Summary
Visualisation des cellules individuelles dans les tissus densément emballés, comme les cellules de Schwann terminales (SC) à jonctions neuromusculaires (JNM), est un défi. "Sequential photo-blanchiment" permet la délimitation SC seul terminal, par exemple dans le muscle explant sterni triangularis, une pratique nerf-muscle préparation, où séquentiel de blanchiment peut être combiné avec le temps écoulé et d'imagerie
Abstract
Séquentielle photo-blanchiment constitue un moyen non invasif d'étiqueter SC individuels à la jonction neuromusculaire. Le MNJ est le plus grand des synapses du système nerveux des mammifères et a servi comme directeur de modèle pour étudier la structure et la fonction synaptique. Dans souris terminaux JNM axone moteur former des sites de contact bretzel comme avec des fibres musculaires. L'axone moteur et sa borne sont gainés par SC. Au cours des dernières décennies, plusieurs souris transgéniques ont été générés pour visualiser les neurones moteurs et de SC, par exemple Thy1-XFP 1 et PLP-GFP souris 2, respectivement.
Le long des axones moteurs, myélinisantes SC axonales sont disposées en se chevauchant pas noeuds, séparés par des nœuds de Ranvier, afin de permettre la propagation saltatoire potentiel d'action. En revanche, SC terminaux à la synapse sont spécialisés cellules gliales, qui surveiller et de promouvoir la neurotransmission, digérer les débris et les guides axones. JNM sont hermétique jusqu'à une demi-douzaine non myelnaires SC terminaux - ceux-ci, cependant, ne peuvent pas être résolus individuellement par microscopie optique, car ils sont en contact direct de la membrane 3.
Plusieurs approches existent pour visualiser individuellement SC terminaux. Aucun d'entre eux sont impeccables, bien. Par exemple, le remplissage de colorant, où les cellules isolées sont empalé avec une micro-électrode de colorant remplie, nécessite détruire une cellule marqué avant de le remplir une seconde. Ce n'est pas compatible avec la suite enregistrements time-lapse 3. Multi-spectrale "Brainbow" étiquetage des castes a été réalisé en utilisant l'expression combinatoire des protéines fluorescentes 4. Cependant, cette technique nécessite la combinaison de plusieurs transgènes et est limitée par le profil d'expression des promoteurs utilisés. À l'avenir, l'expression de "photo-commutables" protéines dans SC pourrait être encore un autre 5 alternative. Ici, nous présentons photo-blanchiment séquentiel, où les cellules individuelles sont blanchis, et leur image obtenue par soustraction. Nous croyonsque cette approche - en raison de sa facilité et la polyvalence - représente un ajout à la palette de technologies durables de la neuroscientifique, en particulier car il peut être utilisé in vivo et transférés à d'autres types cellulaires, sites anatomiques ou des espèces 6.
Dans le protocole suivant, nous détaillons l'application de la séquence de blanchiment et après confocale time-lapse de microscopie à SC terminaux dans des explants musculaires triangularis manubrium. Cette fine, superficielle et facilement disséquée préparation nerf-muscle 7,8 s'est avéré utile pour les études de NMJ développement, la physiologie et la pathologie 9. Enfin, nous expliquons comment le muscle triangularis manubrium est préparé après la fixation d'effectuer une corrélation à haute résolution imagerie confocale, immunohistochimie ou examens ultrastructuraux.
Protocol
1. Triangularis Sterni explantation (Figure 1)
Timing: 15 min.
- Préparer les instruments chirurgicaux: 2 paires de pinces, 1 paire de ciseaux, 1 paire de ciseaux à ressort, 1 boîte de culture tissulaire (10 cm). Pré-bulles (minimum 15 min) refroidie (4 ° C) une solution de Ringer avec 5% de CO 2/95% O 2. Remplir 15 cm boîte de culture tissulaire avec de la glace et le couvrir avec une plaque métallique. Préparer microscope à dissection et placez le plat de 15 cm avec de la glace sous le coup de dissection afin de refroidir l'explant lors de la dissection.
- Lethally anesthésier la souris par une surdose d'isoflurane (ou toute autre méthode approuvée du sacrifice). Vaporiser la souris avec de l'éthanol à 70% pour prévenir la contamination de la fourrure de l'explant. Pour le SC de blanchiment, nous avons utilisé des souris Plp-GFP, qui peuvent être croisées pour Thy1-OFP3 ou Thy1-Membow13 pour la visualisation simultanée de l'axone.
- En utilisant la paire de grands ciseaux, faire une incision médiane dela peau de la poitrine et deux incisions parallèles à l'arête inférieure de la cage thoracique.
- En utilisant la paire de grands ciseaux, enlever la peau, ouvrir la paroi abdominale, et faire des incisions parallèles à la cage thoracique tout le chemin du retour à la colonne vertébrale. Puis hors disséquer les muscles pectoraux en faisant des incisions à proximité de l'insertion du muscle au niveau du sternum.
- Couper le diaphragme ouvert juste en dessous du cartilage xiphoïde et disséquer au large de la membrane le long de ses insertions costales.
- De maintien de la cage thoracique par la pointe du sternum avec un ensemble de pinces, de commencer à couper les nervures de la colonne vertébrale, le plus près possible de leurs insertions. Les réductions de gauche et de droite devraient converger au-dessus du cœur vers le manubrium sternal. Essayez d'éviter de couper les vaisseaux sanguins majeurs (en particulier les veines sous-clavières). Meilleure visibilité est obtenue en soulevant doucement la préparation tout en maintenant sur le processus xiphoïde avec une pince.
- Faites une coupe transversale juste au-dessous du manubrium sternalet transférer l'explant dans le plat de 10 cm avec 5% de CO refroidi 2/95% O 2-bulles solution de Ringer. Placer la capsule 10-cm sur la plaque métallique qui recouvre la cuvette 15-cm de culture de tissu rempli de glace. Toutes les autres étapes devraient se faire sous le microscope de dissection.
- Avec des ciseaux petit ressort enlever les restes du thymus, de la plèvre, membrane (à l'intérieur) et les muscles pectoraux (en dehors; figure 1B-D).
- Pour monter l'explant dans le plat de 3,5 cm, disséquer off toutes les nervures qui ne sont pas insérer au sternum. Le mieux est d'utiliser des ciseaux à ressort petites et couper le tissu entre les nervures (figure 1E).
- Epingler la triangularis sterni nerf-muscle explant dans le Sylgard enduit de 3,5 cm boîte de culture tissulaire en utilisant des épingles minuties (raccourci à <4 mm; figure 1G). Deux broches doivent passer par cartilagineux (blanc) parties du sternum. Insérer au moins deux repères à travers les nervures à la fois sur le côté gauche et droit de la ièmee explant viser les parties molles cartilagineux et en évitant les nervures sous ou à proximité du muscle triangularis. Les broches sont plus utilisés, le mieux (nous utilisons habituellement 8-10). Comme vous coincer la préparation, assurez-vous que les nervures sont peu répandue, la fixation du muscle dans une position légèrement tendus.
- En option: Visualisez les sites synaptiques contenant récepteurs de l'acétylcholine en ajoutant bungarotoxine couplé à des colorants Alexa (concentration de 0,8 pg / ml dans 5% de CO 2/95% O 2-bulles solution de Ringer). Incuber explant coincé dans Sylgard plat couché pendant 15-20 min à température ambiante puis laver plusieurs fois avec 5% de CO 2/95% O 2-bulles solution de Ringer.
2. SC blanchir et option Time-lapse de microscopie (figure 2)
Timing: 30 - 45 min + option 1 à 5 h pour le laps de temps.
- Transfert de 3,5 cm Sylgard enduit plat pour un esprit microscope confocal équipéh un laser argon (488 nm de longueur d'onde) et les objectifs à immersion à eau (4x, 0,13 NA, 20x, 0,5 NA et 100x, 1,0 NA ou 60x, 0,9 NA).
- En option pour la microscopie time-lapse: Insérer 3,5 cm Sylgard enduit plat dans l'anneau de chauffage, installer un système de surfusion et la sonde de température (figure 2A). Assurez-vous qu'aucun d'entre eux touchent l'explant, le bord de l'assiette ou le revêtement Sylgard. Chauffer l'échantillon à 33-35 ° C. Pour le SC blanchiment sans time-lapse, la température ambiante est meilleure, car les cellules afficher moins dynamique entre les étapes de blanchiment.
- Avec un objectif 4x observer air modèle innervation du muscle sterni triangularis et trouver triangularis bande flasque manubrium. Mettez à tremper 20x-cône objectif et commencer à regarder pour les régions superficielles dans la bande de flasque (côtes zones sus-jacentes sont de bons candidats). Modifier l'objectif 100x ou 60x trempage cône objectif de vérifier JNM individuels. Idéal est un NMJ qui est couvert par plusieurs SC et est situé très superficially (figure 2B). Si vous effectuez imagerie time-lapse après le blanchiment, sélectionnez jusqu'à 3 JNM qui sont relativement proches les unes pour augmenter le rendement.
- Acquérir une image confocale de la jonction neuromusculaire avant photo-blanchiment SC individuelles (figure 2B). (Pour l'imagerie haute résolution, par exemple sur un microscope Olympus FV1000, utiliser un 100x, 1,0 NA objectif zoom et 2,5, ce qui conduit à de Nyquist-échantillonnage limité de ~ 0,1 um par pixel.)
- "Park" le faisceau laser de 488 nm au centre sur le noyau d'un SC en utilisant la puissance maximale pendant 5 secondes (encore un modèle de balayage efficace dans une petite région d'intérêt peut être utilisé, tel que la "tornade scan" sur un microscope Olympus; car nous utilisons un microscope confocal, le laser est focalisé dans les plans image-conjugués et, par conséquent, à 488 nm avec un objectif de 1,0 NA, <0,5 um de diamètre). Recentrer sur la cellule et le juge de blanchiment résultat. Si nécessaire, répétez étape de blanchiment à nouveau jusqu'à ce que les niveaux de GFP sont de réduired à la quasi-fond les niveaux. Acquérir une image après le blanchiment (figure 2C). Il est essentiel de veiller à ce que la région blanchie est en dehors de tout chevauchement entre les deux cellules - s'il ya chevauchement, de blanchiment dans une deuxième cellule sera évidente.
- Répétez l'étape ci-dessus jusqu'à ce que tous sauf un sont blanchis SC (figure 2D-E). Le dernier «écrus» SC est adapté pour confocale microscopie time-lapse. Reconstruire des cellules individuelles par soustraction d'images, par exemple en utilisant le logiciel Photoshop, pour délimiter seule morphologie SC et territoire (figure 2F). Soyez conscient du fait que la soustraction de deux mages ajoute du bruit (par exemple, en les important dans consécutifs "couches" dans Photoshop, puis définir le canal supérieur à la «différence» dans le menu déroulant en haut de l'onglet canaux). Cela peut être contournée en utilisant le mode "Dépoussiérer" sur les canaux avant soustraction et de culture loin n'importe quel fond qui ne veut évidemment pas provenir de lacellule blanchie. Pour optimiser le contraste, il peut être nécessaire d'ajuster la luminosité des deux canaux dans le "niveau" fenêtre. L'image résultante de la cellule blanchie est superposée à l'image de l'original d'une synapse, pseudo-couleur dans une teinte unique et rendu transparent à la couleur sur le territoire de la cellule blanchie dans l'image d'origine (à partir de cela pendant toute la dernière blanchie et , les cellules écrus l'image affichée dans les résultats 2F Figure).
- En option: Démarrer confocale microscopie time-lapse après le blanchiment tous sauf un SC. Prendre une photo à des intervalles fixes (par exemple toutes les 5 min à 10). Utiliser en tant que puissance laser faible que possible. Jusqu'à 3 JNM peuvent être visualisés à la même session.
- Faire une carte des JNM temps expiré en prenant une image à 100x sans zoom, puis des images de la région en utilisant 20x et objectifs 4x (figure 2G-I). Cette «carte» est nécessaire pour trouver JNM après immunohistochimie d'un muscle fixe.
- Pour l'imagede traitement, de convertir des images individuelles dans les projections d'intensité maximale et enregistrer au format TIFF. Mélanger tous les z-projetées points temporels dans une pile et aligner en xy, par exemple en utilisant le "stackreg" plugin 10 en Fidji (un package basé sur le logiciel libre ImageJ, National Institutes of Health).
3. Fixation et immunohistochimie (Figure 3)
Timing: Nuit.
- Transférer l'explant dans un tube de réaction de 50 ml contenant au moins 15 ml PFA à 4% en prenant soin de retirer les broches. Post-fixer la paroi thoracique antérieure contenant le muscle triangularis sterni pendant 1 heure sur la glace. Rincer le tissu fixe avec 0,1 M de glycine dans du PBS (pour étancher fixateur résiduel et donc de réduire de fond) pendant au moins 10 min. Les échantillons peuvent être conservés à ce point et exécutée plus tard.
- Transfert explant fixe à un 10-cm Sylgard tissu enduit boîte de culture rempli de PBS 0,01 M. Découpez une forme trapézoïdale avec une siparallèlement au sternum de l'autre à travers les transitions os-cartilage - contient le muscle triangularis sur sa surface. Enlever la partie inférieure côtes avec une horizontale (trans-sternale) découpé de telle sorte que l'extrémité caudale du muscle triangularis peut être librement accessibles (figure 3A-D).
- Insérer une aiguille hypodermique comme une broche dans la partie supérieure du trapèze (figure 3E). Utilisez une aiguille hypodermique attachée à une seringue de 1 ml et une pince pour retirer le muscle triangularis sur la surface doucement en maintenant un coin caudale du muscle et en utilisant l'aiguille comme un micro-scalpel. Assurez-vous que les coupes sont faites parallèlement au plan de la paroi thoracique. Une fois la partie caudale du muscle est relâché, insérez une autre aiguille hypodermique comme une épingle en dessous du muscle à travers la paroi thoracique - ce immobilise la préparation et permet d'exercer une légère traction sur le muscle en utilisant une pince (figure 3F). Comme vous coupez tiss conjonctifinsertions ue, "peler" loin le muscle du thorax. Couper dernière pièce jointe caudale avec des ciseaux à ressort. Retirer les restes de graisse et le sang des vaisseaux à l'aide de pinces. Veillez à ne pas déchirer loin les nerfs. Remarque: Utilisez des ensembles d'outils distincts et des plats pour travailler avec des tissus vivants et fixe.
- Début immunohistochimie (en utilisant un protocole standard) en transférant des échantillons de tissu dans une solution de blocage pendant 1 heure sur un agitateur à température ambiante. Plus petit volume possible pour la coloration est de 200 ul en utilisant une plaque de 96 puits.
- Appliquer un anticorps primaire dilué dans une solution de blocage, 200 ul par puits, une nuit à 4 ° C sur un agitateur.
- Laver dans du PBS 0,01 M à trois reprises pendant 10 min.
- Appliquer une anticorps secondaire pendant 1-2 heures à la température ambiante dilué dans une solution de blocage.
- Laver dans du PBS 0,01 M à trois reprises pendant 10 min.
- Montez dans la lutte anti-fading support (par exemple Vectashield) et la lamelle.
- Placer la lame sur une plaque de métal magnétique, aimant placer sur le dessusde l'échantillon pour aplatir pendant quelques heures ou toute la nuit à 4 ° C. Sceller avec du vernis à ongles.
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Representative Results
Un exemple d'un explant triangularis sterni prêt pour l'imagerie plat est illustré à la figure 1G. Cette explant est particulièrement adapté pour l'imagerie JNM ex vivo que le muscle triangularis composée uniquement de quelques couches de fibres musculaires. Ceci permet d'obtenir des images haute définition à partir d'explants issus de lignées de souris transgéniques qui supporte clou SC (PLP-GFP 2) et / ou des axones (Thy1-XFP 1). Les facteurs critiques pour l'imagerie de haute qualité incluent: (i) en évitant de toucher le muscle triangularis lors de la préparation des explants de prévenir les blessures de la fibre musculaire, (ii) la sélection des synapses superficielles et plat pour réduire la profondeur associées à des aberrations, (iii) ne pas surchauffer l'échantillon (> 37 ° C) et en gardant l'échantillon bien oxygénée, (iv) éventuellement l'arrêt de la surfusion lors de l'imagerie pour réduire la dérive ou à des vibrations; (v) soigneusement emboîtez le tube du surfusion et sondes de température pour éviter de toucher l'échantillon, ainsi que keeping la face inférieure de la cuvette pour éviter la dérive sec, (vi) l'équilibre global de blanchiment en évitant toute perte de signal "garantie" hors cible dans SC pour optimiser le contraste. Contractions musculaires et la fragmentation des axones sont fréquemment observés phénomènes, si l'explant est endommagé et malsain. L'instabilité des résultats de préparation des projections floues de piles confocale. Cependant, une fois que le photo-blanchiment décrit séquentielle technique fonctionne bien, il révèle la morphologie du SC seul terminal en détail (figure 2F). La morphologie a révélé des SC terminaux simples peuvent être tout à fait surprenant et n'est pas facilement prévisible avant le blanchiment. En outre, le degré de mobilité du SC dans le MNJ ne peut être révélée sans le marquage de cellules individuelles.
Suite à la microscopie en temps réel, l'explant triangularis sterni peuvent être fixées et colorées pour un marqueur d'intérêt (figure 3). Pour cela, des cellules vivantes imagées peuvent être suivis en utilisant la création carteted avance (figure 2G-I) et numérisées à haute résolution dans le tissu fixe. Méthodes généralement standards pour l'immunohistochimie peut être utilisée - une mise en garde ici est le fait que la pénétration anticorps peut être assez limité dans les axones myélinisés et nécessite de très longues périodes d'incubation d'anticorps. Encore une fois, le choix JNM superficielles et éliminer les résidus de graisse dans le muscle fixe ainsi (sans arrachant les nerfs) permet d'éviter cet écueil.
Figure 1. Triangularis sterni explant préparation. (A) Pour préparer le triangularis nerf-muscle explant il est nécessaire de disséquer la paroi thoracique antérieure complète de la souris (schématiquement superposée sur une souris). (B) paroi thoracique antérieure juste après la dissection. (
s/ftp_upload/4460/4460fig3.jpg "/>
Figure 3. Dissection du muscle sterni fixe triangularis et l'image de NMJ fixe. (A) fixe explant triangularis manubrium dans du PBS boîte de culture cellulaire revêtu Sylgard. (BD) Coupe effectuée avec des ciseaux à ressort pour isoler les muscles triangularis manubrium. (EG) Brochage de la pièce explant contenant triangularis musculaire manubrium et la suppression des muscles de la surface. (H, I) vue fixe de la jonction neuromusculaire même qui a été imagé dans la figure 2. Coloration pour récepteurs de l'acétylcholine avec bungarotoxine couplé à l'Alexa 647 (rouge) et des vésicules synaptiques avec un anticorps anti-synaptophysine (blanc). Cliquez ici pour agrandir la figure .
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Discussion
La méthode de blanchiment SC présenté ici est simple, rapide et polyvalent: (i) Il permet de révéler la morphologie unique SC et la dynamique par microscopie confocale basée sur un seul transgène - ce qui est un avantage non négligeable lorsque l'on combine l'approche avec par exemple des modèles de maladies qui nécessitent des allèles supplémentaires . (Ii) Le procédé est rapide, à partir de dissection de fixation peut être effectuée en une demi-journée. (Iii) Le nombre de demandes est large, car elle peut être combinée avec d'autres méthodes, comme les ablations cellulaires, les organites imagerie, électrophysiologie ou d'immunohistochimie. En outre, l'approche présentée ici pour les SC à JNM murins peuvent être généralisés à d'autres cellules, des tissus ou des espèces - un exemple d'application d'une technique apparentée chez le poisson zèbre est présenté dans la référence 6. Également d'autres protéines fluorescentes GFP peut être en plus utilisés pour le blanchiment et le temps écoulé microscopie, par exemple YFP ou PCP. Alors que nous n'avons pas utilisé ces protéines fluorescentes dans SC, bleaching des axones montre qu'une protéine fluorescente moins stables (par exemple PCP) dans ce paramètre peut être avantageux. Cependant, un compromis entre l'imagerie blanchiment efficace et stable doit être trouvée, en fonction des résultats souhaités (par exemple, une seule image vs time-lapse des autres non-blanchie cellules).
Il ya un certain nombre de limitations à la technique, cependant. La première concerne l'utilisation d'une explantation (et donc axotomisés) du muscle, ce qui limite la période d'imagerie. Dans des études précédentes, nous avons constaté que - selon la question à l'étude - l'explant triangularis sterni peut être utilisé pour un maximum de 3-6 heures. Pourtant, séquentielle photo-blanchiment peuvent être utilisés in vivo, surmonter cette limitation a fourni l'échantillon peut être suffisamment stabilisée pour obtenir des images qui peuvent être soustraites. Deux autres aspects doivent être pris en compte, lors de l'analyse des données résultant de l'approche séquentielle de blanchiment: (i) Phototoxicité pourrait altérer le dynamisme SC, comme kIlling un résultat terminaux SC en expansion rapide de ses 11 voisins. Ainsi, des contrôles de plausibilité doit être inclus, par exemple en mesurant la somme des expansions et rétractions dans une synapse stable. En moyenne, la population de SC imagés devrait pas significativement augmenter ou diminuer. (Ii) la morphologie de tous sauf le dernier SC est obtenue par soustraction d'image. La qualité d'une telle image dépend du contraste obtenu de blanchiment. Ceci est généralement réalisé plus facile dans des lignées de souris lumineux. Par exemple, Plp-GFP fonctionne mieux que S100-GFP 12. La soustraction d'images ajoute du bruit, de sorte que les dernières SC est généralement révélée plus en détail que les autres (en particulier aussi, comme l'imagerie post-hoc après fixation permet d'utiliser l'huile objectifs numériques à haute ouverture). Par conséquent, une caractéristique morphologique ne doit être accepté comme vrai, si elle est visible dans "derniers" SC, ainsi que dans ceux blanchis.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Manuela Budak, Ljiljana Marinkovi et Kristina Wullimann d'assistance technique excellente. Nous remercions W. Macklin pour fournir Plp-GFP souris. TM est soutenu par l'Institut des hautes études (Technische Universität München), par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; Sonderforschungsbereich SFB 596), par la Alexander-von-Humboldt-Stiftung et par l'organisme national de financement («Bundesministerium für Bildung und Forschung" ) dans le cadre d'ERA-NET NEURON "iPSoALS» et «2-photons d'imagerie». MC et MB sont pris en charge par le Center for Integrated Protein Science (Munich). PM a été soutenue par la Graduate School of Technische Universität München (TUM-GS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% (vol/vol) ethanol solution | Roth | T913.1 | in spray bottle |
| isoflurane | Forene, Abbott | any other approved anaesthetic can be used for lethal anaesthesia | |
| transgenic mice (Plp-GFP) | to be obtained from cited sources | ||
| dissection microscope with cold-light illumination | Olympus SZ51 | equipped with Schott KL 1500 LCD | |
| forceps #2 | Fine Science Tools | 11233-20 | |
| forceps #5 | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| scissors, large medical | Fine Science Tools | 14108-09 | |
| scissors, small angled spring | Fine Science Tools | 15033-09 | |
| in-line heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| heating ring for 3.5-cm dishes | Warner Instruments | 64-0110 DH-35 | |
| two channel temperature control system | Warner Instruments | TC-344B | |
| superfusion pump system | custom-built | ||
| 15-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1803.003 | filled with ice and covered by metal plate |
| 10-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1802.003 | with oxygenated Ringer's solution |
| 3.5-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1800.003 | filled with Sylgard polymer |
| Sylgard polymer | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | |
| confocal microscope | Olympus | FV1000 | with argon laser |
| 50-ml reaction tube | Sarstedt | 62.547.254 PP | |
| 4% PFA in PBS | Sigma | P6148 | |
| cannula 0.5 mm x 25 mm | Neolab | E-1510 | |
| syringe 1 ml | Neolab | E-1496 | |
| synaptophysin antibody | Invitrogen | 18-0130 | rabbit |
| secondary antibody | Invitrogen | A-11012 | Alexa 594 |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.1836 | |
| 0.01 M PBS | Sigma | P4417 | |
| 0.1 M glycine in PBS | Roth | 3790.1 | |
| coverslips | Neolab | E-4132 | |
| slides | Neolab | E-4121 | |
| Vectashield | Vector labs | H-1000 | |
| minutien pins ×10 | Fine Science Tools | 26002-20 | shortened to < 4 mm |
| α-Bungarotoxin coupled to Alexa 594 | Invitrogen (Molecular Probes) | B-13423 | |
| Blocking Solution | |||
| 0.01 M PBS | |||
| 0.2% Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
| 10% Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| 1% bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| Ringer bubbled with 95% O2 /5% CO2 |
|||
| 125 mM NaCl | Sigma | S7653 | |
| 2.5 mM KCl | Sigma | P9333 | |
| 1.25 mM NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| 26 mM NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| 2 mM CaCl2 | Sigma | 21114 | |
| 1 mM MgCl2 | Sigma | 63020 | |
| 20 mM glucose | Sigma | G7528 | |
Table 1. Specific reagents and equipments. |
|||
References
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- Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development. J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).
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