Summary
टर्मिनल neuromuscular जंक्शनों (NMJs) में श्वान कोशिकाओं (एससी), जैसे घनी पैक ऊतकों में व्यक्ति की कोशिकाओं Visualizing चुनौती दे रहा है. Triangularis sterni मांसपेशी explant, एक सुविधाजनक तंत्रिका पेशी तैयारी, जहां विरंजन अनुक्रमिक समय चूक इमेजिंग के साथ जोड़ा जा सकता है उदाहरण के लिए एक टर्मिनल में अनुसूचित जाति, delineating "अनुक्रमिक फोटो विरंजन" की अनुमति देता है और
Protocol
1. Triangularis Sterni Explant (1 चित्रा)
समय: 15 मिनट.
- संदंश की 2 जोड़े, कैंची की एक जोड़ी, वसंत कैंची की एक जोड़ी, 1 टिशू कल्चर पकवान (10 सेमी): सर्जिकल उपकरणों तैयार. पूर्व bubbled (कम से कम 15 मिनट के लिए) ठंडा (4 ° C) 5% सीओ 2/95% 2 हे के साथ घंटी समाधान. बर्फ के साथ 15 सेमी ऊतक संस्कृति डिश भरें और यह धातु की थाली के साथ कवर. विच्छेदन खुर्दबीन तैयार है और बर्फ के साथ क्रम में विच्छेदन के दौरान explant शांत विच्छेदन दायरे के तहत 15 सेमी पकवान जगह.
- Lethally isoflurane मात्रा (या बलिदान के किसी भी अन्य अनुमोदित विधि) द्वारा माउस anesthetize. स्प्रे करने के लिए explant के फर प्रदूषण को रोकने के लिए 70% इथेनॉल के साथ माउस. विरंजन अनुसूचित जाति के लिए, हम PLP GFP चूहों, जो अक्षतंतु के साथ - साथ दृश्य के लिए Thy1 - OFP3 या Thy1 Membow13 को पार किया जा सकता है इस्तेमाल किया.
- बड़ी कैंची की जोड़ी का उपयोग की एक midline चीराउरोस्थि और रिब पिंजरे के निचले किनारे करने के लिए दो समानांतर चीरों पर त्वचा.
- बड़ी कैंची की जोड़ी का उपयोग त्वचा को हटाने, पेट की दीवार खुला, और चीरों रिब पिंजरे के लिए सभी तरह से समानांतर कशेरुका स्तंभ वापस. फिर उरोस्थि में पेशी प्रविष्टि करीब चीरों करके कवच की मांसपेशियों को काटना.
- असिरूप उपास्थि नीचे खुला डायाफ्राम काटें और बंद अपने तटीय सम्मिलन साथ डायाफ्राम काटना.
- असिरूप प्रक्रिया संदंश का एक सेट के साथ होल्डिंग रिब पिंजरे, कशेरुका स्तंभ बंद पसलियों काटने के रूप में उनके सम्मिलन के लिए संभव के रूप में बंद के रूप में शुरू करते हैं. बाएँ और दाएँ कटौती manubrium sterni की ओर दिल से ऊपर एकाग्र करना चाहिए. प्रमुख रक्त वाहिकाओं (विशेष रूप से अवजत्रुकी नसों) में कटौती से बचने की कोशिश करें. बेहतर दृश्यता धीरे तैयारी उठाने जबकि संदंश के साथ असिरूप प्रक्रिया पर पकड़े द्वारा हासिल की है.
- सिर्फ manubrium sterni नीचे एक अनुप्रस्थ काटऔर 10 सेमी पकवान में कूल्ड 5% सीओ 2/95% ओ 2-bubbled घंटी समाधान के साथ explant हस्तांतरण. धातु प्लेट 15 सेमी ऊतक संस्कृति बर्फ से भरा पकवान को कवर पर 10 सेमी पकवान रखें. सभी कदम आगे विच्छेदन खुर्दबीन के तहत किया जाना चाहिए.
- छोटे वसंत कैंची का उपयोग थाइमस, फुस्फुस का आवरण, डायाफ्राम (अंदर) और कवच की मांसपेशियों के अवशेष हटाने के लिए (बाहर, 1B-D चित्रा).
- पकवान 3.5 सेमी explant फिट, बंद सभी पसलियों कि उरोस्थि सम्मिलित नहीं काटना. यह सबसे अच्छा छोटे वसंत कैंची का उपयोग किया जाता है और पसलियों (चित्रा 1E) के बीच में ऊतक में कटौती.
- Sylgard लेपित ऊतक 3.5 सेमी संस्कृति पकवान minutien पिंस, चित्रा 1G <4 मिमी (छोटा) का उपयोग करने में triangularis sterni explant तंत्रिका पेशी पिन. दो पिनों उरोस्थि के कार्टिलेजीनस भागों (सफेद) के माध्यम से जाना चाहिए. वें के बाएँ और दाएँ पक्ष पर दोनों पसलियों के माध्यम से कम से कम दो पिन सम्मिलित करेंई explant नरम कार्टिलेजीनस भागों के लिए लक्ष्य और तहत पसलियों से बचने है या triangularis की मांसपेशियों को करीब. और पिन का इस्तेमाल कर रहे हैं, बेहतर है (हम आम तौर पर 8-10 का उपयोग करें). जैसा कि आप नीचे तैयारी पिन, सुनिश्चित करें कि पसलियों को कुछ हद तक फैले हुए हैं, एक थोड़ा बढ़ाकर स्थिति में पेशी फिक्सिंग.
- वैकल्पिक: Alexa रंजक (0.8 छ / मिलीलीटर के 5% सीओ 2/95% ओ 2-bubbled घंटी समाधान में एकाग्रता) मिलकर bungarotoxin जोड़कर synaptic acetylcholine रिसेप्टर्स युक्त साइटों कल्पना. Sylgard लेपित पकवान में 15-20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर टिकी explant सेते हैं तो 5% सीओ 2/95% ओ 2-bubbled घंटी समाधान के साथ कई बार धोने.
2. विरंजन अनुसूचित जातियों और वैकल्पिक माइक्रोस्कोपी समय चूक (2 चित्रा)
समय: 30 - 45 मिनट + 1 वैकल्पिक - समय व्यतीत हो जाने के लिए 5 घंटा.
- एक confocal खुर्दबीन सुसज्जित बुद्धि 3.5 सेमी पकवान Sylgard लेपित स्थानांतरणएक argon (488 एनएम तरंगदैर्ध्य) लेजर और पानी विसर्जन उद्देश्यों (20x, 0.5 एनए और 100x, 1.0 NA या 60x, 0.9 NA 4x, 0.13 एनए) ज.
- समय चूक माइक्रोस्कोपी के लिए वैकल्पिक: 3.5 सेमी पकवान Sylgard लेपित हीटिंग अंगूठी में सम्मिलित करें, superfusion प्रणाली और तापमान जांच (2A चित्रा) स्थापित करें. सुनिश्चित करें कि उनमें से कोई भी explant, डिश या Sylgard कोटिंग के रिम स्पर्श. 33-35 के लिए नमूना गर्मी डिग्री सेल्सियस SC समय व्यतीत हो जाने के बिना विरंजन, कमरे के तापमान बेहतर है, क्योंकि कोशिकाओं विरंजन चरणों के बीच कम गतिशीलता दिखा.
- साथ एक 4x हवा उद्देश्य innervation triangularis sterni मांसपेशी के पैटर्न का पालन और triangularis sterni endplate बैंड मिल. 20x उद्देश्य की सूई कोन स्विच और endplate बैंड (क्षेत्रों overlying पसलियों अच्छा उम्मीदवार हैं) के भीतर सतही क्षेत्रों के लिए तलाश शुरू करते हैं. 100x या 60x उद्देश्य की सूई कोन उद्देश्य बदलें व्यक्तिगत NMJs पर जांच के. आदर्श एक NMJ है कि कई अनुसूचित जातियों द्वारा कवर किया जाता है और बहुत superfic स्थित हैially (चित्रा 2B). यदि आप विरंजन के बाद समय चूक इमेजिंग प्रदर्शन, 3 NMJs कि अपेक्षाकृत एक साथ बंद कर रहे हैं पैदावार बढ़ाने के लिए चयन करें.
- फोटो विरंजन व्यक्ति अनुसूचित जातियों (चित्रा 2B) के पहले NMJ की एक confocal छवि मोल. (पूर्ण संकल्प इमेजिंग, एक ओलिंप FV1000 माइक्रोस्कोप उदा के लिए, एक 100x, 1.0 NA उद्देश्य और 2.5 ज़ूम, पिक्सेल प्रति 0.1 सुक्ष्ममापी के नमूने Nyquist सीमित में जो परिणाम का उपयोग करें.)
- एक अनुसूचित जाति के नाभिक 5 सेकंड (वैकल्पिक रूप से ब्याज की एक छोटे से क्षेत्र में एक कुशल स्कैन पैटर्न "बवंडर एक ओलिंप खुर्दबीन पर स्कैन" समारोह के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, के लिए अधिक से अधिक शक्ति का उपयोग करते हुए केन्द्र पर 488 एनएम लेजर बीम "पार्क"; के रूप में हम एक confocal खुर्दबीन का उपयोग करें, लेजर छवि संयुग्म विमानों में ध्यान केंद्रित है और इसलिए, 488 एनएम पर 1.0 एनए के एक उद्देश्य के साथ, <व्यास में 0.5 सुक्ष्ममापी). सेल और न्यायाधीश विरंजन परिणाम पर फिर से ध्यान केंद्रित. यदि आवश्यक कदम GFP के स्तर तक फिर से दोहराने विरंजन कर रहे हैं कमघ के पास पृष्ठभूमि के स्तर. विरंजन (चित्रा 2C) के बाद एक छवि मोल. यह लगता है कि प्रक्षालित क्षेत्र दो कोशिकाओं के बीच किसी भी ओवरलैप के बाहर है के लिए महत्वपूर्ण है - अगर वहाँ ओवरलैप है, एक दूसरे सेल में विरंजन स्पष्ट हो जाएगा.
- लेकिन सभी एक SC (चित्रा 2 डी ई) प्रक्षालित कर रहे हैं जब तक ऊपर कदम दोहराएँ. पिछले "सख़्त" अनुसूचित जाति confocal माइक्रोस्कोपी समय व्यतीत हो जाने के लिए उपयुक्त है. छवियों के घटाव एकल कक्षों को फिर से संगठित करने के लिए, उदाहरण के लिए फ़ोटोशॉप सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, एकल SC morphology और क्षेत्र (चित्रा 2 एफ) को सीमांकित. ध्यान रखें कि दो mages subtracting शोर (जैसे उन्हें फ़ोटोशॉप में लगातार "परत" में आयात और फिर ड्रॉप डाउन मेनू में "अंतर" चैनलों टैब के शीर्ष पर शीर्ष चैनल की स्थापना) कहते हैं. यह घटाव से पहले चैनलों पर 'डेस्पेकल "समारोह का उपयोग करते हुए और दूर किसी भी पृष्ठभूमि है कि स्पष्ट रूप से आरंभ नही होता फसल circumvented किया जा सकता हैप्रक्षालित सेल. अनुकूलित के विपरीत, यह "स्तर" खिड़की में दो चैनलों की चमक को समायोजित करने के लिए आवश्यक हो सकता है. प्रक्षालित सेल के परिणामस्वरूप छवि एक synapse के मूल छवि, एक अद्वितीय रंग में छद्म रंग पर आरोपित और पारदर्शी बनाया प्रक्षालित सेल के क्षेत्र में मूल छवि में रंग (सभी प्रक्षालित के लिए ऐसा करने से और पिछले , रूखा कोशिकाओं चित्रा 2F परिणाम में दिखाया छवि).
- वैकल्पिक: सभी लेकिन एक अनुसूचित जातियों विरंजन के बाद प्रारंभ confocal माइक्रोस्कोपी समय चूक. निश्चित अंतराल (उदाहरण के लिए हर 5 से 10 मिनट) पर एक छवि ले लो. जितना संभव हो कम लेसर शक्ति के रूप में प्रयोग करें. अप करने के लिए 3 NMJs एक ही सत्र में imaged किया जा सकता है.
- 100x ज़ूम के बिना एक छवि ले, तो इस क्षेत्र की छवियों 20x और 4x उद्देश्यों (2G-मैं चित्रा) द्वारा समय व्यपगत NMJs के एक नक्शा बनाओ. यह "नक्शा" एक निश्चित मांसपेशी की immunohistochemistry के बाद NMJs खोजने की जरूरत है.
- छवि के लिएप्रसंस्करण, अधिकतम तीव्रता अनुमानों में अलग - अलग छवियों को बदलने और झगड़ा प्रारूप में बचाने के लिए. एक ढेर में सभी z-अनुमानित समय अंक गठबंधन और xy में पंक्ति, जैसे फिजी में "stackreg" प्लगइन 10 (एक पैकेज खुला स्रोत सॉफ्टवेयर ImageJ पर आधारित है, स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान) का उपयोग करते हुए.
3. फिक्सेशन और immunohistochemistry (3 चित्रा)
समय: रात भर.
- 50 मिलीलीटर की एक प्रतिक्रिया ध्यान से पिन को हटाने से कम से कम 15 मिलीलीटर 4% पीएफए युक्त ट्यूब में explant स्थानांतरण. पूर्वकाल वक्ष बर्फ पर 1 घंटा के लिए triangularis sterni मांसपेशी युक्त दीवार पोस्ट तय. पीबीएस में 0.1 एम ग्लाइसिन (अवशिष्ट लगानेवाला बुझा लेते हैं और इसलिए पृष्ठभूमि को कम करने के लिए) के साथ कम से कम 10 मिनट के लिए निर्धारित ऊतक कुल्ला. नमूने इस बिंदु पर संग्रहीत किया जा सकता है और बाद में संसाधित.
- एक 10 सेमी Sylgard लेपित टिशू कल्चर 0.01 एम पीबीएस के साथ भरा पकवान निश्चित explant स्थानांतरण. बाहर एक सी के साथ एक trapezoid आकार में कटौतीउरोस्थि और हड्डी उपास्थि संक्रमण के माध्यम से अन्य समानांतर इस इसकी सतह पर triangularis पेशी शामिल हैं. एक क्षैतिज (यानी पार sternal) इतनी कटौती है कि triangularis मांसपेशी की दुम का अंत स्वतंत्र रूप से पहुँचा जा सकता है के साथ कम पसलियों निकालें (चित्रा 3A डी).
- Trapezoid (3E चित्रा) के ऊपरी भाग में एक पिन के रूप में एक चमड़े के नीचे सुई डालें. 1 मिलीलीटर सिरिंज और संदंश संलग्न करने के लिए सतह पर धीरे मांसपेशी की एक लांगुलिय कोने पर पकड़े और एक माइक्रो स्केलपेल के रूप में सुई का उपयोग द्वारा triangularis मांसपेशी को हटाने के एक चमड़े के नीचे सुई का प्रयोग करें. यकीन है कि कटौती समानांतर वक्ष दीवार के विमान बना रहे हैं. एक बार मांसपेशी की दुम का हिस्सा जारी है लिए, वक्ष की दीवार के माध्यम से पेशी के नीचे एक पिन के रूप में एक और चमड़े के नीचे सुई डालने इस तैयारी immobilizes और संदंश (3F चित्रा) का उपयोग करते हुए पेशी पर एक सौम्य खींच exerting की अनुमति देता है. जैसा कि आप संयोजी tiss में कटौती कर रहे हैंue सम्मिलन "छील" छाती से मांसपेशियों. काटें वसंत कैंची साथ पिछले दुम का लगाव. वसा और रक्त वाहिका संदंश का उपयोग कर अवशेष निकालें. रहते हैं और निश्चित ऊतक के साथ काम करने के लिए उपकरण और बर्तन के अलग सेट का उपयोग करें:. चीर नहीं दूर नसों नोट सावधान रहो.
- Immunohistochemistry (एक मानक प्रोटोकॉल का उपयोग) अवरुद्ध समाधान में ऊतकों के नमूनों को एक प्रकार के बरतन पर 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर स्थानांतरित द्वारा शुरू करो. छोटी धुंधला के लिए संभव मात्रा 200 μl एक 96 अच्छी तरह से थाली का उपयोग है.
- प्राथमिक अवरुद्ध समाधान है, अच्छी तरह से प्रति 200 μl, 4 में रातोंरात ° सी के एक प्रकार के बरतन में पतला एंटीबॉडी लागू.
- 10 मिनट के लिए 0.01 एम पीबीएस तीन बार में धो लें.
- उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी लागू 1-2 घंटा के लिए कमरे के तापमान पर अवरुद्ध समाधान में पतला.
- 10 मिनट के लिए 0.01 एम पीबीएस तीन बार में धो लें.
- विरोधी लुप्त होती (जैसे Vectashield) मध्यम और coverslip में माउंट.
- चुंबकीय धातु की थाली पर प्लेस स्लाइड, शीर्ष पर जगह चुंबक4 डिग्री सेल्सियस पर कुछ घंटे या रात भर के लिए समतल नमूना नेल पॉलिश के साथ सील.
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Representative Results
एक triangularis sterni explant इमेजिंग पकवान के लिए तैयार की एक उदाहरण 1G चित्र में दिखाया गया है. यह explant इमेजिंग NMJs पूर्व vivo के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है रूप में triangularis मांसपेशी मांसपेशी फाइबर की कुछ परतों के ही होते हैं. यह ट्रांसजेनिक माउस लाइनों से व्युत्पन्न explants से उच्च संकल्प छवियों को प्राप्त करने की अनुमति देता है कि को उजागर या तो अनुसूचित जाति अनुसूचित (2 PLP GFP) और / या axons (1 Thy1-XFP). उच्च गुणवत्ता इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण कारकों में शामिल हैं: (i) explant मांसपेशी फाइबर चोट को रोकने की तैयारी दौरान triangularis मांसपेशी को छू परहेज, (ii) सतही और फ्लैट synapses का चयन करने के लिए गहराई से जुड़े aberrations को कम करने के लिए, (iii) नहीं overheating नमूना (37> °) सी और नमूना रखते हुए अच्छी तरह से oxygenated, (iv) बहाव या कंपन को कम करने के लिए इमेजिंग के दौरान संभावित superfusion को रोकने के, (v) ध्यान superfusion टयूबिंग और तापमान जांच रखने के लिए नमूना छूने से बचें, साथ ही कश्मीरबहाव को रोकने के शुष्क पकवान के नीचे eeping, (vi) बंद लक्ष्य अनुसूचित जातियों में "जमानत" संकेत हानि से बचने के लिए इसके विपरीत अधिकतम के साथ विरंजन व्यापक संतुलन. हिल स्नायु और अक्षतंतु विखंडन अक्सर घटना मनाया जाता है, अगर explant क्षतिग्रस्त है और अस्वस्थ है. Confocal ढेर के blurry अनुमानों में तैयारी परिणामों की अस्थिरता. हालांकि, एक बार वर्णित अनुक्रमिक तस्वीर विरंजन तकनीक को अच्छी तरह से काम करता है, यह काफी विस्तार (चित्रा 2 एफ) में एक टर्मिनल अनुसूचित जाति की आकारिकी का पता चलता है. एकल टर्मिनल अनुसूचित जातियों की पता चला आकारिकी काफी आश्चर्य की बात हो और विरंजन से पहले आसानी से नहीं की भविष्यवाणी कर सकते हैं. इसके अलावा, NMJ भीतर अनुसूचित जाति गतिशीलता की डिग्री एकल कक्षों लेबलिंग के बिना नहीं खोला जा सकता है.
माइक्रोस्कोपी के बाद रहते हैं, triangularis sterni explant और तय किया जा सकता है हित के किसी भी मार्कर (3 चित्रा) के लिए दाग. इस के लिए रहते हैं, imaged कोशिकाओं को वापस पता लगाया जा सकता है, नक्शा बनाने की प्रक्रिया का उपयोगपहले टेड (2G-मैं चित्रा) और निर्धारित ऊतकों में उच्च संकल्प पर स्कैन. Immunohistochemistry के लिए आम तौर पर मानक तरीकों का इस्तेमाल किया जा सकता है - यहाँ एक चेतावनी तथ्य यह है कि एंटीबॉडी प्रवेश काफी myelinated axons में सीमित किया जा सकता है और बहुत लंबे समय के एंटीबॉडी ऊष्मायन बार की आवश्यकता है. फिर, सतही NMJs चुनने के और निश्चित ही मांसपेशी (बंद नसों तेजस्वी बिना) से वसा अवशेषों को हटाने के लिए इस चूक से बचने के लिए मदद मिलती है.
चित्रा 1. Triangularis sterni explant तैयारी (ए) triangularis explant तंत्रिका पेशी को तैयार करने के लिए यह पूरा माउस के पूर्वकाल वक्ष दीवार (रेखाचित्र के रूप में एक चूहे पर आरोपित) काटना आवश्यक है. (बी) के विच्छेदन के बाद सिर्फ पूर्वकाल वक्ष दीवार. (
/ s/ftp_upload/4460/4460fig3.jpg ">
चित्रा 3. निश्चित triangularis sterni मांसपेशी और निश्चित NMJ की छवि के विच्छेदन. (ए) फिक्स्ड सेल संस्कृति डिश में पीबीएस में triangularis sterni explant Sylgard के साथ लेपित. (बी) में कटौती वसंत कैंची साथ प्रदर्शन लिए triangularis sterni मांसपेशी को अलग. (ईजी) explant triangularis sterni मांसपेशी युक्त टुकड़ा की लगाए और सतह से मांसपेशी को हटाने. चित्रा 2 में ली गई बहुत NMJ कि (एच, आई) फिक्स्ड दृश्य. 647 Alexa (लाल) मिलकर bungarotoxin साथ acetylcholine रिसेप्टर्स के लिए और एक विरोधी synaptophysin प्रतिरक्षी (सफेद) के साथ synaptic vesicles के लिए धुंधला हो जाना. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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Discussion
विरंजन SC यहाँ प्रस्तुत पद्धति सरल, तेज और बहुमुखी है: (i) यह confocal माइक्रोस्कोपी एक एकल transgene पर आधारित द्वारा एक SC morphology और गतिशीलता का खुलासा सक्षम बनाता है जो एक महत्वपूर्ण लाभ है जब रोग मॉडल है कि अतिरिक्त alleles की आवश्यकता के साथ दृष्टिकोण जैसे संयोजन . (Ii) विधि तेजी से है, के रूप में विच्छेदन से निर्धारण करने के लिए आधे से एक दिन में किया जा सकता है. (Iii) आवेदनों की संख्या में व्यापक है, के रूप में यह सेल ablations, इमेजिंग organelles, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी या immunohistochemistry के रूप में अन्य विधियों, के साथ जोड़ा जा सकता है. इसके अतिरिक्त, murine NMJs में अनुसूचित जातियों के लिए यहाँ प्रस्तुत दृष्टिकोण अन्य कोशिकाओं, ऊतकों या प्रजातियों के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है - zebrafish में एक संबंधित तकनीक की एक आवेदन के एक उदाहरण 6 संदर्भ में प्रस्तुत किया है. इसके अलावा GFP अलावा अन्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन विरंजन और समय चूक माइक्रोस्कोपी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है YFP या CFP उदाहरण के लिए,. जब तक हम इन फ्लोरोसेंट प्रोटीन में अनुसूचित जाति, bleachi में इस्तेमाल नहीं किया हैaxons की एनजी से पता चलता है कि एक कम स्थिर इस सेटिंग में फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे CFP) के लिए फायदेमंद हो सकता है. हालांकि, विरंजन कुशल और स्थिर इमेजिंग के बीच एक समझौता करने के लिए, वांछित परिणाम (जैसे एकल बनाम शेष संयुक्त राष्ट्र प्रक्षालित कोशिकाओं के समय चूक छवि) के आधार पर पाया जा सकता है.
तकनीक के लिए सीमाओं की एक संख्या हैं, लेकिन. एक एक explanted (और इसलिए axotomized) मांसपेशी, जो इमेजिंग अवधि सीमा के उपयोग से संबंधित है. हम पिछले अध्ययनों में पाया है कि अध्ययन के तहत सवाल पर निर्भर करता है - triangularis sterni explant 3-6 घंटे की एक अधिकतम के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अभी भी, अनुक्रमिक तस्वीर विरंजन vivo में इस्तेमाल किया जा सकता है, इस सीमा पर काबू पाने प्रदान नमूना पर्याप्त छवियों घटाया जा सकता है कि प्राप्त करने के लिए स्थिर कर सकते हैं. आगे के दो पहलुओं को ध्यान में रखा जाना, जब अनुक्रमिक विरंजन दृष्टिकोण से उत्पन्न डेटा का विश्लेषण की जरूरत है: (i) phototoxicity कश्मीर के रूप में अनुसूचित जाति गतिशीलता को बदल सकता हैअपने पड़ोसियों के 11 के तेजी से विस्तार में एक टर्मिनल SC परिणाम illing. तो दिखावट की जाँच शामिल किया जाना चाहिए, उदाहरण के लिए एक स्थिर synapse में विस्तार और retractions की राशि को मापने. औसत पर, imaged अनुसूचित जातियों की जनसंख्या काफी या विकसित नहीं हटना चाहिए. (Ii) की आकारिकी लेकिन पिछले SC छवि घटाव द्वारा प्राप्त की है. एक ऐसी छवि की गुणवत्ता प्राप्त विरंजन विपरीत पर निर्भर करता है. यह आम तौर पर उज्जवल माउस लाइनों में आसान हासिल की. उदाहरण के लिए, पीएलपी GFP S100 - GFP 12 की तुलना में बेहतर काम करता है. छवि घटाव शोर कहते हैं तो, पिछले अनुसूचित जातियों आम तौर पर दूसरों की तुलना में और अधिक विस्तार में पता चला है (विशेष रूप से भी, बाद अस्थायी इमेजिंग के रूप में उच्च संख्यात्मक एपर्चर तेल उद्देश्यों का उपयोग करने की अनुमति देता है) के बाद निर्धारण. इसलिए, एक morphological सुविधा केवल वास्तविक रूप में स्वीकार किया जाना चाहिए, अगर यह "पिछले" अनुसूचित जाति, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रक्षालित लोगों में दिखाई देता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए Manuela Budak, Ljiljana Marinkovi और क्रिस्टीना Wullimann धन्यवाद करने के लिए करना चाहते हैं. हम PLP-GFP चूहों को प्रदान करने के लिए डब्ल्यू मैकलिन धन्यवाद. अलेक्जेंडर वॉन हम्बोल्ट फाउंडेशन द्वारा, और राष्ट्रीय धन एजेंसी ("Bundesministerium für Bildung und Forschung", टीएम इंस्टिट्यूट ऑफ एडवांस्ड स्ट्डीज़ (Technische Universität München), ड्यूश Forschungsgemeinschaft (Sonderforschungsbereich 596 SFB DFG) द्वारा समर्थित है ) युग - नेट न्यूरॉन "iPSoALS" और "2-photon इमेजिंग" के फ्रेम में. टीएम और एमबी एकीकृत प्रोटीन विज्ञान (म्यूनिख) के लिए केंद्र द्वारा समर्थित हैं. PM Technische Universität München (तुम जी एस) के ग्रेजुएट स्कूल के द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% (vol/vol) ethanol solution | Roth | T913.1 | in spray bottle |
| isoflurane | Forene, Abbott | any other approved anaesthetic can be used for lethal anaesthesia | |
| transgenic mice (Plp-GFP) | to be obtained from cited sources | ||
| dissection microscope with cold-light illumination | Olympus SZ51 | equipped with Schott KL 1500 LCD | |
| forceps #2 | Fine Science Tools | 11233-20 | |
| forceps #5 | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| scissors, large medical | Fine Science Tools | 14108-09 | |
| scissors, small angled spring | Fine Science Tools | 15033-09 | |
| in-line heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| heating ring for 3.5-cm dishes | Warner Instruments | 64-0110 DH-35 | |
| two channel temperature control system | Warner Instruments | TC-344B | |
| superfusion pump system | custom-built | ||
| 15-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1803.003 | filled with ice and covered by metal plate |
| 10-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1802.003 | with oxygenated Ringer's solution |
| 3.5-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1800.003 | filled with Sylgard polymer |
| Sylgard polymer | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | |
| confocal microscope | Olympus | FV1000 | with argon laser |
| 50-ml reaction tube | Sarstedt | 62.547.254 PP | |
| 4% PFA in PBS | Sigma | P6148 | |
| cannula 0.5 mm x 25 mm | Neolab | E-1510 | |
| syringe 1 ml | Neolab | E-1496 | |
| synaptophysin antibody | Invitrogen | 18-0130 | rabbit |
| secondary antibody | Invitrogen | A-11012 | Alexa 594 |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.1836 | |
| 0.01 M PBS | Sigma | P4417 | |
| 0.1 M glycine in PBS | Roth | 3790.1 | |
| coverslips | Neolab | E-4132 | |
| slides | Neolab | E-4121 | |
| Vectashield | Vector labs | H-1000 | |
| minutien pins ×10 | Fine Science Tools | 26002-20 | shortened to < 4 mm |
| α-Bungarotoxin coupled to Alexa 594 | Invitrogen (Molecular Probes) | B-13423 | |
| Blocking Solution | |||
| 0.01 M PBS | |||
| 0.2% Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
| 10% Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| 1% bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| Ringer bubbled with 95% O2 /5% CO2 |
|||
| 125 mM NaCl | Sigma | S7653 | |
| 2.5 mM KCl | Sigma | P9333 | |
| 1.25 mM NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| 26 mM NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| 2 mM CaCl2 | Sigma | 21114 | |
| 1 mM MgCl2 | Sigma | 63020 | |
| 20 mM glucose | Sigma | G7528 | |
Table 1. Specific reagents and equipments. |
|||
References
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development. J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).
- Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions. The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Thompson, W. J., et al. Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells. Society for Neuroscience. Program 241, (2008).
- Williams, P. R., et al. In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact. J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).
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