Passage TINTEN menselijke embryonale stamcellijnen-lijnen met trypsine

Summary

In deze video laten we zien hoe onze lab routinematig TINTEN menselijke embryonale stamcellijnen passages met trypsine.

Abstract

In deze video laten we zien hoe onze lab routinematig TINTEN menselijke embryonale stamcellijnen passages met trypsine. Menselijke embryonale stamcellen zijn artefacten van celkweek, en hebben de neiging om karyotypic afwijkingen te verwerven met een hoge populatie verdubbelingen. De juiste passage is essentieel voor het behoud van een gezonde, ongedifferentieerde, karyotypisch normale TINTEN menselijke embryonale stamcellen cultuur. Eerste, een groeiende cultuur wordt gewassen in PBS om de resterende media en celresten te verwijderen, dan cellen bedekt met een minimaal volume van warme 0,05% trypsine-EDTA. Trypsine is links op de cellen voor maximaal vijf minuten, dan cellen voorzichtig losgemaakt met een 2 ml serological pipet. De celsuspensie wordt verzameld en gemengd met een groot volume van tinten media, dan cellen zijn verzameld door zacht centrifugeren. Het geïnactiveerde trypsine media mengsel wordt verwijderd, en cellen opnieuw gesuspendeerd in voorverwarmde TINTEN media. Een passende verdeling ratio wordt berekend (over het algemeen 1u10-01u20), en cellen opnieuw uitgeplaat op een 1-2 dagen oude plaat met een monolaag van bestraalde muis embryonale fibroblasten feeder-cellen. De nieuw geplaatste TINTEN cultuur plaat is laat men het gedurende 48 uur, dan is de media wordt elke dag daarna. Het is belangrijk om niet naar beneden trpsinize tot een enkele celsuspensie, want dit verhoogt het risico van de invoering van karyotypic afwijkingen.

Protocol

Algemeen

We raden aan het ontdooien niet meer dan een monster op een gegeven moment om eenvoudige bediening zorgen. De handler moet ervoor zorgen niet te laten culturen op kamertemperatuur en een lage CO2 voor langere tijd. Alle centrifugeren van levende cellen gebeurt op 500 tot 600 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.

MEF (muis embryonale cellen Feeder)

1. Pre-warm MEF media tot 37 ° C. Verwijder de MEF flacon van -80 ° C en onmiddellijk onder water de onderste helft van de buis in een 37 ° C waterbad. Het duurt ongeveer 30-45 seconden voordat de cellen zijn 80% ontdooid (klein links diepvries gedeelte).
2. Snel de buis te brengen om de laminaire flow kap, spray neer met 70% alcohol, en overdracht cellen voorverwarmde media.
3. Aspireren van de gelatine-oplossing van borden eerder voorbereid.
4. Aliquot 2 ml van MEF oplossing in een druppelsgewijs wijze in elk van de zes waterputten. Zorg ervoor dat u gelijkmatig te verdelen over de MEF de put. De datum waarop de MEF plaat, en plaats in een 37 ° C incubator 's nachts te laten MEFs te hechten aan bord.
5. Na 6 uur MEFs zal worden gehecht aan de plaat. Het is het beste om te gebruiken MEF platen 24-48 uur na plating. Gebruik GEEN een MEF plaat die meer dan 4 dagen oud.
6. Pre-warme tinten media en 0,05% trypsine / EDTA tot 37 ° C onder de motorkap, prelabel een steriele 50 ml conische buis.
7. Zorgvuldig aspireren de tinten media van de cultuur te worden gesplitst. Voorzichtig Was de putjes met 2 ml 1X fosfaat-gebufferde oplossing (PBS) per well. Zuig het PBS. Voeg 0,75 ml 0,05% trypsine / EDTA naar de waterput.
8. Vervanging van het deksel, en observeer de cellen onder 4x vergroting. De MEF rond de tinten koloniën moet beginnen terug te trekken. Wanneer de MEF voldoende zijn afgerond en de grenzen van de tinten kolonies zijn ruwe, terug de plaat aan de kap. Dit proces duurt ongeveer 5 minuten, absoluut niet langer dan 10 minuten of je cellen niet opnieuw groeien.
9. Voorzichtig pipet op en neer, het wassen van de bodem van de put, tot de MEF monolaag volledig vrijstaande (monolaag is kleverig en kan blijven in een stuk).
10. Breng de celsuspensie om een ​​50 ml conische buis met aanvullende TINTEN media. Spin de buis van de cellen 500xg voor 5 minuten, Aspireer uit de media, wees niet naar de cel pellet te verstoren.
11. Tot op het bord op een nieuwe plaat van MEF, voeg de juiste wijze bepaald volume van de cellen om extra TINTEN media, en pipet de oplossing 5-7 keer met een automatische pipet.
12. Verwijder de MEF media vanuit een nieuw plaat van MEFs.
13. Aliquot de tinten oplossing druppelsgewijs aan elk putje, en zorg ervoor dat de druppels gelijkmatig te verdelen over de put. Zonder het schudden van de plaat, zorgvuldig de cellen 's nachts terug te keren naar een 37 ° C incubator te TINTEN koloniën zaad te laten.
14. TINTEN cellen uit een splitsing komen moet op dezelfde manier gedragen die coming out van een dooi.

Discussion

In deze video zien we hoe we routinematig passage TINTEN menselijke embryonale stamcellijnen in ons laboratorium. Efficiënte en regelmatige splitsen en passage is essentieel voor het behoud van een gezonde menselijke embryonale stamcellen lijn. Trypsine gemedieerde passage is een belangrijk voordeel van tinten cellijnen, is het echter belangrijk om niet meer dan trypsinize culturen of om een ​​groot deel van de afzonderlijke cellen tijdens de re-platting hebben.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HuES media 651.5 ml
KO-DMEM 500 ml
PenStrep 6.5 ml
GlutaMAXTM 6.5 ml
NEAA 6.5 ml
2-mercapt–thanol 0.5ul
KO Serum Replacement 65 ml
Plasmanate 65 ml
bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml