Summary
Visualisering enkeltceller i tettpakkede vev, for eksempel terminal Schwann celler (SC) på nevromuskulær veikryss (NMJs), er utfordrende. "Sequential foto-bleking" lar opptegning enkelt terminal sentre, for eksempel i triangularis Sterni muskel eksplantering, en praktisk nerve-muskel forberedelse, hvor sekvensiell bleking kan kombineres med time-lapse bildebehandling og
Abstract
Sekvensiell foto-bleking gir en ikke-invasiv måte å merke individuelle sentre på NMJ. Den NMJ er den største synapse av pattedyr nervesystemet og har fungert som retningsgivende modell for å studere synaptiske struktur og funksjon. I mus NMJs motor axon terminaler danne pretzel-lignende kontakt nettsteder med muskelfibre. Motoren axon og terminal er omsluttet av sentre. I løpet av de siste tiårene har flere transgene mus er generert å visualisere motor nevroner og SCS, for eksempel Thy1-XFP 1 og PLP-GFP mus 2.
Langs motoriske axoner, er myelinating aksonal sentre arrangert i ikke-overlappende internodes, adskilt av noder av Ranvier, for å muliggjøre saltatory aksjonspotensial forplantning. I kontrast, terminal sentre på synapse er spesialiserte gliacellene, som overvåker og fremme nevrotransmisjon, fordøye rusk og guide regenererende axons. NMJs er tett dekket med opptil et halvt dusin non-myelinating terminal sentre - disse, men kan ikke individuelt løses ved lysmikroskopi, som de er i direkte membran kontakt 3.
Flere tilnærminger eksisterer for å individuelt visualisere terminal sentre. Ingen av disse er feilfri, skjønt. For eksempel krever fargestoff fylling, der enkeltceller er spiddet med et fargestoff fylt microelectrode, ødelegge en merket celle før du fyller en ny en. Dette er ikke forenlig med påfølgende time-lapse opptak 3. Multispektrale "Brainbow" merking av sentre har blitt oppnådd ved hjelp kombinatorisk ekspresjon av fluorescerende proteiner 4. Imidlertid krever denne teknikk kombinere flere transgener og er begrenset av uttrykket mønster av promotorer som brukes. I fremtiden kan uttrykk for "photo-valgbar" proteiner i sentre være enda en alternativ 5. Her presenterer vi sekvensiell foto-bleking, der enkeltceller er bleket, og deres image oppnådd ved subtraksjon. Vi trorat denne tilnærmingen - på grunn av sin letthet og allsidighet - representerer en varig tillegg til neuroscientist teknologi palett, særlig ettersom det kan brukes in vivo og overført til andre celletyper, anatomiske steder eller arter 6.
I det følgende protokoll, detalj vi anvendelsen av sekvensiell bleking og påfølgende confocal time-lapse mikroskopi til terminal SC i triangularis Sterni muskel explants. Denne tynne, overfladisk og lett dissekerte nerve-muskel forberedelse 7,8 har vist seg nyttig for studier av NMJ utvikling, fysiologi og patologi 9. Til slutt forklarer vi hvordan triangularis Sterni muskelen er utarbeidet etter fiksering å utføre korrelert med høy oppløsning confocal avbildning, immunhistokjemi eller ultrastructural undersøkelser.
Protocol
1. Triangularis Sterni Eksplantasjon (figur 1)
Timing: 15 min.
- Forbered kirurgiske instrumenter: 2 par tang, en saks, 1 par av våren saks, en vev kultur parabolen (10-cm). Pre-boblet (minimum i 15 min) avkjølt (4 ° C) Ringers løsning med 5% CO 2/95% O 2. Fyll 15-cm vevskultur tallerken med is og dekke den med metallplate. Forbered disseksjon mikroskop og plasser 15-cm tallerken med isen under disseksjonen omfang i For å kjøle eksplantasjon under disseksjonen.
- Lethally anesthetize musen ved isofluran overdose (eventuelt annen godkjent metode for offer). Spray musen med 70% etanol for å hindre kontaminasjon av pels eksplantasjon. For SC bleking, brukte vi PLP-GFP mus, som kan passeres til Thy1-OFP3 eller Thy1-Membow13 for samtidig visualisering av axon.
- Bruke par store saks, lage en midtlinjesnitt avhuden over sternum og to snitt parallelle til den nedre kanten av brystkassen.
- Bruke par store saks, fjerne huden, åpner bukveggen, og gjøre incisions parallelt med brystkassen hele veien tilbake til ryggraden. Deretter dissekere av pectoral muskler ved å gjøre incisions nær muskel innsetting på brystbenet.
- Kutt membranen åpen rett under xiphoid brusk og dissekere av mellomgulvet langs kyst innsettinger.
- Holder brystkassen ved xiphoid prosessen med et sett av tang, start å kutte ribbeina av virvelsøylen, så nært som mulig til sine innsettinger. Venstre og høyre kutt bør møtes over hjertet mot manubrium Sterni. Prøv å unngå å kutte store blodkar (spesielt subclavia årer). Bedre synlighet oppnås ved å forsiktig løfte utarbeidelse mens du holder på xiphoid prosessen med tang.
- Gjør en tverrgående kutt like under manubrium Sterniog overfør eksplantasjon inn 10-cm tallerken med avkjølte 5% CO 2/95% O 2-bobles Ringers oppløsning. Plasser 10-cm parabolen på metallplaten som dekker 15-cm vevskultur parabolen fylt med is. All videre skritt bør gjøres under disseksjon mikroskop.
- Ved hjelp av små våren saks fjerne restene av thymus, pleura, diafragma (innsiden) og pectoral muskler (utenfor; figur 1B-D).
- Hvis du vil tilpasse eksplantering til 3,5-cm parabol, dissekere av alle ribbeina som ikke setter til sternum. Dette gjøres best ved hjelp av små våren saks og klippe vevet mellom ribbeina (figur 1E).
- Pin triangularis Sterni nerve-muskel eksplantering i Sylgard belagt 3,5-cm vevskultur tallerken med minutien pins (forkortet til <4 mm, Figur 1G). To pinner bør gå gjennom cartilaginous (hvit) deler av sternum. Sett minst to pinner gjennom ribbeina både på venstre og høyre side av the eksplantering sikter til de mykere cartilaginous deler og unngå ribbeina under eller nær triangularis muskel. Jo flere velges, jo bedre (vi bruker vanligvis 8-10). Som du pin ned forberedelse, sørg for at ribbeina er litt spredt, fikse muskel i en litt strukket posisjon.
- Valgfritt: Visualiser synaptiske nettsteder som inneholder acetylcholin reseptorene ved å legge bungarotoxin koblet til Alexa fargestoffer (konsentrasjon på 0,8 mikrogram / ml i 5% CO 2/95% O 2-boblet Ringers oppløsning). Inkuber pinned eksplantasjon i Sylgard belagt parabolen for 15-20 min ved romtemperatur og deretter vaske flere ganger med 5% CO 2/95% O 2-boblet Ringers oppløsning.
2. Bleking sentre og tilleggsutstyr Time-lapse Mikroskopi (figur 2)
Timing: 30 - 45 min + valgfri 1-5 hr for tidsinnstilte.
- Transfer 3,5-cm Sylgard-belagt parabolen til en confocal mikroskop utstyrt viddh en argon laser (488 nm bølgelengde) og nedsenking i vann mål (4x, 0,13 NA, 20x, 0,5 NA og 100x, 1,0 NA eller 60x, 0,9 NA).
- Valgfritt for time-lapse mikroskopi: Sett 3,5-cm Sylgard-belagt tallerken til varme ring, installere superfusjons system og temperatur probe (figur 2A). Sørg for at ingen av dem berører eksplantering, kanten av parabolen eller Sylgard belegg. Oppvarme prøven til 33-35 ° C. For SC bleking uten time-lapse, er romtemperatur bedre, som celler viser mindre dynamikk mellom bleking trinn.
- Med en 4x luft mål observere innervation mønster av triangularis Sterni muskel og finne triangularis Sterni gavl band. Bytt til 20x dyppe-membran objektiv og begynne å lete etter overfladiske regioner i gavl band (områder overliggende ribbeina er gode kandidater). Endre mål å 100x eller 60x dyppe-membran mål å se på enkelte NMJs. Ideal er en NMJ som er dekket av flere sentre og ligger svært superficially (figur 2B). Hvis du utfører time-lapse bildebehandling etter bleking, velge opptil 3 NMJs som er relativt tett sammen for å øke utbyttet.
- Skaff et konfokal bilde av NMJ før foto-bleking individuelle SCS (figur 2B). (For full oppløsning, for eksempel på en Olympus FV1000 mikroskop, bruk en 100x, 1,0 NA objektiv og 2,5 zoom, noe som resulterer i Nyquist-limited prøvetaking av ~ 0,1 mikrometer per piksel.)
- "Parkere" 488 nm laserstrålen sentralt på kjernen av en SC med maksimale strøm i 5 sekunder (alternativt en effektiv skanning mønster i et lite område av interesse kan anvendes, slik som den "tornado scan"-funksjonen på en Olympus mikroskop; som vi bruker en confocal mikroskop, laser fokusert inn i bilde-konjugerte fly og dermed ved 488 nm med et mål på 1,0 NA, <0,5 mikrometer i diameter). Re-fokus på cellen og dommeren bleking resultat. Om nødvendig gjenta bleketrinnet igjen før GFP nivåer er å redusered til nær-bakgrunnsnivå. Tak i et bilde etter bleking (Figur 2C). Det er viktig å sørge for at den blekede regionen er utenfor noen overlapping mellom to celler - hvis det er overlapping, vil blekingen i en annen celle være åpenbar.
- Gjenta trinn ovenfor til alle bortsett fra én SC er bleket (figur 2D-E). Den siste "ubleket" SC er egnet for confocal time-lapse mikroskopi. Rekonstruere enkeltceller ved subtraksjon av bilder, for eksempel med Photoshop programvare, for å avgrense enkelt SC morfologi og territorium (figur 2F). Vær oppmerksom på at å trekke to trollmenn legger støy (f.eks ved å importere dem i påfølgende "lag" i Photoshop, og deretter sette den øverste kanalen til "forskjell" i rullegardinmenyen øverst kanalene kategorien). Dette kan omgås ved å bruke "Støvfjernar"-funksjonen på kanalene før subtraksjon og beskjæring bort noen bakgrunn som åpenbart ikke stammer frableket celle. For å optimalisere kontrast, kan det være nødvendig å justere lysstyrken på de to kanalene i "nivåer"-vinduet. Den resulterende bildet av bleket cellen er lagt på det opprinnelige bildet av en synapse, pseudo-farget i en unik fargetone og gjort gjennomsiktig å farge territorium bleket celle i det opprinnelige bildet (fra å gjøre dette for alle bleket og den siste , ubleket celler bildet vist i Figur 2F resultater).
- Valgfritt: Start confocal time-lapse mikroskopi etter bleking alle unntatt én sentre. Ta et bilde med faste intervaller (for eksempel hver 5 til 10 min). Bruk så lite laser strøm som mulig. Opptil 3 NMJs kan avbildes på samme sesjon.
- Lage et kart av tid-frafalne NMJs ved å ta et bilde på 100x uten zoom, så bilder av regionen, basert på 20x og 4x mål (figur 2G-I). Dette "kartet" er nødvendig for å finne NMJs etter immunhistokjemi av en fast muskel.
- For bildeprosessering, konvertere enkeltbilder til maksimal intensitet anslag og lagre i tiff-format. Kombinere alle z-anslått tid-poeng i en stabel og justere i xy, f.eks ved hjelp av "stackreg" plugin 10 i Fiji (en pakke basert på åpen kildekode ImageJ, National Institutes of Health).
3. Fiksering og Immunhistokjemi (figur 3)
Timing: Overnattingstur.
- Overfør eksplantasjon til en 50-ml reaksjonsrør inneholdende minst 15 ml 4% PFA ved å forsiktig fjerne pinnene. Innlegg-fix fremre thorax veggen inneholder triangularis Sterni muskler for en time på is. Skyll fast vev med 0,1 M glycin i PBS (å slukke gjenværende fiksativ og dermed redusere bakgrunn) i minst 10 min. Prøver kan bli lagret på dette punktet og behandlet senere.
- Overføre fast eksplantasjon til en 10-cm Sylgard belagt vevskultur parabolen fylt med 0,01 M PBS. Skjær ut en trapes form med en side parallelt til sternum og den andre gjennom benet til brusk overganger - dette inneholder triangularis muskel på overflaten. Fjern lavere ribber med en horisontal (dvs. trans-sternal) kappet slik at caudale enden av triangularis muskel kan fritt nås (figur 3A-D).
- Sett en kanyle som en tapp i den øvre del av trapesens (figur 3E). Bruk en kanyle festet til en 1 ml sprøyte og pinsett for å fjerne triangularis muskel på overflaten ved forsiktig å holde på en caudal hjørne av muskelen og med nålen som en mikro-skalpell. Kontroller at kuttene er gjort parallelt med planet av thorax veggen. Når Caudal delen av muskelen er utgitt, sette inn en annen kanyle som en pin under muskelen gjennom thorax veggen - dette immobilizes forberedelse og lar utøve en mild trekke på muskel bruker tang (figur 3F). Som du kutte connective tissue innsettinger, "skrelle" bort muskel fra thorax. Skjær siste caudal vedlegg med våren saks. Fjern fett og blod fartøy restene med pinsett. Vær forsiktig så du ikke å rive bort nervene. Merk: Bruk separate sett av verktøy og retter for å arbeide med levende og fast vev.
- Begynn immunhistokjemi (ved hjelp av en standard protokoll) ved å overføre vevsprøver i sperrende løsning for 1 hr på en ristemaskin ved romtemperatur. Minste mulige volum for farging er 200 ul med en 96-brønns plate.
- Påfør primære antistoff fortynnet i blokkering løsning, 200 ul per brønn, over natten ved 4 ° C på en ristemaskin.
- Vask i 0,01 M PBS tre ganger i 10 min.
- Påfør egnet sekundært antistoff for 1-2 timer ved romtemperatur fortynnet i blokkering løsning.
- Vask i 0,01 M PBS tre ganger i 10 min.
- Montere i anti-fading medium (f.eks Vectashield) og dekkglass.
- Sted lysbilde på magnetisk metall plate, sted magnet på toppenav prøven å flate for et par timer eller over natten ved 4 ° C. Forsegle med neglelakk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et eksempel på en triangularis Sterni eksplantasjon klar for avbildning parabolen er vist i figur 1G. Dette eksplantering er spesielt egnet for bildebehandling NMJs ex vivo som triangularis muskel består kun av noen få lag med muskelfibre. Dette tillater å oppnå høy oppløsning fra eksplanter avledet fra transgene mus linjer som uthever enten sentre (PLP-GFP 2) og / eller (axoner Thy1-XFP 1). Kritiske faktorer for høy bildekvalitet omfatter: (i) å unngå å berøre triangularis muskel under eksplantasjon forberedelse unngå muskelfiber skade, (ii) å velge overfladiske og flat synapser å redusere dybden-assosierte aberrasjoner, (iii) ikke overoppheting prøven (> 37 ° C) og holde prøven godt oksygenert, (iv) potensielt stoppe superfusjons under avbildning for å redusere drift eller vibrasjon, (v) nøye plassere superfusjons tubing og temperaturfølere for å unngå å berøre prøven, samt keeping undersiden av parabolen tørr å hindre avdrift, (vi) å balansere omfattende bleking med unngå "sikkerhet" signaltap i off-target sentre å maksimere kontrasten. Muskelrykninger og axon fragmentering er ofte observert fenomener, hvis eksplantering er skadet og usunn. Ustabilitet tilberedning resulterer i uklare projeksjoner av confocal stabler. Imidlertid, når den beskrevne sekvensielle bilder-bleking teknikken fungerer godt, avslører det morfologi enkelt terminal SC i betydelig detalj (figur 2F). Den avslørte morfologi av single terminal sentre kan være ganske overraskende og er ikke lett spådd før bleking. Videre kan graden av SC motilitet innenfor NMJ ikke oppgis uten merking enkeltceller.
Etter levende mikroskopi kan triangularis Sterni eksplantasjon fastsettes og farget for enhver markør av interesse (Figur 3). For dette, lever sistnevnte tok bilder celler kan spores tilbake ved hjelp av kartet created forhånd (figur 2G-I) og skannes med høy oppløsning i den faste vev. Generelt standardmetoder for immunhistokjemi kan brukes - en påminnelse her er det faktum at antistoffet penetrasjon kan være ganske begrenset i myelinerte axoner og krever svært lange antistoff inkubasjonstider. Igjen, velge overfladiske NMJs og fjerne fett rester fra den faste muskel godt (uten ripping av nerver) bidrar til å unngå denne fallgruven.
Figur 1. Triangularis Sterni eksplantering forberedelse. (A) For å forberede triangularis nerve-muskel eksplantering det er nødvendig å dissekere den komplette fremre thorax vegg av musen (skjematisk lagt på en mus). (B) Anterior thorax veggen like etter disseksjon. (
s/ftp_upload/4460/4460fig3.jpg "/>
Figur 3. Disseksjon av den faste triangularis Sterni muskel og bilde av fast NMJ. (A) fast triangularis Sterni eksplantering i PBS i cellekultur tallerken belagt med Sylgard. (BD) Kutter utført med våren saks til å isolere triangularis Sterni muskel. (EG) Feste av eksplantering stykke som inneholder triangularis Sterni muskler og fjerne muskel fra overflaten. (H, I) Fast visning av svært NMJ som ble avbildet i Figur 2. Flekker for acetylcholin reseptorene med bungarotoxin koblet til Alexa 647 (rød) og for synaptiske vesikler med en anti-synaptophysin antistoff (hvit). Klikk her for å se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SC bleking metoden som presenteres her er enkel, rask og allsidig: (i) Det gjør avslørende enkelt SC morfologi og dynamikk ved konfokalmikroskopi basert på en enkelt transgene - som er en betydelig fordel når du kombinerer tilnærming for eksempel med sykdom modeller som krever ekstra alleler . (Ii) Fremgangsmåten er hurtig, som fra disseksjon til fiksering det kan utføres i en halv dag. (Iii) antall søknader er bred, så det kan kombineres med andre metoder, for eksempel celle ablations, bildebehandling organeller, elektrofysiologiske eller immunhistokjemi. Tillegg kan tilnærming presentert her for sentre ved murine NMJs generaliseres til andre celler, vev eller arter - et eksempel på en anvendelse av en beslektet teknikk i sebrafisk er presentert i referanse 6. Også andre fluorescerende proteiner foruten GFP kan brukes for bleking og tid forfalle mikroskopi, for eksempel YFP eller CFP. Mens vi ikke har brukt disse selvlysende proteiner i sentre, bleaching av axoner viser at en mindre stabil fluorescerende protein (f.eks CFP) i denne innstillingen kan være en fordel. Imidlertid har et kompromiss mellom effektiv bleking og stabil avbildning å bli funnet, avhengig av de ønskede resultater (f.eks enkeltbilde vs tid-bortfall av de gjenværende ikke-bleket celler).
Det finnes en rekke begrensninger i teknikken, men. Man angår anvendelse av en eksplantert (og dermed axotomized) muskel, noe som begrenser bildebehandling perioden. I tidligere studier har vi funnet ut at - avhengig av spørsmålet under studien - den triangularis Sterni eksplantering kan brukes til maksimalt 3-6 hr. Likevel kan sekvensiell foto-bleking benyttes in vivo, overvinne denne begrensningen tilgjengelig prøven kan tilstrekkelig stabilisert for å oppnå bilder som kan trekkes fra. Ytterligere to aspekter som må holdes i bakhodet når analysere data som følge av den sekvensielle bleking tilnærming: (i) Fototoksisitet kan endre SC dynamikk, som kIlling en terminal SC resultater i rask utvidelse av sin naboer 11. Så plausibilitet kontroller bør inkluderes, f.eks måle summen av utvidelser og retractions i en stabil synapse. I gjennomsnitt bør befolkningen for bildebehandlet sentre ikke signifikant vokse eller krympe. (Ii) morfologi av alle unntatt den siste SC oppnås etter bilde subtraksjon. Kvaliteten av et slikt bilde avhenger innhentet bleking kontrasten. Dette er vanligvis oppnås lettere lysere mus linjer. For eksempel, fungerer PLP-GFP bedre enn S100-GFP 12. Bilde subtraksjon legger støy, så de siste sentre er generelt avdekket nærmere enn de andre (spesielt også, som post-hoc bildebehandling etter fiksering kan bruke høy numerisk apertur olje mål). Derfor bør en morfologisk funksjonen bare aksepteres som ekte, hvis den er synlig i "siste" sentre, samt i bleket seg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Manuela Budak, Ljiljana Marinkovi og Kristina Wullimann for utmerket teknisk assistanse. Vi takker W. Macklin for å gi PLP-GFP mus. TM er støttet av Institute of Advanced Studies (Technische Universität München), ved Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Sonderforschungsbereich SFB 596), ved Alexander-von-Humboldt-stiftelsen og ved nasjonale midler byrået ("Bundesministerium für Bildung und Forschung" ) i rammen av ERA-Net Neuron "iPSoALS" og "2-foton bildebehandling". TM og MB støttes av Center for Integrated Protein Science (München). PM ble støttet av Graduate School of Technische Universität München (TUM-GS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% (vol/vol) ethanol solution | Roth | T913.1 | in spray bottle |
| isoflurane | Forene, Abbott | any other approved anaesthetic can be used for lethal anaesthesia | |
| transgenic mice (Plp-GFP) | to be obtained from cited sources | ||
| dissection microscope with cold-light illumination | Olympus SZ51 | equipped with Schott KL 1500 LCD | |
| forceps #2 | Fine Science Tools | 11233-20 | |
| forceps #5 | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| scissors, large medical | Fine Science Tools | 14108-09 | |
| scissors, small angled spring | Fine Science Tools | 15033-09 | |
| in-line heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| heating ring for 3.5-cm dishes | Warner Instruments | 64-0110 DH-35 | |
| two channel temperature control system | Warner Instruments | TC-344B | |
| superfusion pump system | custom-built | ||
| 15-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1803.003 | filled with ice and covered by metal plate |
| 10-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1802.003 | with oxygenated Ringer's solution |
| 3.5-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1800.003 | filled with Sylgard polymer |
| Sylgard polymer | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | |
| confocal microscope | Olympus | FV1000 | with argon laser |
| 50-ml reaction tube | Sarstedt | 62.547.254 PP | |
| 4% PFA in PBS | Sigma | P6148 | |
| cannula 0.5 mm x 25 mm | Neolab | E-1510 | |
| syringe 1 ml | Neolab | E-1496 | |
| synaptophysin antibody | Invitrogen | 18-0130 | rabbit |
| secondary antibody | Invitrogen | A-11012 | Alexa 594 |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.1836 | |
| 0.01 M PBS | Sigma | P4417 | |
| 0.1 M glycine in PBS | Roth | 3790.1 | |
| coverslips | Neolab | E-4132 | |
| slides | Neolab | E-4121 | |
| Vectashield | Vector labs | H-1000 | |
| minutien pins ×10 | Fine Science Tools | 26002-20 | shortened to < 4 mm |
| α-Bungarotoxin coupled to Alexa 594 | Invitrogen (Molecular Probes) | B-13423 | |
| Blocking Solution | |||
| 0.01 M PBS | |||
| 0.2% Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
| 10% Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| 1% bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| Ringer bubbled with 95% O2 /5% CO2 |
|||
| 125 mM NaCl | Sigma | S7653 | |
| 2.5 mM KCl | Sigma | P9333 | |
| 1.25 mM NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| 26 mM NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| 2 mM CaCl2 | Sigma | 21114 | |
| 1 mM MgCl2 | Sigma | 63020 | |
| 20 mM glucose | Sigma | G7528 | |
Table 1. Specific reagents and equipments. |
|||
References
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development. J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).
- Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions. The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Thompson, W. J., et al. Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells. Society for Neuroscience. Program 241, (2008).
- Williams, P. R., et al. In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact. J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).
- Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants. Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).
- McArdle, J. J., et al. Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena. J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).
- Marinkovi, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).
- Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions. The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).
- Zuo, Y., et al. Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination. J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).
