Summary
تصور الخلايا الفردية في أنسجة كثيفة معبأة، مثل خلايا شوان محطة (SCS) عند التقاطعات العصبي العضلي (NMJs)، يمثل تحديا. "متتابع الصورة تبيض" يسمح ترسيم الطوائف المنبوذة محطة واحدة، على سبيل المثال في يزدرع المثلثية العضلات القص، مريحة للأعصاب العضلات إعداد، حيث يمكن الجمع بين متتابعة تبيض مع الوقت الفاصل بين التصوير و
Abstract
متتابعة الصورة تبيض يوفر طريقة غير الغازية لتسمية اللجان الدائمة الفردية في NMJ. وNMJ هي أكبر المشبك الجهاز العصبي في الثدييات وكانت بمثابة توجيه نموذج لدراسة بنية ووظيفة متشابك. في NMJs محطات الماوس محور عصبي السيارات على شكل مواقع الاتصال المملح مع مثل ألياف العضلات. ومغلفة محور عصبي السيارات ومحطة من قبل اللجان الدائمة. على مدى العقود الماضية، وقد ولدت الفئران المعدلة وراثيا لتصور العديد من الخلايا العصبية الحركية والطوائف المنبوذة، على سبيل المثال Thy1-1 و XFP حزب العمال التقدمي-GFP الفئران 2، على التوالي.
على طول محاور عصبية المحرك، يتم ترتيب الطوائف المنبوذة في محور عصبي myelinating السلاميات غير متداخلة، مفصولة العقد من رانفييه، لتمكين قفزي نشر إمكانات العمل. في المقابل، محطة الطوائف المنبوذة في المشبك هي خلايا الدبقية المتخصصة، والتي رصد وتعزيز العصبي، وهضم الحطام محاور عصبية دليل تجديد. وتغطي بإحكام NMJs بنسبة تصل إلى نصف دزينة غير myelinating الطوائف المنبوذة محطة - هذه، ولكن، لا يمكن أن تحل بشكل فردي عن طريق المجهر الضوئي، كما هي على اتصال مباشر الغشاء 3.
توجد عدة أساليب لتصور فردي الطوائف المنبوذة المحطة الطرفية. أي من هذه لا تشوبه شائبة، وإن كان. على سبيل المثال، صبغ شغل، حيث مخوزق الخلايا واحدة ذات صبغة مسرى مكروي مملوءة، يتطلب تدمير خلية العلامات قبل ملء ثانية واحدة. هذا غير متوافق مع مرور الزمن التسجيلات اللاحقة 3. وقد تحقق متعددة الأطياف "Brainbow" توسيم الطوائف المنبوذة باستخدام التعبير اندماجي من البروتينات الفلورية 4. ومع ذلك، هذه التقنية يتطلب الجمع بين عدة جينات منقولة وتحد من نمط التعبير من المروجين المستخدمة. في المستقبل، قد التعبير عن البروتينات "للتحويل الصور" في الطوائف المنبوذة تكون بعد آخر 5 بديلة. هنا نقدم الصورة تبيض متتابعة، حيث يتم تبييض الخلايا واحدة، وصورتهم التي حصلت عليها الطرح. نعتقدأن هذا النهج - نظرا لسهولة وبراعة - يمثل إضافة دائم لوحة تكنولوجيا الأعصاب، وخاصة أنها يمكن أن تستخدم في الجسم الحي ونقل إلى أنواع الخلايا الأخرى، والمواقع التشريحية أو الأنواع 6.
في البروتوكول التالية، ونحن من التفصيل تطبيق متتابعة تبيض واللاحقة الوقت الفاصل بين المجهري متحد البؤر لمحطة الطوائف المنبوذة في المثلثية إإكسبلنتس العضلات القص. وقد ثبت هذا رقيقة، وتشريح سطحي بسهولة العصبي العضلي إعداد دراسات مفيدة ل7،8 التنمية NMJ، علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض 9. وأخيرا، فإننا شرح كيفية إعداد العضلات القص بعد تثبيت المثلثية لأداء عالية الدقة ترتبط مبائر التصوير، أو الامتحانات التركيبية المناعية.
Protocol
1. المثلثية القص يزدرع (الشكل 1)
التوقيت: 15 دقيقة.
- إعداد الأدوات الجراحية: 2 أزواج من ملقط، 1 زوج من مقص، 1 زوج من مقص الربيع، 1 صحن زراعة الأنسجة (10 سم). فقاعات مسبقا (حد أدنى لمدة 15 دقيقة) تبريد (4 ° C) حل رينغر مع 5٪ CO 2/95٪ O 2. ملء طبق 15-سم زراعة الأنسجة مع الثلج وتغطية ذلك مع لوحة معدنية. إعداد المجهر تشريح ووضع طبق 15-سم مع الجليد ضمن نطاق تشريح من أجل تبريد يزدرع خلال تشريح.
- قاتل تخدير الماوس عن طريق جرعة زائدة isoflurane (أو أي وسيلة أخرى يوافق التضحية). رش الفأر مع الايثانول 70٪ لمنع التلوث من الفراء يزدرع. لتبيض SC، استخدمنا حزب العمال التقدمي-GFP الفئران، والتي يمكن أن عبرت OFP3-Thy1 أو Thy1 Membow13 مقابل التصور في وقت واحد من محور عصبي.
- باستخدام زوج من مقص كبير، وجعل شق خط الوسط منالجلد فوق القص واثنين من شقوق موازية للالحافة السفلية من القفص الصدري.
- باستخدام زوج من مقص كبير، وإزالة الجلد، وفتح جدار البطن، وجعل شقوق موازية للالقفص الصدري كل في طريق العودة إلى العمود الفقري. ثم تشريح قبالة العضلات الصدرية بجعل شقوق بالقرب من الإدراج في العضلات القص.
- قطع الحجاب الحاجز مفتوح أسفل الغضروف الخنجري وتشريح قبالة الحجاب الحاجز على طول الإدراج في الساحلية.
- عقد القفص الصدري بواسطة عملية الخنجري مع مجموعة من الملقط، بدء خفض الأضلاع قبالة العمود الفقري، في أقرب وقت ممكن إلى الإدراج الخاصة بهم. وينبغي خفض اليمين واليسار فوق القلب تتلاقى نحو القص قبضة. في محاولة لتجنب قطع الأوعية الدموية الرئيسية (وخاصة الأوردة تحت الترقوة). ويتحقق من خلال رفع رؤية أفضل بلطف إعداد متمسكا عملية الخنجري بالملقط.
- جعل خفض عرضية أسفل القص قبضةونقل يزدرع في صحن 10-سم مع تبريد 5٪ CO 2/95٪ O 2-فقاعات رينغر الحل. وضع صحن 10 سم على لوحة معدنية تغطي زراعة الأنسجة 15-سم طبق مليئة الجليد. وينبغي أن يتم كل خطوات أخرى تحت المجهر تشريح.
- باستخدام مقص صغير الربيع إزالة بقايا الغدة الصعترية، غشاء الجنب، والحجاب الحاجز (في الداخل) والعضلات الصدرية (خارج؛ الشكل 1B-D).
- لتناسب يزدرع إلى الطبق 3.5 سم، تشريح من جميع الأضلاع التي لا تضاف إلى القص. من الأفضل القيام بذلك باستخدام مقص الربيع الصغيرة وقطع الأنسجة في الأضلاع بين (الشكل 1E).
- يعلقون عليه المثلثية القص العصبي العضلي في يزدرع Sylgard المغلفة 3.5 سم الأنسجة باستخدام دبابيس طبق الثقافة minutien (تقصير لمم 4 <؛ الشكل 1G). يجب أن تذهب من خلال اثنين من المسامير قطع (أبيض) الغضروفية من القص. إدراج ما لا يقل عن اثنين من المسامير من خلال أضلاعه على حد سواء على الجانب الأيسر والأيمن من اليزدرع ه تهدف لقطع ليونة الغضروفية وتجنب الأضلاع تحت أو بالقرب من العضلات المثلثية. يتم استخدام أكثر دبابيس، كان ذلك أفضل (ونحن عادة استخدام 8-10). كما كنت أحدد إعداد، تأكد من أن تنتشر إلى حد ما الأضلاع، وتحديد العضلات في موقف امتدت قليلا.
- اختياري: تصور المواقع التي تحتوي على مستقبلات أستيل متشابك عن طريق إضافة بنغاروتوكسين بالإضافة إلى الأصباغ اليكسا (تركيز 0.8 ميكروغرام / مل في 5٪ CO 2 / O 95٪ 2-فقاعات رينغر الحل). احتضان يزدرع معقود في طبق Sylgard المغلفة لل15-20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم يغسل عدة مرات مع 5٪ CO 2/95٪ O 2-فقاعات رينغر الحل.
2. تبيض الطوائف المنبوذة والاختياري الزمن الفاصل بين المجهري (الشكل 2)
توقيت: 30 - 45 دقيقة + اختياري 1-5 ساعة لمرور الوقت.
- نقل 3.5 سم Sylgard المغلفة طبق إلى الطرافة المجهر متحد البؤر مجهزةح الأرجون ليزر (488 نانومتر الطول الموجي) والأهداف الغمر بالماء (4X، 0.13 NA؛ 20X، 0.5 NA و100X، 1.0 NA أو 60X، 0.9 NA).
- اختياري لمرور الزمن المجهر: 3.5 سم إدراج Sylgard المغلفة طبق في حلقة التدفئة، نظام تثبيت superfusion وتحقيق درجة الحرارة (الشكل 2A). تأكد من أن أيا منها لا تلمس يزدرع، حافة الطبق أو طلاء Sylgard. تسخين العينة ل33-35 ° C. لتبيض SC دون مرور الزمن، درجة حرارة الغرفة هو أفضل، كما تظهر خلايا أقل ديناميكية بين الخطوات التبييض.
- مع مراعاة الهدف الهواء 4X نمط تعصيب من العضلات القص المثلثية والمثلثية تجد الفرقة endplate القص. التبديل إلى الهدف غمس المخروطية 20X والبدء في البحث عن المناطق السطحية داخل الفرقة endplate (الأضلاع المغطي المناطق المرشحة جيدة). تغيير الهدف إلى هدف غمس-100X مخروط أو 60X للاطمئنان على NMJs الفردية. هو مثالي NMJ التي تغطيها عدة الطوائف المنبوذة ويقع superfic جداially (الشكل 2B). إذا كنت تنفذ الوقت الفاصل بين التصوير بعد التبييض، وتحديد ما يصل إلى 3 NMJs التي هي قريبة نسبيا معا لزيادة الغلة.
- الحصول على صورة مبائر من قبل اللجان الدائمة NMJ الصورة تبيض الفردية (الشكل 2B). (للتصوير كامل القرار، على سبيل المثال على مجهر FV1000 أوليمبوس، استخدم 100X، الهدف NA 1.0 و التكبير 2.5، مما يؤدي إلى نايكست محدودة عينة من 0.1 ~ ميكرومتر لكل بكسل).
- "بارك" ليزر 488 نانومتر شعاع مركزيا على نواة لاستخدام القوة القصوى SC لمدة 5 ثوان (بدلا من نمط المسح كفاءة في منطقة صغيرة من الفائدة يمكن استخدامها، مثل وظيفة "المسح الضوئي تورنادو" على مجهر أوليمبوس؛ كما نستخدم المجهر متحد البؤر، ويركز الليزر في الصورة طائرات، المتقارن، وبالتالي، في 488 نانومتر مع هدف NA 1.0، <0.5 ميكرومتر في القطر). على الخلية والقاضي تبيض نتيجة إعادة التركيز. إذا كرر الخطوة الضرورية تبيض مرة أخرى حتى مستويات GFP هي الحدد لشبه خلفية المستويات. الحصول على صورة بعد التبييض (الشكل 2C). من الأهمية بمكان التأكد من أن المنطقة هي خارج المبيض أي تداخل بين خليتين - إذا كان هناك تداخل، وسوف تبيض في الخلية الثانية يكون واضحا.
- كرر الخطوة السابقة حتى جميع ولكن يتم تبييض SC 1 (الشكل 2D-E). و"غير مقصورة" مشاركة SC مناسبة للفحص المجهري متحد البؤر الوقت الفاصل بين. إعادة بناء الخلايا واحد من الطرح من الصور، على سبيل المثال باستخدام برنامج فوتوشوب، واحد لتحديد SC الصرف والأراضي (الشكل 2F). تكون على علم بأن طرح اثنين السحراء يضيف ضوضاء (مثلا عن طريق استيرادها في "طبقات" على التوالي في فوتوشوب ثم تحديد القناة لأعلى "الاختلاف" في القائمة المنسدلة في أعلى علامة التبويب قنوات). يمكن هذا التحايل باستخدام "تمويه داخلي" وظيفة على القنوات قبل الطرح والاقتصاص من أي الخلفية التي من الواضح أنها لا تنبع منابيض الخلية. لتحسين النقيض من ذلك، يمكن أن يكون من الضروري ضبط سطوع القناتين في إطار "المستويات". الصورة الناتجة من الخلية ابيض هو فرضه على الصورة الأصلية من المشبك، شبه الملونة في هوى فريدة وجعلها شفافة للون أراضي الخلية ابيض في الصورة الأصلية (من فعل هذا لجميع ابيض والأخيرة والخلايا غير مقصورة الصورة هو مبين في الشكل نتائج 2F).
- اختياري: قم بتشغيل مبائر الوقت الفاصل بين المجهري بعد التبييض لكن كل واحد الطوائف المنبوذة. تأخذ صورة في فترات زمنية محددة (على سبيل المثال كل 5 دقائق إلى 10). استخدام الليزر والطاقة أقل قدر ممكن. ولا يمكن تصوير ما يصل إلى 3 NMJs في الدورة نفسها.
- عمل خريطة للNMJs الوقت انقضى من خلال اتخاذ صورة في 100X بدون تكبير، ثم صور للمنطقة باستخدام 20X والأهداف 4X (الشكل 2G-I). هناك حاجة لذلك "خارطة" للعثور على NMJs بعد المناعية في عضلة الثابتة.
- لصورةتجهيز وتحويل الصور الفردية إلى أقصى كثافة التوقعات وحفظ بتنسيق TIFF. الجمع بين جميع Z-المتوقعة الوقت نقطة في كومة ومحاذاة في XY، على سبيل المثال باستخدام "stackreg" المساعد 10 في فيجي (حزمة استنادا إلى مصدر يماغيج البرمجيات مفتوحة؛ المعاهد الوطنية للصحة).
3. تثبيت والمناعية (الشكل 3)
التوقيت: بين عشية وضحاها.
- نقل يزدرع في أنبوب مل رد فعل 50-التي تحتوي على ما لا يقل عن 15 مل PFA 4٪ عن طريق إزالة بعناية الدبابيس. بعد إصلاح الجدار الأمامي الصدري الذي يحتوي على العضلات القص المثلثية لل1 ساعة على الجليد. شطف الأنسجة الثابتة مع جليكاين M 0.1 في PBS (لإرواء مثبت المتبقية، وبالتالي تقليل الخلفية) لا يقل عن 10 دقيقة. ويمكن تخزين العينات في هذه المرحلة ومعالجتها في وقت لاحق.
- نقل يزدرع الثابتة إلى 10 سم Sylgard المغلفة النسيج طبق ثقافة مليئة PBS M 0.01. قطع على شكل شبه منحرف واحد SIدي موازية لعظمة القص والآخر من خلال التحولات العظام إلى الغضروف - وهذا يحتوي على العضلات المثلثية على سطحه. إزالة الأضلاع أقل مع قطع (أي عبر القصية) الأفقي بحيث يمكن في نهاية الذيلية من العضلات المثلثية الوصول بحرية (الشكل 3A-D).
- اضافة الى وجود إبرة تحت الجلد ودبوس في الجزء العلوي من شبه منحرف (الشكل 3E). استخدام إبرة تحت الجلد تعلق على حقنة 1 مل وملقط لإزالة العضلات المثلثية على سطح من خلال عقد بلطف على زاوية الذيلية من العضلات وباستخدام إبرة ومشرط الصغيرة. تأكد من أن يتم إجراء تخفيضات موازية لطائرة من الجدار الصدري. مرة واحدة يتم تحرير جزء من عضلة الذيلية، إدراج آخر إبرة تحت الجلد ودبوس تحت العضلات من خلال جدار الصدر - وهذا يشل إعداد ويسمح بممارسة سحب لطيف على العضلات باستخدام ملقط (الشكل 3F). كما كنت قطع TISS الضامالإدراج UE، "قشر" بعيدا العضلات من الصدر. قطع المرفقات الذيلية مشاركة مع مقص الربيع. إزالة بقايا سفينة الدهون والدم باستخدام ملقط. يجب الحرص على عدم التمزق بعيدا الأعصاب ملاحظة: استخدام مجموعات منفصلة من الأدوات والأطباق للعمل مع الأنسجة الحية والثابتة.
- بدء المناعية (باستخدام بروتوكول قياسي) عن طريق نقل عينات الأنسجة إلى حل للحظر 1 ساعة على شاكر في درجة حرارة الغرفة. حجم أصغر ممكن لتلطيخ هو 200 ميكرولتر باستخدام لوحة 96-أيضا.
- الأجسام المضادة الأولية مخففة تطبيق في حل حجب، 200 ميكرولتر لكل بئر، بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على شاكر.
- يغسل في 0.01 M 3 مرات لمدة 10 دقيقة PBS.
- تطبيق الأجسام المضادة الثانوية لمدة 1-2 ساعة مناسبة في درجة حرارة الغرفة مخففة في عرقلة الحل.
- يغسل في 0.01 M 3 مرات لمدة 10 دقيقة PBS.
- جبل في مكافحة يتلاشى المتوسطة (مثل Vectashield) وساترة.
- الشريحة مكان على لوحة معدنية المغناطيسي، المغناطيس مكان على رأسمن العينة للشد لبضع ساعات أو بين عشية وضحاها في C. ° 4 ختم بطلاء الأظافر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد مثال على يزدرع القص المثلثية جاهزة للطبق التصوير في الشكل 1G. هذا هو مناسبة خاصة يزدرع لفيفو السابقين التصوير NMJs والعضلات المثلثة يتكون فقط من عدد قليل من طبقات من ألياف العضلات. هذا يسمح بالحصول على صور عالية الدقة من إإكسبلنتس المستمدة من خطوط الماوس المعدلة وراثيا التي تسلط الضوء إما الطوائف المنبوذة (حزب العمال التقدمي-GFP 2) و / أو محاور عصبية (Thy1-XFP 1). العوامل الحاسمة للتصوير عالية الجودة ما يلي: (ط) تجنب لمس العضلات أثناء إعداد يزدرع المثلثية لمنع إصابة العضلات الألياف، (الثاني) اختيار نقاط الاشتباك العصبي سطحية ومسطحة للحد من عمق المرتبطة الانحرافات، (الثالث) لا الانهاك العينة (> 37 ° C) والحفاظ على عينة المؤكسج جيدا، (الرابع) وقف يحتمل أن superfusion خلال التصوير للحد من الانجراف أو الاهتزاز، (V) وضع بعناية أنابيب superfusion وتحقيقات درجات الحرارة لتجنب لمس العينة، وكذلك كeeping الجانب السفلي من طبق جاف لمنع الانجراف، (السادس) موازنة شاملة تبيض مع تجنب فقدان "جانبية" إشارة في غير الهدف الطوائف المنبوذة لتعظيم التباين. وارتعاش العضلات ويلاحظ في كثير من الأحيان محور عصبي تجزئة الظواهر، في حالة تلف يزدرع وغير صحية. عدم استقرار النتائج في إعداد التوقعات ضبابية من مداخن مبائر. ومع ذلك، مرة واحدة في وصف الصورة متسلسلة تبيض تقنية يعمل بشكل جيد، فإنه يكشف عن مورفولوجية SC محطة واحدة بقدر كبير من التفصيل (الشكل 2F). يمكن للمورفولوجيا كشفت محطة واحدة من الطوائف المنبوذة يكون من المستغرب جدا وليس من السهل توقع قبل التبييض. وعلاوة على ذلك، يمكن للدرجة SC الحركة داخل NMJ لا يمكن وصفها دون كشف الخلايا واحدة.
بعد الفحص المجهري المباشر، يمكن إصلاح يزدرع القص المثلثية وملطخة لأي علامة من الفائدة (الشكل 3). لهذا، ويعيش يمكن تتبع الخلايا المصورة عودة باستخدام خريطة CREAتيد مسبقا (الشكل 2G-I) و. فحصها بدقة عالية في الأنسجة الثابتة ويمكن استخدام الطرق القياسية لعام المناعية - واحد التحذير هنا هو حقيقة أنه يمكن اختراق الأجسام المضادة محدودة للغاية في محاور عصبية مياليني ويتطلب حضانة طويلة جدا مرات الأجسام المضادة. مرة أخرى، واختيار NMJs سطحية وإزالة بقايا الدهون من العضلات الثابتة بشكل جيد (بدون تمزيق قبالة الأعصاب) يساعد على تجنب هذا المأزق.
الشكل 1. المثلثية إعداد يزدرع القص. (A) لتحضير المثلثية العصبي العضلي يزدرع من الضروري تشريح كامل الجدار الصدري الأمامي من الفأرة (تخطيطي فرضه على الماوس). (B) الجدار الصدري الأمامي بعد تشريح. (
s/ftp_upload/4460/4460fig3.jpg "/>
الشكل 3. تشريح العضلات القص المثلثية الثابتة وصورة NMJ الثابتة. (A) ثابت يزدرع القص المثلثية في برنامج تلفزيوني في صحن زراعة الخلايا المغلفة مع Sylgard. (BD) يخفض أداء مع مقص الربيع لعزل المثلثية القص العضلات. (EG) التدبيس من قطعة تحتوي على يزدرع المثلثية القص العضلات وإزالة العضلات من السطح. (H، I) عرض ثابت من NMJ جدا التي تم تصويرها في الشكل 2. لمستقبلات أستيل تلطيخ مع بنغاروتوكسين بالإضافة إلى اليكسا 647 (أحمر) وحويصلات متشابك مع لجسم مضاد ضد synaptophysin العصبية (البيضاء). اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
طريقة تبيض SC المعروضة هنا هي بسيطة وسريعة وتنوعا: (ط) إنه يمكن الكشف عن واحدة SC مورفولوجيا وديناميات بواسطة المجهر متحد البؤر بناء على التحوير واحدة - وهي ميزة كبيرة عندما الجمع بين نهج سبيل المثال مع نماذج المرض التي تتطلب الأليلات إضافية . (الثاني) والطريقة السريعة، اعتبارا من تشريح لتثبيت يمكن القيام بها في نصف يوم. (الثالث) وعدد من التطبيقات واسع، ويمكن دمجها مع وسائل أخرى، مثل ablations الخلية، العضيات التصوير، أو الكهربية المناعية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للنهج المعروضة هنا للالطوائف المنبوذة في NMJs الفئران يمكن تعميمها على الأنسجة والخلايا الأخرى أو الأنواع - يتم تقديم مثال واحد من تطبيق تقنية ذات صلة في الزرد في اشارة 6. ويمكن أيضا أن تستخدم البروتينات الفلورية أخرى إلى جانب GFP للتبييض والوقت الفاصل المجهري، على سبيل المثال YFP أو CFP. في حين أننا لم تستخدم هذه البروتينات الفلورية في الطوائف المنبوذة، bleachiنانوغرام من محاور عصبية تبين أن بروتين فلوري أقل استقرارا (مثل CFP) في هذا الإعداد يمكن أن تكون مفيدة. ومع ذلك، حلا وسطا بين التصوير كفاءة تبيض ومستقرة لابد من العثور عليها، اعتمادا على النتائج المرجوة (صورة واحدة على سبيل المثال مقابل مرور الوقت، من الخلايا المتبقية من الامم المتحدة وابيض).
هناك عدد من القيود على هذه التقنية، ولكن. واحدة تتعلق باستخدام إحدى العضلات (وبالتالي axotomized) explanted، مما يحد من فترة التصوير. في الدراسات السابقة وجدنا أن - حسب المسألة قيد الدراسة - يمكن استخدام القص يزدرع المثلثية لمدة أقصاها ساعة 3-6. ومع ذلك، يمكن استخدام الصور متتابعة تبيض في الجسم الحي، والتغلب على هذا القيد ويمكن تقديم العينة استقرت بما فيه الكفاية للحصول على الصور التي يمكن أن تطرح. مزيد من جانبين يجب أن يوضع في الاعتبار، عند تحليل البيانات الناتجة عن النهج متتابعة تبيض: (ط) يمكن أن يغير الديناميكية الضيائية SC، كما كايلينج لSC النتائج النهائية في التوسع السريع من 11 جيرانها. لذلك ينبغي أن تدرج الشيكات الاستحسان، مثل قياس مجموع التوسعات والتراجع عنها في المشبك مستقرة. في المتوسط، ينبغي أن سكان الطوائف المنبوذة المصورة لا تنمو بشكل كبير أو يتقلص. (الثاني) ويتم الحصول على مورفولوجية جميع ولكن SC الماضي الطرح الصورة. جودة الصورة مثل هذا يعتمد على النقيض من الحصول على التبييض. ويتم ذلك عادة في هذا أسهل خطوط أكثر إشراقا الماوس. على سبيل المثال، حزب العمال التقدمي-GFP يعمل بشكل أفضل من S100-GFP 12. الصورة الطرح يضيف الضوضاء، بحيث يتم كشف عموما الطوائف المنبوذة مشاركة في المزيد من التفاصيل من الآخرين (وخاصة أيضا، وخاصة في مرحلة ما بعد التصوير بعد التثبيت يسمح باستخدام الفتحة العددية العالية للنفط الأهداف). وبالتالي، ينبغي فقط ميزة الصرفي ينبغي اعتباره الحقيقي، إذا كان مرئيا في الطوائف المنبوذة "مشاركة"، وكذلك في تلك المبيض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نشكر مانويلا بوداك، Marinkovi ليليانا وWullimann كريستينا للمساعدة التقنية الممتازة. نشكر W. ماكلين لتقديم حزب العمال التقدمي-GFP الفئران. ويدعم TM من قبل معهد الدراسات المتقدمة (جامعة ميونخ التقني)، من قبل جمعية الألمانية للبحوث (DFG؛ Sonderforschungsbereich SFB 596)، من قبل الكسندر فون همبولت، ومؤسسة، وكالة التمويل الوطني ("Bundesministerium FÜR Bildung اوند Forschung" ) في إطار ERA-الصافي "iPSoALS" الخلايا العصبيه و"الفوتون التصوير 2-". ويتم دعم TM MB من قبل مركز علوم البروتين المتكامل (ميونيخ). وأيد PM بواسطة كلية الدراسات العليا للجامعة ميونخ التقني (TUM-GS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% (vol/vol) ethanol solution | Roth | T913.1 | in spray bottle |
| isoflurane | Forene, Abbott | any other approved anaesthetic can be used for lethal anaesthesia | |
| transgenic mice (Plp-GFP) | to be obtained from cited sources | ||
| dissection microscope with cold-light illumination | Olympus SZ51 | equipped with Schott KL 1500 LCD | |
| forceps #2 | Fine Science Tools | 11233-20 | |
| forceps #5 | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| scissors, large medical | Fine Science Tools | 14108-09 | |
| scissors, small angled spring | Fine Science Tools | 15033-09 | |
| in-line heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| heating ring for 3.5-cm dishes | Warner Instruments | 64-0110 DH-35 | |
| two channel temperature control system | Warner Instruments | TC-344B | |
| superfusion pump system | custom-built | ||
| 15-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1803.003 | filled with ice and covered by metal plate |
| 10-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1802.003 | with oxygenated Ringer's solution |
| 3.5-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1800.003 | filled with Sylgard polymer |
| Sylgard polymer | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | |
| confocal microscope | Olympus | FV1000 | with argon laser |
| 50-ml reaction tube | Sarstedt | 62.547.254 PP | |
| 4% PFA in PBS | Sigma | P6148 | |
| cannula 0.5 mm x 25 mm | Neolab | E-1510 | |
| syringe 1 ml | Neolab | E-1496 | |
| synaptophysin antibody | Invitrogen | 18-0130 | rabbit |
| secondary antibody | Invitrogen | A-11012 | Alexa 594 |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.1836 | |
| 0.01 M PBS | Sigma | P4417 | |
| 0.1 M glycine in PBS | Roth | 3790.1 | |
| coverslips | Neolab | E-4132 | |
| slides | Neolab | E-4121 | |
| Vectashield | Vector labs | H-1000 | |
| minutien pins ×10 | Fine Science Tools | 26002-20 | shortened to < 4 mm |
| α-Bungarotoxin coupled to Alexa 594 | Invitrogen (Molecular Probes) | B-13423 | |
| Blocking Solution | |||
| 0.01 M PBS | |||
| 0.2% Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
| 10% Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| 1% bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| Ringer bubbled with 95% O2 /5% CO2 |
|||
| 125 mM NaCl | Sigma | S7653 | |
| 2.5 mM KCl | Sigma | P9333 | |
| 1.25 mM NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| 26 mM NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| 2 mM CaCl2 | Sigma | 21114 | |
| 1 mM MgCl2 | Sigma | 63020 | |
| 20 mM glucose | Sigma | G7528 | |
Table 1. Specific reagents and equipments. |
|||
References
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development. J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).
- Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions. The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Thompson, W. J., et al. Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells. Society for Neuroscience. Program 241, (2008).
- Williams, P. R., et al. In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact. J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).
- Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants. Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).
- McArdle, J. J., et al. Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena. J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).
- Marinkovi, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).
- Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions. The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).
- Zuo, Y., et al. Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination. J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).
