Summary
O destino de uma célula individual embrionário pode ser influenciado por moléculas hereditárias e / ou por sinais de células vizinhas. Utilizando mapas destino da clivagem embrionária fase Xenopus, blastômeros individuais podem ser identificados para a cultura de isolamento para avaliar as contribuições de moléculas herdados contra interações célula-célula.
Abstract
Mapas de destino, construídos a partir da linhagem de rastreamento de todas as células de um embrião, revelam que os tecidos descendem de cada célula do embrião. Embora os mapas destino são muito úteis para a identificação de precursores de um órgão e para elucidar o caminho de desenvolvimento pelo qual as células descendentes povoar o órgão do embrião normal, não ilustram o potencial de desenvolvimento de uma célula precursora ou identificar os mecanismos pelos quais seu destino é determinado. Para testar compromisso destino da célula, se compara repertório normal de uma célula de descendentes no embrião intacto (o mapa destino) com os indicados depois de uma manipulação experimental. É o destino da célula fixo (comprometido), independentemente do meio ambiente celular, ou é influenciada por fatores externos prestados por seus vizinhos? Usando os mapas destino abrangentes do embrião de Xenopus, descrevemos como identificar, isolar e cultura precursores de estágio único de clivagem, chamado Blastomeres. Esta abordagem permite avaliar se estas células iniciais estão comprometidos com o destino que elas adquirem no seu meio ambiente normal em que o embrião intacto, requerem interacções com as suas células vizinhas, ou pode ser influenciada para expressar destinos alternativos, se forem expostos a outros tipos de sinais.
Introduction
Embriões de Xenopus laevis foram utilizados extensivamente para identificar os mecanismos pelos quais as células embrionárias adquirem os seus destinos específicos, porque os ovos são suficientemente grandes para permitir que as abordagens de microcirurgia. Além disso, desenvolvem-se externamente, sem a necessidade de suplementação nutricional do meio de cultura uma vez que cada célula contém uma fonte rica intracelular de plaquetas gema que proporcionam um armazenamento de energia intrínseca. Um trunfo importante para o estudo dos mecanismos pelos quais o destino da célula é determinado é o conjunto completo de mapas destino dos blastômeros estágio de clivagem (de 2 a 32 - de células-estágios) 1, 2, 3, 4, 5, 6. Estes mapas foram construídos por microinjecting uma molécula detectável em um blastômero, único de identificação e monitoramento mais tarde no desenvolvimento que os tecidos são preenchidos pela descendência rotulados. Mapas destino consistentes são possíveis porque os eixos fundamentais de os embriões podem ser identificados de forma confiável em muitos embryOS. Em primeiro lugar, em todos os embriões de tipo selvagem para o hemisfério animal é pigmentada, enquanto que o hemisfério vegetal não é. Em segundo lugar, a entrada do esperma no momento da fertilização provoca uma contracção da pigmentação hemisfério animal para o lado ventral futuro, em muitos embriões diferença pigmentação, portanto, pode ser utilizado para discriminar entre os lados dorsal e ventral. Em terceiro lugar, o sulco de clivagem primeiro se aproxima do plano sagital mediano na maioria dos embriões, e portanto, pode ser usado para identificar os lados direito e esquerdo do embrião. Os mapas destino também confiar no fato de que, naturalmente, ovos fertilizados freqüentemente apegar em padrões regulares que fazem cada blastômero identificável através de uma grande população de embriões. Enquanto existe variabilidade dentro e entre garras de ovos quanto aos padrões de pigmentação e clivagem, utilizando procedimentos de selecção descrito aqui permite que as células com destino prescritos para ser identificado com cerca de 90% de precisão.
Destinos celulares podem ser determinadas durante a embriogênese através de vários mecanismos. Fatores intrínsecos, como diferencialmente herdados mRNAs citoplasmáticos ou proteínas, contribuem para vários aspectos de padronização cedo. Por exemplo, os mRNAs específicos maternos determinar quais as células que contribuem para a linha germinal, tornar-se a endoderme, ou contribuir para o eixo do corpo dorsal (revisto em 7). Factores extrínsecos fornecidos localmente por células vizinhas ou mais distante do centro de uma sinalização embrionária, são responsáveis pela indução de tipos específicos de tecidos e padronização do sistema de quase todos os órgãos. Exemplos de centros de sinalização incluem o organizador / nó na gástrula que induz o ectoderma neural e padrões da mesoderme, e da zona de polarização atividade que os padrões do eixo ântero-posterior do botão do membro. Embora os mapas destino identificar os precursores dos diferentes órgãos e revelar o caminho do desenvolvimento tomadas pelos seus descendentes no embrião normal, eles não conseguem distinguir entre intrínsecae influências extrínsecas sobre essas células. Eles também não revelam de todo o potencial de desenvolvimento de uma célula, cujos descendentes diferenciar no ambiente complexo de sinalização do embrião. Duas abordagens experimentais pode testar se o destino de uma célula é determinada por factores intrínsecos ou seja posteriormente influenciado por factores externos: 1) transplantação de células para um local novo no embrião, ou 2) a remoção da célula a partir do embrião seguido por cultura em ausência de sinais exógenos.
Ambas as abordagens experimentais têm sido viável em Xenopus, porque as células são suficientemente grandes para serem separadas manualmente. Por exemplo, vários estudos têm excluído células individuais de embriões (para mudar interações célula-célula) ou células transplantadas para locais novos, em embriões de acolhimento para testar mudanças Fate (revisada em 7, 8, 9). Além disso, a segunda abordagem da explantar pequeno número de células a partir de diferentes regiões do embrião into cultura para elucidar as interacções indutivas tecido na ausência de factores exógenos é possível porque as células do embrião de Xenopus são preenchidos com um armazenamento intracelular de nutrientes, as plaquetas da gema. Portanto, elas podem ser cultivadas durante alguns dias em um meio de sal definido sem suplementação nutricional ou factor de crescimento do meio de cultura. Nós temos usado essa abordagem para mostrar que blastômeros animais dorsal tem uma capacidade autônoma de produzir tecidos neurais e dorsal mesodérmicas devido a mRNAs herdada da mãe 10, 11, e outros mostraram que a especificação mesoderma de 32 celulares blastômeros depende tanto informações intrínsecas e extrínsecas 12 . Uma vantagem da cultura de células como explantes é que o meio pode ser suplementado com factores definidos de sinalização a fim de determinar qual a célula-a-célula via de comunicação pode influenciar o destino das células explantadas 12, 13, 14. Além disso, pode-se injetar o pr blastômeroior a cultura com mRNA para sobre-expressar um gene, ou com oligonucleotídeos anti-senso para evitar a tradução de mRNAs endógenos. Estes, ganho e perda de função-análises podem identificar quais as moléculas são necessários para um destino autonomamente expressa. Para a análise do destino do explante, a identificação de tipos específicos de células pode ser realizada por expressão de genes padrão (por exemplo, hibridação in situ, RT-PCR) e ensaios imunocitoquímicos. Este protocolo fornece um simples, mas poderoso maneira, a distinção entre mecanismos intrínsecos e extrínsecos que regulam como uma célula embrionária se desenvolve em tecidos específicos.
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Protocol
1. Preparação de instrumentos, meios de cultura e pratos
- Afie quatro pinças utilizando filme abrasivo Alumina. Fazer isso sob um microscópio de dissecação para monitorar o tamanho da ponta. Um par de fórceps serve como um back-up no caso de uma dica é danificado durante o procedimento. Autoclave as quatro pinças e armazenar em um recipiente estéril.
- Faça 500 ml cada de meio de cultura 0,1 X 1,0 X e (ou Modificação de Marc Ringers [MMR] ou salinos Modificado Barth [MBS]; receitas em 15) e filtro de esterilizar. Rotineiramente utilizar MBS (1X = 88 mM de NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, HEPES 5 mM [pH 7,8], 2,5 mM de NaHCO3). Guarde-o em 14-18 ° C por meses.
- Fazer uma solução de 2% de agarose num meio de cultura (2 g de electroforese de agarose de grau em 100 ml de 1X meio de cultura num frasco de vidro com tampa de rosca). Autoclavar para dissolver agarose. Este pode ser armazenado a 4 ° C, durante meses, e microondas para liquefazer a agarose quando é necessário seguinte.
- Enquanto a agarose é líquido, despeje cerca de 0,5 ml para o fundo de cada poço de uma placa de cultura estéril de 24 poços. Isso vai impedir que os explantes de furar para o plástico.
- Enquanto a agarose é líquido, derrame aproximadamente 2-3 ml para o fundo de dois a três pratos de Petri 60 milímetros, e agite cuidadosamente para garantir que a parte inferior é coberto. Estes servirão como pratos de dissecção eo agarose impede embriões de degola para o plástico uma vez que suas membranas são removidas.
- Quando a agarose tiver arrefecido e endurecido, chama a ponta de uma 6 "pipeta Pasteur até que se funde com uma bola, e ligeiramente tocar na superfície da agarose em cada poço da placa de cultura. Isto vai criar uma depressão pouco profunda em que o explante será colocado.
- Encher cada poço da placa de cultura com meio de cultura estéril 1X.
- Quando a agarose tiver arrefecido e endurecido, encher o prato de dissecação com meio de cultura diluído (0,1 X 0,1 X MMR ou MBS) para facilitar a separação de blastómeros.
2. Selecção de Embriões
- Obtenção de ovos fertilizados e remover o revestimento de acordo com protocolos de geléia padrão 15. Transferi-los para meio de cultura de 0,5 X 100 numa placa de Petri mm.
- Quando os embriões atingem o estágio de 2 células, classificar aqueles em que o sulco de clivagem primeiro corta a área levemente pigmentados no hemisfério animal (Figura 1) para uma placa separada. Estes serão os doadores para os explantes. Manter os restantes dois embriões de células em um prato separado ao lado dos embriões de dadores de todo o procedimento para servir como controlos para a fase de irmãos explantes.
3. Preparação de Explantes
- Colocar 5-10 embriões numa placa de dissecação, mas funcionam apenas com um embrião de uma vez.
- Posicionar o primeiro embrião de modo a membrana vitelina transparente pode ser visto, que é separado por um espaço livre (espaço perivitelino) acima da superfície do pólo animal do embrião. Usando uma força afiadaps na mão subdominante (mão esquerda se for destro), segure a membrana vitelina acima do espaço perivitelino. Usando uma pinça afiada na outra mão, segure a membrana próxima à ponta fórceps primeiro, e puxe em direções opostas para descascar a membrana de distância. Fazer o aperto inicial, a uma distância a partir da célula que está a ser dissecado, de modo que a célula alvo não é danificada durante a remoção da membrana. Pode-se dizer que a membrana foi removido porque o embrião vai achatar.
- Pegue uma célula vizinha com a pinça na mão subdominante e usar esse celular como uma "alça" para a célula a ser dissecado não está diretamente tocado. Com a pinça na outra mão, puxe as restantes células vizinhas para longe do blastômero desejado. Se as células da linha média, que compartilham o mesmo destino, são alvo, eles podem ser removidos em conjunto, como um par. Finalmente, dissecar afastado a "alça" da célula.
- Pegue o blastômero (ou par blastômero), com uma estéril, Pipetas de Pasteur de vidro, evitando bolhas de ar e sucção excessiva. A pipeta pode ser fogo-polido para remover bordas cortantes que podem danificar o celular, mas não rotineiramente fazer isso. Colocar a ponta da pipeta de Pasteur sob a superfície do meio de cultura numa cavidade da placa de cultura de explante e suavemente expelir o blastómeros. Ele deve deslizar na depressão rasa pela gravidade. O blastômero mesmo a partir de mais do que um embrião podem ser combinados em um único explante.
- Repetir este procedimento com os embriões restantes no prato dissecção, uma-a-uma. Depois de cerca de 10 embriões, o prato de dissecação será preenchido com resíduos celulares. Quando isso ocorre, mudar para um prato de dissecação fresco.
- Depois de todas as dissecções são feito, verifique se os explantes estão nas depressões rasas. Caso contrário, eles podem ser suavemente empurrado para dentro da depressão com um laço de cabelo que foi esterilizada com etanol a 70% e seco ao ar.
- Cerca de uma hora após a dissecção passado, remover detritos surrounding explantes curadas com uma estéril, vidro Pasteur pipeta.
- A placa de cultura de explantes em 14-20 ° C ao lado da placa de Petri contendo o irmão, embriões de controlo. Embriões irmãos vai indicar o estado de desenvolvimento dos explantes de blastómeros.
4. Explantes de colheita de Análise
- Colher os explantes quando os irmãos atingir o estágio desejado desenvolvimento. Estes explantes sobreviver muito bem, mesmo que algumas das células se desintegram. Por isso, se existe uma massa turva no poço de cultura, explorar com uma malha de cabelo ou uma pinça para determinar se um explante saudável é enterrado no interior.
- Pegar explantes em um pequeno volume da solução de cultura com uma pipeta de Pasteur de vidro, e gentilmente expeli-los para um tampão de lise adequado, ou fixador para o ensaio a ser realizado.
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Representative Results
A capacidade deste ensaio para avaliar com precisão a potencial de desenvolvimento das células baseia-se dissecando a blastômero correcta com base no destino de mapas 1, 2, 3, 4, 5, 6. Portanto, é importante escolher os embriões com o padrão de pigmentação correcta na fase 2-célula, como se ilustra na Figura 1, que, posteriormente, em conformidade com padrões de clivagem regulares, conforme ilustrado na Figura 2. Se uma observa os embriões classificadas como chegar ao estágio de clivagem necessária e separa os embriões mostrando clivagens irregulares, a precisão é muito melhorada. Como ilustrado na Figura 2, as clivagens regulares ocorrem frequentemente em apenas um lado do embrião. Estes embriões podem ser usados como doadores, se a célula do dador origina a partir do lado "regular". Como os padrões de clivagem regulares são encontradas em menor número de embriões como procede divisão celular, classificar cerca de cinco vezes mais embriões quanto você pretende dissecar. Naturalmente fovos ertilized tendem a ter clivagens mais regulares do que em ovos fertilizados in vitro. Embora os padrões de clivagem variar bastante dentro de uma mesma ninhada, pode-se esperar pelo menos 10-20% para ser útil para este tipo de manipulação.
Blastómeros podem ser cultivadas isoladamente ou em pequenos grupos. Quando blastómeros são primeiro dissecados (Figura 3A), e transferida para o poço de cultura (Figura 3B, C), elas são suaves e frágeis. Em nossa experiência, blastômeros animais e equatorial são muito mais fáceis de dissecar e cultura do que blastômeros vegetais (Figura 3C). Talvez, porque eles são mais pequenas, são mais fáceis de transferir. Eles também parecem se curar mais rapidamente quando peguei com a pinça. Células vegetais, muitas vezes parecem completar citocinese mais lentamente e, portanto, reter as pontes citoplasmáticas com células irmãs, tornando-os mais "permeáveis", quando dissecado, e sua membrana celular é mais frágil e mais fácil de danos.Depois de cerca de 1-2 horas em cultura, o blastômero explantado (s) terá dividida cerca de 4 vezes e descartadas mais de detritos remanescentes danificadas células vizinhas (Figura 3D). Depois de 20 horas, formam pequenos, esferas sólidas de células (Figura 3E). Enquanto alguns podem ser enterrados em detritos, muitas vezes, uma massa saudável pode ser encontrado (Figura 3E, à esquerda).
Embora os explantes são pequenos, eles sobrevivem processamento para hibridação in situ, bem como os explantes tampão mais vulgarmente utilizados em animais, o que permite um controlo mais tarde para a expressão do gene. Na experiência apresentada na Figura 4A, dois blastômeros dorsal (D1.1) ou dois blastómeros ventrais (V1.1) foram dissecados no estádio de 16 células, e cultivados em 1X MBS a 14 ° C até que os embriões irmãos alcançado fases placa neural precoce (ST12-13, cerca de 20-22 horas após a dissecação). Cada amostra foi ensaiada para a expressão de um gene da placa neural zigótica (Sox2 </ Em>) por hibridação in situ (o produto de cor azul). Este ensaio demonstra que a maioria dos animais blastómeros dorsal, que são precursores da placa neural, podem expressar Sox2 autonomamente, isto é, sem sinalização adicionais de outras regiões do embrião. Esses explantes que não expressam Sox2 pode ter sido incorrectamente identificados na altura da dissecção. Em contraste, nenhum dos animais blastómeros ventrais, que são precursores da epiderme ventral, expressa Sox2. Assim, podemos concluir que blastômero dorsal animais têm uma capacidade intrínseca para formar tecido neural, enquanto os blastômeros animais ventral não. Note-se que alguns dos explantes D1.1 também eIongated, uma morfologia indicativo da formação de mesoderme dorsal; blastómeros estes também estão destinados a formar o notocórdio no embrião intacto 3, e em cultura de explantes expressa uma proteína marcadora notocórdio 10. Blastômero destinos intrínsecas pode ser Altere d por microinjecção antes de mRNAs (ganho de função) ou oligonucleótidos anti-sentido morfolino (MOS; perda de função). Na Figura 4B, o efeito de alterar os níveis endógenos de um gene com expressão exclusivamente materna neural, foxD5 16, 17, é testado. Quando o nível endógeno de FoxD5 foi aumentada através da injecção foxD5 mRNAs para os blastómeros 8 células precursoras de V1.1 (linha de baixo), a maioria dos explantes V1.1 (cultivadas para st 12-13) expressa Sox2. Por outro lado, quando o nível endógeno de FoxD5 foi reduzida pela injecção de OMs nos blastómeros 8 células precursoras de D1.1 (linha superior), apenas alguns D1.1 (explantes cultivados para st 12-13) expressa Sox2 (compare a linha de cima da Figura 4A). Estas experiências indicam que a expressão materna de foxD5 desempenha um papel na capacidade intrínseca de blastómeros dorsal para adquirir um destino neural.
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Figura 1. Padrões de pigmentação em duas células de embriões a partir de óvulos fertilizados naturalmente. O sulco primeira clivagem é indicado por uma seta. A) Um exemplo de um embrião que não deve ser utilizada para identificar os blastómeros em fases posteriores, pois a região levemente pigmentados do hemisfério animal do embrião está contida na maior parte em uma célula (à esquerda). Uma vez que o sulco de clivagem primeira prevê o plano médio-sagital de um embrião, a região levemente pigmentados deste embrião não identificará dorsal. B) Dois exemplos de embriões que devem ser separados para culturas de explantes. Em ambos, a região levemente pigmentada do hemisfério animal (*) é dividido pelo sulco primeira clivagem. O embrião à esquerda é no início do primeiro ciclo celular, e a região levemente pigmentada é apenas visível em cerca de 25% da superfície da célula. O embrião à direita está próximo do fim do primeiro ciclo celular, e que o pigmento tenha movido ventrally assim as metades dorsal das duas células são mais leves. Como resultado, em fases posteriores das células animais levemente pigmentados irá prever dorsal (d) e as células animais pigmentadas irá prever ventral (v).
Figura 2. Exemplos de embriões em estágio de clivagem de ovos fertilizados naturalmente. Todos os embriões são orientados com o pólo animal voltado para o leitor, para a parte superior dorsal. A) 4 células de embriões. O embrião da esquerda acaba de entrar no segundo ciclo celular de modo a clivagem sulcos são superficiais. O embrião da direita tem quase concluído o ciclo celular segundo para a clivagem sulcos são mais profundos e as células parecem mais arredondados. Setas pretas apontam para o sulco primeira clivagem, e setas vermelhas apontam para o sulco segunda clivagem. B) 8 células de embriões. O embrião do lado esquerdo é mais cedo é o ciclo celular, terceiro e o embrião no lado direito está pertoo fim do ciclo de terceira célula. C) 16 células de embriões. C 'é um exemplo de clivagens irregulares a serem evitados. C "é um exemplo de clivagens regulares no lado ventral, mas irregular no lado dorsal. C'' 'é um exemplo de mais clivagens regulares no lado dorsal, mas não no lado ventral. C'''' é um exemplo de clivagens regulares na linha média, mas não lateralmente. D) 32 células de embriões. D 'é um exemplo de clivagens regulares no lado ventral, mas irregular no lado dorsal. D'' é um exemplo de clivagens regulares no dorsal lateral, mas não no lado ventral. D'' 'é um exemplo de clivagens regulares sobre o lado direito, mas clivagens mais irregulares do lado esquerdo. E) embrião de célula 64. Para uma representação esquemática destas etapas, consulte a série de teste Nieuwkoop e Faber, que pode ser encontrado em linha ( http://www.xenbase.org/anatomy/alldev.do ).
Figura 3. Explantes de 16 células de embriões de ovos fertilizados naturalmente. A) Um blastômero animais ventral logo após dissecção. Seta indica remanescentes da "alça" da célula. B) Um blastômero animais ventral transferida para um poço de cultura que divide uma vez. C) Um blastômero ventral vegetal logo após dissecção. Comparado com animais blastómeros, estes são maiores e mais difíceis de manipular. D) Dois explantes animais ventral blastômero, 2 horas após o esvaziamento, dividiram cerca de quatro vezes. O explante esquerda é visto a partir do original, a superfície pigmentada exterior do blastômero; explante direito é visto a partir do original, não pigmentado superfície interna do blastômero. E) Dois explantes blastómeros ventrais animais cultivadas durante 24 hr. O explante esquerda está sentado em uma cama de restos celulares (setas), enquanto o explante direito está livre de qualquer detrito. Todas as imagens são em 50X magnificatíon.
Figura 4. Na análise de hibridação in situ da expressão do gene em explantes derivados a partir de 16 células de blastómeros dissecados a partir de ovos fertilizados naturalmente. A. O embrião de 16 células em esquerda ilustra o par de blastómeros dorsal (D1.1) foi explantado para que os resultados em a linha superior, a par e blastômero ventral (V1.1), que foi retirada para os resultados na linha de fundo. Dissecados a partir de embriões pares blastômero não injectados foram colocados em MBS 0,1 x em poços de cultura e incubadas a 14 ° C durante cerca de 20 horas. Elas foram colhidas em tubos de fixador e processados por hibridização in situ para a expressão de um gene zigótica neural, Sox2. Blastômeros B. embriões 8 células foram injetados bilateralmente estágio oucom foxD5 OMs, para reduzir a expressão endógena de blastómeros dorsal, ou com foxD5 mRNA para aumentar a expressão endógena de blastómeros ventrais. Quando os embriões injectados atingiram o estádio de 16 células (20-30 min mais tarde), pares de blastómeros foram dissecados e cultivados e analisados por hibridação in situ como em A. O número de explantes que expressam Sox2 é significativamente reduzido em D1.1 explantes que foram injectados com foxD5 OMs (comparar a linha superior em A). O número de explantes que expressa Sox2 é significativamente aumentada em explantes V1.1 que foram injetados com foxD5 mRNA (compare a linha de fundo em A). Clique aqui para ver maior figura .
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Discussion
Os passos mais críticos para a cultura bem sucedida de blastômeros individuais são os seguintes: 1) identificar correctamente o blastômero de interesse e 2) manutenção de uma cultura estéril e saudável, 3) as células de dissecação na parte correcta do ciclo celular, e 4) o desenvolvimento do Manual necessário destreza para evitar danos durante a dissecção e transferir para a cultura também.
Para manipular blastómeros específicos, é essencial ser capaz de identificar os eixos cardinais. Em embriões de Xenopus, no lado dorsal pode ser identificado por três métodos: (1) marcando o ponto de entrada do esperma com um corante vital 18, 19, (2) basculante ovos fertilizados in vitro e marcação dos lados 18, 19, ou (3) a selecção de embriões na fase de 2-célula em que o sulco de clivagem primeiro corta a região levemente pigmentados no hemisfério animais 20, 21. Usamos o terceiro método, que identifica com precisão blastômeros de naturalmente fertilized 16 células de embriões em cerca de 90% dos casos 20, 21. No momento da fertilização, a pigmentação hemisfério animal começa a contrair para o ponto de entrada do esperma no lado ventral, fazendo com que a região dorsal dos animais para se tornar menos pigmentados, na maioria dos embriões (Figura 1). Há uma variação considerável na extensão desta região levemente pigmentada em garras e até mesmo dentro de garras de ovos de Xenopus. Se o sulco primeira clivagem divide esta área clara igualmente entre as duas células filhas, que, em seguida, mais leves área pode ser utilizado como o indicador do lado dorsal, e o sulco primeira clivagem indicará o plano sagital mediano. Se o sulco primeira clivagem separa as filhas em uma cela escura e uma célula de luz, não usá-lo para o explante porque a pigmentação em fases posteriores não identificar com precisão o lado dorsal. Estudos anteriores mostraram que nestes tipos de embriões, o sulco primeira clivagem manteve-se um marcador de tele plano sagital mediano ao passo que a região levemente pigmentados já não indicado no lado dorsal 20, 21. Os embriões podem também ser seleccionadas a parte inicial da clivagem da célula-4 (embrião esquerda na Figura 2B), quando o primeiro e o segundo sulcos no pólo vegetal ainda pode ser distinto, o primeiro sulco deve ser completa e a segunda não sulco ainda concluído. Se, no entanto, uma espera até que o fim da fase de 4 células para seleccionar embriões (embrião direita na Figura 2B), a clivagem primeiro e segundo sulcos já não podem ser distinguidos, e as células levemente pigmentados podem ser aquelas dorsal em apenas cerca 70% de embriões 20 e 21. Isso irá tornar alvo blastômeros específicos muito menos precisos. Deve notar-se que a percentagem de embriões em que o sulco de clivagem primeiro corta a região levemente pigmentados apresentam grandes variações entre garras. Em nossa experiência que pode dar conta <50% dos ovos em uma embreagem de> 80% Dos ovos em uma embreagem. Independentemente disso, há quase sempre são bastante ovos dentro de uma ninhada de ovos saudáveis que atendem a esse critério para apoiar uma experiência explante.
Os dois meios de cultura recomendados (MMR, MBS) são praticamente intercambiáveis, as preferências dos laboratórios diferentes são na maior parte histórica. MMR pode ser armazenado como uma solução 10X de um ano ou mais. MBS tem uma vida útil mais curta porque é tamponado com bicarbonato. Porque os embriões e de explantes pode sucumbir à infecção bacteriana sem a geleia de protecção e membranas vitelinas, pinças e meios de cultura devem ser estéreis. Se explantes não sobrevivem bem, antibiótico pode ser adicionado ao meio de cultura (por exemplo, 0,1% de gentamicina). Soluções contendo gentamicina ter uma vida de armazenamento de curto e, portanto, deve ser feita no dia em que devem ser utilizados. Restos celulares contém proteases que podem danificar os explantes desprotegidos, e promove o crescimento bacteriano. Por conseguinte, deve ser removed dos poços de cultura após os explantes ter tido a chance de curar.
Dissecções blastômero são realizadas em meio de cultura diluído (0,1 X 0,1 X MBS ou MMR), a fim de diminuir a força de célula-a-célula aderências. Durante as fases de clivagem de Xenopus, a adesão das células é principalmente realizado por caderinas calcium-/magnesium-dependent. Portanto, não é necessário o uso de dissociação enzimática, na verdade isso deve ser evitado porque remove as proteínas de superfície que podem ser importantes na determinação do destino de eventos. Como as células embrionárias a partir de lotes diferentes de ovos aderem com diferentes dosagens, a diluição do meio de dissecção pode necessitar de ser ajustada numa base ad hoc. Se as células são muito aderente para dissecar sem rasgar-los, diminuir a concentração do meio de dissecção progressiva de 0,1 X. Por outro lado, se as células desmoronar quando a membrana vitelina é removido e são muito permeável, aumentar a concentração do dissection médio stepwise. No entanto, não usar a mídia calcium-/magnesium-free porque as células tornam-se demasiado frágil para transferir para os poços de cultura. Separação bem sucedida de blastómeros depende também, quando, durante o ciclo de uma célula desempenha a dissecção. Como mostrado na Figura 2, no início do ciclo celular a clivagem sulcos são rasos e os blastómeros são achatados. Mais tarde no ciclo de clivagem sulcos são mais profundas e as células são mais arredondados. No início do ciclo celular, há pontes citoplasmáticas que irá causar fugas citoplasmática se quebrado. Portanto, as células são mais facilmente dissecado tarde no ciclo celular. 4 células de embriões, 8 células de embriões e células vegetais em todas as fases são mais difíceis de dissecar porque as pontes citoplasmáticas persistir por mais tempo. Pode-se antecipar uma alta taxa de mortalidade para esses explantes, ou seja, é preciso realizar dissecações mais para recuperar uma amostra de tamanho razoável. Pode-se esperar até o início do sulco de clivagem para começar o próximo Dissection destas células para garantir que as pontes citoplasmáticas foram fechados. Enquanto blastômeros individuais tomadas a partir de 8 - e 16 células de embriões sobrevivem bem na cultura, na nossa experiência blastômeros mais velhos saem menos bem como as células individuais. Embora não se saiba a causa desta, a sobrevivência dos explantes mais velhos blastômero pode ser melhorada por meio de dissecção várias (2-6) do mesmo a partir de embriões de blastómeros diferentes e cultivando-as num único poço de cultura 10, 13, 14.
Este procedimento requer prática e alguma destreza manual. Uma vez que o tempo entre as clivagens é dependente da temperatura, é conveniente para armazenar os embriões a 14-16 ° C para diminuir a clivagem e permitir mais tempo para executar as dissecações. No entanto, os embriões não tolera temperaturas inferiores a 14 ° C. O primeiro desafio neste processo é a remoção da membrana vitelina. É melhor não passar para dissecção blastômero até este primeiro passo é dominado. Ao dissecaro blastômero, o "pega" célula é provável a vazar e cair. Esta não é uma preocupação porque uma vez que todas as outras células são descoladas a partir da célula desejada, o "handle" célula pode ser removida com uma pinça. Os restos de pega celulares, bem como outros detritos geralmente caem quando a blastômero é transferida para o poço de cultura (Figura 3B). Blastômeros ficar avidamente ao plástico, então use apenas pipetas de vidro para transferi-los. Usar a pressão mínima de sucção sobre a célula, pois pode desintegrar-se a partir das forças de corte na pipeta. Além disso, evitar bolhas de ar na pipeta e garantir que a ponta da pipeta está abaixo da superfície do meio de cultura em que o explante é expelido porque as células explodirá se tocarem uma interface ar-água.
O protocolo aqui descrito utiliza embriões não manipuladas como dadores de explantes e meios para cultura de sal simples. Estes sistemas permitem uma para testar a capacidade intrínseca do explante a exprEss destinos especiais. Este método pode ser expandido experimentalmente em duas maneiras. Em primeiro lugar, os meios de cultura podem ser suplementados com sinalização / factores de crescimento para testar se estas moléculas podem fazer com que o explante para expressar destinos alternativos. Em segundo lugar, a expressão do gene dos embriões de dadores podem ser alteradas através da injecção ou mRNAs (ganho de função) ou oligonucleótidos anti-sentido morfolino (perda de função) em precursores específicos antes da dissecação de blastómeros. Isto pode ser feito na fase de uma célula, ou de uma forma mais específica, 1-2 divisões celulares antes da dissecação. Com estas abordagens, pode-se testar se um determinado gene exogenamente fornecido provoca um blastômero para adquirir um destino alternativo, ou se um determinado gene endógeno é necessária para a blastômero para expressar seu destino autónomo (por exemplo, a Figura 4B). Estes são poderosos abordagens experimentais porque eliminam a influência de confusão das outras células e sinalização centers presentes no embrião intacto.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a UGT Harlan Fellowship para suporte de Paaqua Grant ea UGT Luther Rice Fellowship para suporte de Mona Herold. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation concessão MCB-1121711.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-38 | Course (12 μm), for major repairs of forceps tips |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-46 | Medium (3 μm), for fine sharpening of forceps tips |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-54 | Fine (0.3 μm), for polishing of forceps tips |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | #11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. Corrosive resistant so they can be autoclaved. |
| Gentamicin solution | Sigma | G1397 | Add to medium on same day as use |
References
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