Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Бластомеров эксплантов для тестирования для сотовых приверженности судьбы во время эмбрионального развития

doi: 10.3791/4458 Published: January 26, 2013

Summary

Судьба отдельных эмбриональные клетки может быть под влиянием унаследованного молекул и / или сигналов от соседних клеток. Используя судьба карты расщепления зародыше Xenopus, одной бластомеры могут быть определены для культуры в изоляции для оценки вклада наследственных молекул по сравнению с межклеточных взаимодействий.

Abstract

Судьба карт, построенных по линии отслеживания всех клеток эмбриона, выявить, какие ткани происходят от каждой клетки эмбриона. Хотя судьба карт очень полезны для выявления предвестников органа и для выяснения развитии путь, по которому потомки клеток заполнения этого органа в нормальном эмбрионе, они не иллюстрируют полное развитие потенциала клеток-предшественников или определить механизмы, с помощью которых его судьба определяется. Для проверки ячейки обязательства судьбы, сравнить нормального репертуара клетки потомков в интактных эмбрионов (судьба карте) с теми, выраженное после экспериментальных манипуляций. Это судьба ячейки фиксированной (совершенные) независимо от окружающей среды сотовый, или это зависит от внешних факторов, предоставленных его соседей? Используя подробные карты судьбы эмбрионов Xenopus, мы расскажем, как выявление, изоляция и культуре одного прекурсоров стадии дробления, называют BlastoМерес. Такой подход позволяет оценить, являются ли эти ранние клетки полны решимости судьбы они приобретают в их обычной среде в неповрежденной эмбриона, требующих взаимодействия с соседними клетками, или можно влиять, чтобы выразить альтернативные судьбы при соприкосновении с другими типами сигналов.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Xenopus Хепориз эмбрионов были использованы широко определить механизмы, с помощью которых эмбриональные клетки приобретают их конкретными судьбами, потому что их яйца являются достаточно большими, чтобы позволить микрохирургического подхода. Кроме того, они развиваются внешне без необходимости использования пищевых добавок в культуральной среде, потому что каждая клетка содержит богатый внутриклеточного питания тромбоцитов желток, которые обеспечивают внутренний запас энергии. Важным преимуществом для изучения механизмов, посредством которых клетки судьбу определяют это полный набор карт судьбы бластомеров на стадии дробления (от 2 - до 32-клеточной стадии) 1, 2, 3, 4, 5, 6. Эти карты были построены microinjecting обнаружены молекулы в одну, идентифицируемые бластомеров и контроль позднее в развитие которого тканей населенных меченых потомства. В соответствии Карты судьбы возможны, потому что кардинальных осей эмбрионы могут быть надежно выявлены во многих ЭмбриОС. Во-первых, во всех эмбрионов дикого типа животных полушария пигментированные, в то время вегетативного полушария не является. Во-вторых, вступление сперма при оплодотворении вызывает сокращение пигментации животных полушария в будущее брюшной стороны, во многих эмбрионов пигментации разницы, следовательно, может быть использована для различия между спинной и брюшной сторон. В-третьих, первой борозды дробления приближается к середине сагиттальной плоскости в большинстве эмбрионов, и, следовательно, может быть использована для определения правой и левой сторон эмбриона. Судьба карты также рассчитывать на то, что, естественно оплодотворенные яйца часто расщепляют в закономерности, которые делают каждого бластомеров идентифицируемые по большому населения эмбрионов. В то время как изменчивость внутри и между кладки яиц в отношении пигментации и расщепление моделей, с использованием процедур отбора, описанные здесь позволяет клеткам с заданными судьбы должны быть определены с 90% точностью.

Сотовые судьбы может быть определенадобываются во время эмбриогенеза несколько механизмов. Внутренние факторы, такие как дифференциально унаследовал цитоплазматических мРНК или белков, способствуют некоторые аспекты раннего паттерна. Например, конкретных материнских мРНК определить, какие клетки будут способствовать зародышевой линии, становятся энтодермы, или вклад в спинной оси тела (обзор 7). Внешние факторы при условии, локально соседними клетками или более отдаленно от центра эмбриональных сигнализации, несут ответственность за склонение конкретные типы тканей и структурирование почти каждый орган системы. Примеры сигнализации центры включают в себя организатором / узел в гаструлы, что вызывает нервные эктодермы и мезодермы моделей, и в зоне поляризующей активности, что модели передне-задней оси конечности почки. Хотя судьба карты выявления предвестников различных органов и выявить пути развития, принятых их потомков в нормальный эмбрион, они не могут различать внутреннююи внешние воздействия на эти клетки. Они также не раскрывают полный потенциал развития клетки, чьи потомки дифференцироваться в комплексе сигнальную среду эмбриона. Два экспериментальных подходов можете проверить судьбу клетки определяется внутренним факторам или в дальнейшем под влиянием внешних факторов: 1) трансплантации клетки к новому расположению в зародыше, или 2) удаление клеток из эмбрионов последующей культуры в отсутствие экзогенных сигналов.

Оба экспериментальных подходов было возможно в Xenopus, потому что клетки являются достаточно большими, чтобы вручную разделить. Например, многочисленные исследования были удалены отдельные клетки из эмбрионов (для изменения межклеточных взаимодействий) или пересаженных клеток к новым мест в принимающих эмбрионы, чтобы проверить на судьбу изменения (обзор в 7, 8, 9). Кроме того, второй подход культивирующий в искусственной среде небольшого числа клеток из различных регионов эмбриона яNto культуры выяснить индуктивных взаимодействий ткани в отсутствие внешних факторов, возможно потому, что клетки эмбрионов Xenopus заполнены внутриклеточных питательных магазине, желток тромбоцитов. Таким образом, они могут быть культивировали в течение нескольких дней в определенный солевой среде без питания или добавок фактор роста питательной среды. Мы использовали этот подход, чтобы показать, что спинной бластомеров животных имеют автономную способность производить нервные и спинного мезодермальных тканей из-за наследуется по материнской мРНК, 10, 11, и другие показали, что мезодерма спецификации 32-клетки бластомеры зависит как от внутренней и внешней информации 12 . Преимущество культивирования клеток в качестве эксплантов в том, что среда также может быть дополнен с определенными факторами сигнализации чтобы определить, какие клетки к клетке канал связи может повлиять на судьбу эксплантированных ячейки 12, 13, 14. Кроме того, можно вводить бластомеров пр.IOR к культуре с мРНК более-экспресс ген, или с антисмысловые олигонуклеотиды, чтобы предотвратить перевод эндогенной мРНК. Эти, усиления и потерей функции анализа можно определить, какие молекулы, необходимые для автономного выразил судьба. Для анализа судьбы эксплантов, выявление специфических типов клеток может быть выполнена стандартная экспрессии генов (например, в гибридизация, RT-PCR) и иммуноцитохимических анализов. Этот протокол обеспечивает простой, но мощный, способ различать внутренние и внешние механизмы, которые регулируют как эмбриональная клетка развивается в определенных тканях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Подготовка инструментов, культура, СМИ и посуда

  1. Резкость четыре щипцы использованием глинозема абразивной пленкой. Делайте это под рассекает микроскопом, чтобы контролировать размер чаевых. Одна пара щипцов служит в качестве резервного в случае, если наконечник поврежден во время процедуры. Автоклав все четыре щипцы и хранить в стерильный контейнер.
  2. Сделать 500 мл каждая из 0,1 X 1,0 X и культуральной среде (либо Марка изменения Ringers [MMR] или изменения Барта Saline [MBS]; рецептов в 15) и фильтр стерилизуют. Мы регулярно использовать MBS (1X = 88 мм NaCl, 1 мМ KCl, 0,7 мМ CaCl 2, 1 мМ MgSO 4, 5 мМ HEPES [рН 7,8], 2,5 мМ NaHCO 3). Хранить при температуре 14-18 ° С в течение месяца.
  3. Сделайте 2% агарозном решение в культуральной среде (2 г электрофореза в агарозном класса в 100 мл 1X культуральной среде в стеклянной бутылке колпачок). Автоклав для растворения агарозы. Это можно хранить при температуре 4 ° C в течение нескольких месяцев, и микроволновой печи для разжижения агарозы, когда она необходима следующая.
  4. В то время как агарозы является жидкость, влить около 0,5 мл на дно каждой лунки стерильного 24-а культура пластины. Это позволит предотвратить эксплантов от прилипания к пластику.
  5. В то время как агарозы является жидкость, влить около 2-3 мл на дно в два-три 60 мм чашки Петри, и вихрем осторожно, чтобы убедиться, что дно покрыто. Они будут служить рассечение блюд и агарозы предотвращает эмбрионов от прилипания к пластиковым раз их мембраны удаляются.
  6. Когда агарозном остыл и затвердел, пламя кончиком 6 "пипетки Пастера, пока он тает в мяч, и слегка прикоснуться к ней на поверхность агарозы в каждую лунку культуры пластины. Это создаст небольшое углубление, в которое эксплантов будет размещен.
  7. Заполните каждую лунку культуры пластина с 1X стерильную питательную среду.
  8. Когда агарозном остыл и затвердел, заполните рассечение блюдо с разбавленным культуральной среде (0,1 X 0,1 X MMR или MBS), чтобы облегчить разделение бластомеров.

    2. Отбор эмбрионов

    1. Получить оплодотворенных яиц и удалить желе слоями в соответствии со стандартными протоколами 15. Передача их 0.5X культуральной среде в 100 мм блюдо Петри.
    2. Когда эмбрионы достигают 2-клеточной стадии, отсортировать те, в которых первая борозда дробления делит слегка пигментированные области, в животном полушария (рис. 1) в отдельную посуду. Это будут донорами для эксплантов. Храните оставшиеся 2-клетки эмбрионов в отдельном блюде рядом с донорами эмбрионов в течение всей процедуры, чтобы служить брата управления на сцену эксплантов.

    3. Подготовка Экспланты

    1. Поместите 5-10 эмбрионов в рассечение блюдо, но работают только на одного эмбриона за один раз.
    2. Расположите первый эмбрион так прозрачная мембрана желточного видно, он отделен свободное пространство (перивителлиновое пространства) над поверхностью животных полюсе эмбриона. Использование заостренным силуPS В свое субдоминанты руки (левая рука, если он правша), возьмитесь за желточной мембраны выше перивителлинового пространства. Использование заостренные щипцы, с другой стороны, понять мембраны близка к первой кончик пинцетом и аккуратно потяните в разные стороны, чтобы очистить от мембраны. Сделать начальное понимание на расстоянии от ячейки, в которой должны быть расчленены, так что клетки-мишени не поврежден во время удаления мембраны. Можно сказать, что мембрана была удалена, потому что эмбрион будет сглаживаться.
    3. Захватите одну соседнюю клетку с пинцетом в руке субдоминанты и использовать эту клетку в качестве "ручки", так что клетки должны быть расчлененным напрямую не коснулся. С щипцами, с другой стороны, осторожно потяните оставшиеся соседние клетки от желаемого бластомеров. Если средняя линия клеток, которая постигла та же участь, целенаправленны, они могут быть удалены вместе, как пара. И, наконец, рассекают от «ручки» клетки.
    4. Возьмите бластомеров (или бластомеров пара), стерильной, Стекло пипетки Пастера, избегая пузырьков воздуха и чрезмерное всасывание. Пипетки может быть огневой полировкой для удаления острых краев, которые могут повредить клетки, но мы обычно не делаем этого. Поместите кончик пипетки Пастера под поверхностью культуральной среды в хорошо эксплантата блюдо культуры и аккуратно высылать бластомеров. Он должен скользить в небольшое углубление под действием силы тяжести. То же самое бластомеров из более чем одного эмбриона могут быть объединены в одну эксплантов.
    5. Повторите эту процедуру с остальными эмбрионов в рассечение блюдо, один-на-один. После примерно 10 эмбрионов, рассечение блюдо будет наполнено сотовой мусора. Когда это произойдет, изменится к новому блюду рассечение.
    6. После всех вскрытий сделано, проверьте эксплантов в неглубоких депрессиях. Если нет, то они могут быть слегка толкнул в депрессию с волосами цикла, который был стерилизован в 70% этанола и сушат на воздухе.
    7. Примерно через час после последнего вскрытия, удаления мусора surrouнахождении исцелил эксплантов с стерильная, стекло пипетки Пастера.
    8. Культура пластины эксплантов на 14-20 ° C, рядом с чашки Петри, содержащие брат, контрольных эмбрионов. Родного брата эмбрионов будет означать этап развития бластомеров эксплантов.

    4. Уборочная эксплантов для анализа

    1. Урожай эксплантов, когда братья и сестры достижения желаемой стадии развития. Эти эксплантов выжить очень хорошо, даже если некоторые клетки разрушаются. Поэтому, если есть облачно массы в культуре хорошо, исследовать его с петлей волос или щипцов для определения здорового эксплантов похоронен внутри.
    2. Возьмите эксплантов в небольшом объеме культуры решением со стеклянной пипетки Пастера и аккуратно удалить их в фиксаторе или буфер для лизиса подходят для анализа, которые будут проводиться.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Способность этого анализа, чтобы точно оценить потенциал развития клетки опирается на рассекающих из правильных бластомеров основан на судьбе 1 карт, 2, 3, 4, 5, 6. Поэтому, очень важно выбрать эмбрионов с правильной картины пигментации на 2-клеточной стадии, как показано на рисунке 1, что впоследствии соответствующие закономерности расщепления, как показано на рисунке 2. Если наблюдается отсортированы эмбрионов, как они достигают необходимой стадии расщепления и выделяет эмбрионов показывает нерегулярные расколы, точность значительно улучшилось. Как показано на рисунке 2, регулярные расколы часто встречаются только на одной стороне эмбриона. Эти эмбрионы могут быть использованы в качестве доноров, если клетки-донора происходит от "обычных" стороны. Потому что закономерности расщепления находятся в меньшем количестве эмбрионов, как клеточное деление доходов, род примерно в пять раз больше эмбрионов, как вы собираетесь анализировать. Естественно Fertilized яйца имеют тенденцию к более регулярным, чем раскол в пробирке оплодотворенных яиц. Хотя расщепление моделей меняться очень многое в одной кладке яиц, можно ожидать, по крайней мере, на 10-20%, чтобы быть полезным для такого рода манипуляций.

Бластомеров можно культивировать в одиночку или небольшими группами. Когда бластомеров сначала расчлененным (рис. 3А), и передается в культуре хорошо (Рисунок 3B, C), они мягкие и хрупкие. По нашему опыту, животных и экваториальной бластомеров намного легче анализировать и культуры, чем растительные бластомеров (рис. 3). Возможно, потому, что они меньше, они легче перенести. Кроме того, они, кажется, заживают быстрее, когда порезал с помощью пинцета. Растительные клетки часто кажется, для завершения цитокинеза медленнее и таким образом сохранить цитоплазматические мостики с сестрой клетки, делая их более "дырявой", когда расчленены, и их клеточные мембраны более хрупкими и легче повреждения.Через 1-2 ч в культуре, эксплантированных бластомеров (ы) будет разделена примерно в 4 раза и сбросила большую часть мусора, оставшегося от повреждения соседних клеток (рис. 3D). После 20 часов, они образуют небольшие, крепкие шары клеток (Рис. 3E). В то время как некоторые из них могут быть похоронены в мусоре, часто здоровой массы могут быть найдены (Рис. 3E, слева).

Хотя эксплантов малы, они выживают за обработку в гибридизация, а также наиболее часто используемые эксплантов животных крышкой, которая позволяет контролировать позже экспрессии генов. В эксперименте показано на рисунке 4A, два спинных бластомеров (D1.1) или две вентральные бластомеры (V1.1) были вскрыты на 16-клеточной стадии и культивировали в 1X MBS при 14 ° C, пока брат эмбрионов достигли ранних стадиях нейронных пластины (ST12-13; около 20-22 часов после рассечения). Каждый образец анализировали на экспрессию генов зиготических нейронных пластины (Sox2 </ EM>) на в гибридизация (синий продукт реакции). Этот анализ показывает, что большинство спинного бластомеров животных, которые являются предшественниками нервной пластинки, можно выразить Sox2 автономно, то есть без дополнительной сигнализации из других регионов эмбриона. Те эксплантов, которые не выражают Sox2, возможно, были неправильно определены во время вскрытия. В противоположность этому, ни один из брюшной бластомеров животных, которые являются предшественниками брюшной эпидермис, экспресс-Sox2. Таким образом, мы заключаем, что спинной животных бластомеров имеют внутреннюю способность к образованию нервной ткани, в то время как вентральные бластомеры животных нет. Обратите внимание, что некоторые из D1.1 эксплантов также eIongated, морфология указывает на спинной формирования мезодермы; этих бластомеров также суждено сформировать хорды в интактных эмбрионов 3, а в культуре эксплантов экспресс белка хорды маркера 10. Бластомеров внутренней судьбы может быть altere D по предварительному микроинъекции мРНК (избыточной функцией) или анти-смысл морфолино олигонуклеотидов (МО; потерей функции). На рисунке 4В, эффект от изменения эндогенного уровня материнской выразил нейронных генов, foxD5 16, 17, проверено. Когда эндогенного уровня FoxD5 была увеличена путем введения foxD5 мРНК в 8-клеток-предшественников бластомеры V1.1 (нижний ряд), большинство из эксплантов V1.1 (культивировали в Санкт 12-13) выразил Sox2. И наоборот, когда эндогенный уровень FoxD5 была снижена путем введения МО в 8-клеток-предшественников бластомеры D1.1 (верхний ряд), всего в нескольких D1.1 эксплантов (культивировали в Санкт 12-13) выразил Sox2 (по сравнению с Верхний ряд рис. 4а). Эти эксперименты показывают, что материнская выражение foxD5 играет важную роль в собственной способности спинного бластомеров на приобретение нейронных судьба.

ftp_upload/4458/4458fig1.jpg "ALT =" Рисунок 1 "/>
Рисунок 1. Пигментация модели в 2-клетки эмбриона из оплодотворенной яйцеклетки естественно. Первая борозда дробления указывает стрелка. A) пример эмбриона, которые не должны быть использованы для идентификации бластомеров на более поздних стадиях, потому что слегка пигментированные области животного полушарие эмбриона содержится в основном в одной ячейке (слева). С первой борозды дробления предсказывает середине сагиттальной плоскости зародыша, слегка пигментированные области этот эмбрион не будет определить спины. Б) Два примера из эмбрионов, которые должны быть отсортированы по эксплантов культур. В обоих случаях слегка пигментированные области животного полушарии (*) делится на части первой борозды дробления. Эмбриона слева в начале первого клеточного цикла, и слегка пигментированные области видна только в около 25% поверхности клетки. Эмбриона на право близится к концу первого клеточного цикла, и пигмент переехал веntrally так спинной половинки две клетки легче. В результате, на более поздних стадиях слегка пигментированные клетки животных будет предсказывать спины (г) и темно пигментированные клетки животных будет предсказывать вентральной (V).

Рисунок 2
Рисунок 2. Примеры эмбрионов на стадии дробления с естественным оплодотворенных яиц. Все зародыши ориентированы с животными полюса, стоящих перед читателем, спины к вершине. А) 4-клетки эмбрионов. Эмбрион на левой только вступил во вторую клеточного цикла, так что расщепление борозды мелкие. Эмбриона на право почти завершила второй цикл клетки таким образом, расщепление борозды глубокие и клетки появляются более округлой. Черные стрелки указывают на первой борозды дробления, а красные стрелки указывают на второй борозды дробления. B) 8-клетки эмбрионов. Эмбриона слева рано является третьим клеточного цикла и зародыш справа рядомВ конце третьего цикла клетки. C) 16-клетки эмбрионов. C 'является примером нерегулярного расколы, которые следует избегать. С "является примером регулярной расколы на брюшной стороне, но нерегулярные на спинной стороне. C'' 'является примером более регулярными расколы на спинной стороне, а не на брюшной стороне. C'''' является примером регулярно раскол в средней линии, но не сбоку. D) 32-клетки эмбрионов. D 'является примером регулярной расколы на брюшной стороне, но нерегулярные на спинной стороне. D'' является примером регулярной расколы на спинной стороны, но не на брюшной стороне. D'' 'является примером регулярной расколы на правой стороне, но более нерегулярным расколы на левой стороне. E) 64-эмбриона. Для схематическое изображение этих этапов, пожалуйста, обратитесь к Серия Nieuwkoop и Фабер постановки, которые можно найти он-лайн ( http://www.xenbase.org/anatomy/alldev.do ).


Рисунок 3. Эксплантов из 16-клетки эмбриона из оплодотворенной яйцеклетки естественно. A) вентральный бластомеров животное вскоре после вскрытия. Стрелка обозначает остатки «ручкой» клетки. B) вентральный бластомеров животных перевели в культуре хорошо, что разделил один раз. C) вентральный растительного бластомеров вскоре после вскрытия. По сравнению с животными бластомеров, эти большие, и труднее манипулировать. D) Два вентральных животных бластомеров эксплантов, 2 часа после вскрытия, разделились примерно в четыре раза. Левая эксплантов рассматривается с оригинальным, пигментные внешней поверхности бластомеров, право эксплантов рассматривается от оригинала, непигментированными внутренней поверхности бластомеров. E) два вентральных эксплантов бластомеров животных культивировали в течение 24 часов. Левая эксплантов сидит в постели распада клеток (стрелки), тогда как право эксплантов нет никаких осколков. Все изображения на 50X Magnificatион.

Рисунок 4
Рисунок 4. На месте гибридизации анализ экспрессии генов в эксплантатах, полученные из 16-клеточной бластомеров расчлененный из естественно оплодотворенных яиц. А. 16-эмбрион на левой иллюстрирует спинного пары бластомеров (D1.1), который был эксплантированных результатов в в верхнем ряду, и вентральной пары бластомеров (V1.1), который был эксплантированных за результаты в нижней строке. Расчлененный бластомеров пар из uninjected эмбрионы помещают в 0,1 X MBS в области культуры скважин и инкубировали при 14 ° C в течение 20 часов. Они были собраны в трубах фиксатором и обрабатываются в гибридизация для выражения зиготических нейронных генов, Sox2. B. бластомеров 8-элементная эмбрионов на стадии вводили двусторонней илис foxD5 МО, чтобы уменьшить эндогенной экспрессии в спинной бластомеров, или с foxD5 мРНК увеличение эндогенной экспрессии в вентральные бластомеры. Когда вводили эмбрионов достигли 16-клеточной стадии (20-30 мин позже), бластомеров пары были расчленены, культивировали и проанализированы в гибридизация, как в. Число эксплантов, которые выражают Sox2 значительно снижается в D1.1 эксплантов, которые были введены с foxD5 МО (сравните с верхней строки в). Число эксплантов, которые выражают Sox2 значительно увеличивается в эксплантатах V1.1, которые были введены с foxD5 мРНК (по сравнению с нижней строки в). Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Наиболее важных шагов для успешного культивирования отдельных бластомеров являются: 1) правильность определения бластомеров интересов; 2) поддержание стерильной, здоровой культуры, 3) рассекает клеток при правильной частью клеточного цикла и 4) разработку необходимых руководства ловкости, чтобы предотвратить повреждения во время рассечения и передать культуру.

Для управления конкретными бластомеров, важно быть в состоянии идентифицировать кардинальных осей. У эмбрионов Xenopus, спинной стороне могут быть определены тремя способами: (1) маркировка спермы точку входа с витальным красителем 18, 19, (2) чаевые в пробирке оплодотворенных яиц и маркировка одной стороны 18, 19, или (3) выбора эмбрионов в течение 2-клеточной стадии, в которой первая борозда дробления делит слегка пигментированные области в животном полушарии 20, 21. Мы используем третий метод, который точно выявляет бластомеров из естественно-удобрений16-е изд клетки эмбрионов примерно в 90% случаев, 20, 21. При оплодотворении, пигментации животных полушарие начинает сжиматься к точке спермы въезд на брюшной стороне, вызывая области спины животного, чтобы стать менее пигментированы в большинстве эмбрионов (рис. 1). Существует значительная разница в степени этого слегка пигментированные области по муфт и даже внутри кладки яиц Xenopus. Если первая борозда дробления делит это легче область поровну между двумя дочерними клетками, то, что легче области может быть использована в качестве показателя спинной стороне, и первая борозда дробления будет указывать на середину сагиттальной плоскости. Если первая борозда дробления отделяет дочерей в одной темной камере и одной легкой клетки, не используйте его для эксплантов, потому что пигментация на более поздних этапах не будет точно определить спинной стороне. Предыдущие исследования показали, что в этих видах эмбрионов первой борозды дробления остается маркером тОн середине сагиттальной плоскости в то время как слегка пигментированные области не указано спинной стороне 20, 21. Эмбрионы могут быть выбраны в начале 4-элементная расщепления (слева эмбриона в рис. 2В), когда первый и второй борозды на вегетативном полюсе может быть прослежена, первая борозда должна быть полной, а второй борозды не еще не завершен. Если, однако, ждет, пока к концу 4-клеточной стадии для выбора эмбрионов (зародышей право на Рисунке 2B), первый и второй борозды дробления не может быть уважаемым, и слегка пигментированные клетки могут быть спинного из них только около 70% эмбрионов 20, 21. Это будет оказывать ориентированные на конкретные бластомеров гораздо менее точны. Следует отметить, что процент эмбрионов, в котором первая борозда дробления делит слегка пигментированные области зависит многое на лапы. По нашему опыту они могут составлять <50% яиц в кладке до> 80% Яиц в кладке. Несмотря на это, там почти всегда достаточно яиц в кладке здоровые яйца, которые отвечают этому критерию для поддержки эксплантов эксперимент.

Два рекомендуемых питательных сред (MMR, MBS) практически взаимозаменяемы, предпочтения различных лабораториях в основном исторические. MMR могут быть сохранены как 10X решение в течение года или больше. MBS имеет короткий срок годности, потому что в буфере бикарбоната. Поскольку эмбрионы и эксплантов может поддаться бактериальной инфекции без защитного желе и желточной мембраны, щипцы и культура СМИ должны быть стерильными. Если эксплантов не выживают хорошо, антибиотики могут быть добавлены в культуральной среде (например, 0,1% гентамицина). Растворы, содержащие гентамицина имеют короткий срок хранения, и, следовательно, должно быть свежим в тот день, они должны быть использованы. Сотовый мусора содержит протеазы, которые могут повредить незащищенную эксплантов, а также способствует росту бактерий. Таким образом, она должна быть РемоВЭД от культуры скважин после эксплантов имели возможность зажить.

Бластомеров вскрытия выполняются в разбавленных культуральной среде (0,1 X 0,1 X MBS или MMR) для того, чтобы уменьшить прочность клетки к клетке спаек. Во время этапа Xenopus декольте, клеточной адгезии в основном осуществляется calcium-/magnesium-dependent кадгерины. Поэтому нет необходимости использовать ферментативные диссоциации, в самом деле этого следует избегать, поскольку она удаляет поверхностные белки, которые могут быть важными событиями в судьбе определения. Потому что эмбриональные клетки от различных партий яиц придерживаются различных сил, разведение рассечение среды может нуждаться в корректировке на разовой основе. Если клетки тоже сторонник, чтобы анализировать, не разрывая их, снизить концентрацию вскрытии среднего ступенчато от 0,1 X. Наоборот, если клетки распадаются, когда желточной оболочки удаляют и очень неплотный, повышают концентрацию dissectioп среднего поэтапно. Тем не менее, не используйте calcium-/magnesium-free СМИ, потому что клетки становятся слишком хрупкими, чтобы передать культуру скважин. Успешное разделение бластомеров также зависит от того, когда во время клеточного цикла каждый выполняет вскрытие. Как показано на рисунке 2, в начале клеточного цикла расщепления борозды мелкие и бластомеров сглажены. Позже в тот же цикл расщепления борозды глубокие и клетки более округлые. В начале клеточного цикла, есть цитоплазматические мостики, что приведет к утечке цитоплазматических если нарушена. Таким образом, клетки более легко расчлененные в конце клеточного цикла. 4-элементная эмбрионов, 8-элементная эмбрионов, и растительные клетки на всех этапах труднее анализировать, потому что цитоплазматические мостики сохраняться дольше. Можно ожидать высокой смертности для этих эксплантов, то есть нужно выполнять более вскрытий, чтобы восстановить разумный размер выборки. Можно подождать до начала следующего борозды дробления, чтобы начать Диссеие этих клеток, чтобы убедиться, что цитоплазматические мостики были закрыты. В то время как одна бластомеров, взятых из 8 - и 16-клетки эмбрионов хорошо выживают в культуре, в нашем опыте старших бластомеров тариф меньше и отдельных клеток. Хотя мы не знаем причину этого, выживание старших бластомеров эксплантов может быть улучшена путем рассечения несколько (2-6) того же бластомеров из разных эмбрионов и культивирование их вместе в одной культуры также 10, 13, 14.

Эта процедура требует практики и некоторые ловкость рук. Потому что время между расколы зависит от температуры, это удобно для хранения эмбрионов на 14-16 ° C, чтобы замедлить расщепление и предоставить больше времени для выполнения вскрытия. Тем не менее, эмбрионы не переносят температуры ниже 14 ° C. Первая задача в этой процедуре удаления желточной оболочки. Лучше не переходить к бластомеров рассечение, пока этот первый шаг освоен. Когда рассекаетиз бластомеров, "ручка" клетка может течь и разваливаться. Это не беспокойство, потому что, как только все другие клетки очищаются от нужной ячейке, "ручка" клетки могут быть удалены с помощью пинцета. Ручка клетки остатков, а также другой мусор обычно падают, когда бластомеров передается в культуре хорошо (рис. 3В). Бластомеров придерживаться жадно к пластику, так что используйте только пипетки стеклянные для передачи их. Использование минимального давления сосания на клетки, поскольку она может разрушаться от силы сдвига в пипетку. Кроме того, избегайте пузырьков воздуха в пипетку и убедитесь, что кончик пипетки ниже поверхности питательной среды, когда эксплантов исключен, поскольку клетки могут взорваться, если они касаются раздела воздух-вода.

В протоколе описаны здесь используется unmanipulated эмбрионов в качестве доноров для эксплантов и простых средствах массовой информации соль для культивирования. Они позволяют проверить внутреннюю способность эксплантов, чтобы выражениеESS частности судьбы. Этот метод может быть экспериментально расширен двумя способами. Во-первых, культуру средств массовой информации может быть дополнен сигнализации / факторами роста для проверки этих молекул может привести к эксплантов, чтобы выразить альтернативные судьбы. Во-вторых, экспрессии генов донора эмбрионы могут быть изменены путем введения либо мРНК (избыточной функцией) или анти-смысл морфолино олигонуклеотидов (с потерей функции) в конкретных прекурсоров до бластомеров рассечение. Это может быть сделано на 1-клеточной стадии, или в более целенаправленно на 1-2 клеточных делений до вскрытия. С учетом этих подходов, можно проверить, является ли конкретный экзогенно гена вызывает бластомеров приобретать альтернативные судьбы, или конкретного эндогенного гена является необходимым для бластомеров, чтобы выразить свою автономную судьбу (например, рисунок 4B). Эти мощные экспериментальные подходы, поскольку они устраняют смешанным влиянием других клеток и сигнализации CEnters представить в интактных эмбрионов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Авторы хотели бы выразить признательность GWU Харлан стипендий для поддержки Paaqua Грант и GWU Лютер Райс стипендий для поддержки Мона Herold. Эта работа была выполнена при поддержке Национального научного фонда грант MCB-1121711.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alumina abrasive film Thomas Scientific #6775E-38 Course (12 μm), for major repairs of forceps tips
Alumina abrasive film Thomas Scientific #6775E-46 Medium (3 μm), for fine sharpening of forceps tips
Alumina abrasive film Thomas Scientific #6775E-54 Fine (0.3 μm), for polishing of forceps tips
Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 Fine Science Tools #11252-30 These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. Corrosive resistant so they can be autoclaved.
Gentamicin solution Sigma G1397 Add to medium on same day as use

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dale, L., Slack, J. M. Fate map of the 32-cell stage of Xenopus laevis. Development. 100, 279-295 (1987).
  2. Masho, R., Kubota, H. Y. Developmental fates of blastomeres of the eight-cell stage Xenopus embryo. Dev. Growth, Diff. 30, 347-359 (1988).
  3. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 119, 560-578 (1987).
  4. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 122, 300-319 (1987).
  5. Moody, S. A., Kline, M. J. Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres. Anat. Embryol. 182, 347-362 (1990).
  6. Takasaki, H. Fates and roles of the presumptive organizer region in the 32-cell embryos in normal development of Xenopus laevis. Dev. Growth, Diff. 29, 141-152 (1987).
  7. Sullivan, S. A., Moore, K. B., Moody, S. A. Chapter 20 Early events in frog blastomere fate determination. Cell Fate and Lineage Determination. Moody, S. A. Academic Press. 297-321 (1999).
  8. Moore, K. B., Moody, S. A. Animal-vegetal asymmetries influence the earliest steps in retinal fate commitment in Xenopus. Dev. Biol. 212, 25-41 (1999).
  9. Yan, B., Moody, S. A. The competence of Xenopus blastomeres to produce neural and retinal progeny is repressed by two endo-mesoderm promoting pathways. Dev. Biol. 305, 103-119 (2007).
  10. Gallagher, B. C., Hainski, A. M., Moody, S. A. Autonomous differentiation of dorsal axial structures from an animal cap cleavage stage blastomere in Xenopus. Development. 112, 1103-1114 (1991).
  11. Hainski, A. M., Moody, S. A. Xenopus maternal mRNAs from a dorsal animal blastomere induce a secondary axis in host embryos. Development. 116, 347-3345 (1992).
  12. Godsave, S. F., Slack, J. M. Single cell analysis of mesoderm formation in the Xenopus embryo. Development. 111, 523-530 (1991).
  13. Hainski, A. M., Moody, S. A. An activin-like signal activates a dorsal-specifying RNA between the 8- and 16-cell stages of Xenopus. Dev. Genetics. 19, 210-221 (1996).
  14. Pandur, P. D., Moody, S. A. Multiple maternal influences on dorsal-ventral fate of Xenopus animal blastomeres. Dev. Dyn. 225, 581-587 (2002).
  15. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
  16. Sullivan, S. A., Akers, L., Moody, S. A. foxD5a, a Xenopus winged helix gene, maintains an immature neural ectoderm via transcriptional repression that is dependent upon the C-terminal domain. Dev. Biol. 232, 439-457 (2001).
  17. Yan, B., Neilson, K. M., Moody, S. A. FoxD5 plays a critical upstream role in regulating neural fate and onset of differentiation. Dev. Biol. 329, 80-95 (2009).
  18. Vincent, J. -P., Gerhart, J. C. Subcortical rotation in Xenopus eggs: an early step in embryonic axis specification. Dev. Biol. 123, 526-539 (1987).
  19. Peng, H. B. Appendix A: Solutions and Protocols. Methods in Cell Biology. 36, 657-662 (1991).
  20. Klein, S. L. The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos. Dev. Biol. 120, 299-304 (1987).
  21. Masho, R. Close correlation between the first cleavage plane and the body axis in early Xenopus embryos. Dev. Growth Diff. 32, 57-64 (1990).
Бластомеров эксплантов для тестирования для сотовых приверженности судьбы во время эмбрионального развития
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Grant, P. A., Herold, M. B., Moody, S. A. Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development. J. Vis. Exp. (71), e4458, doi:10.3791/4458 (2013).More

Grant, P. A., Herold, M. B., Moody, S. A. Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development. J. Vis. Exp. (71), e4458, doi:10.3791/4458 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter