इन तरीकों के साथ, एक परीक्षण कर सकते हैं कि एक विशेष exogenously जीन की आपूर्ति करने के लिए एक वैकल्पिक भाग्य हासिल ब्लास्टोमीयर का कारण बनता है, या एक विशेष अंतर्जात जीन अपनी स्वायत्त भाग्य व्यक्त (जैसे, 4B चित्रा) ब्लास्टोमीयर के लिए आवश्यक है कि क्या है. इन शक्तिशाली प्रयोगात्मक दृष्टिकोण हैं क्योंकि वे अन्य कोशिकाओं की confounding प्रभाव को खत्म करने और CE संकेतnters बरकरार भ्रूण में मौजूद है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

लेखकों के लिए GWU Harlan फैलोशिप Paaqua अनुदान और GWU लूथर चावल फैलोशिप की मोना Herold के समर्थन के लिए समर्थन के लिए स्वीकार करना चाहते हैं. यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान MCB-1121711 द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alumina abrasive film Thomas Scientific #6775E-38 Course (12 μm), for major repairs of forceps tips
Alumina abrasive film Thomas Scientific #6775E-46 Medium (3 μm), for fine sharpening of forceps tips
Alumina abrasive film Thomas Scientific #6775E-54 Fine (0.3 μm), for polishing of forceps tips
Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 Fine Science Tools #11252-30 These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. Corrosive resistant so they can be autoclaved.
Gentamicin solution Sigma G1397 Add to medium on same day as use

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References

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ब्लास्टोमीयर explants सेल भाग्य प्रतिबद्धता के लिए भ्रूण विकास के दौरान टेस्ट
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Grant, P. A., Herold, M. B., Moody, S. A. Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development. J. Vis. Exp. (71), e4458, doi:10.3791/4458 (2013).More

Grant, P. A., Herold, M. B., Moody, S. A. Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development. J. Vis. Exp. (71), e4458, doi:10.3791/4458 (2013).

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