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Biology

RIFLESSI Passaging sulle cellule staminali embrionali umane-linee con tripsina

doi: 10.3791/49 Published: October 12, 2006

Summary

In questo video ci dimostra come il nostro laboratorio passaggi di routine RIFLESSI embrionali umane linee di cellule staminali con tripsina.

Abstract

In questo video ci dimostra come il nostro laboratorio passaggi di routine RIFLESSI embrionali umane linee di cellule staminali con tripsina. Cellule staminali embrionali umane sono artefatti della coltura cellulare, e tendono ad acquisire anormalità del cariotipo con raddoppi di popolazione. Passaging è essenziale per il mantenimento di un sano, indifferenziato, tinte karyotypically umano normale coltura di cellule staminali embrionali. In primo luogo, una cultura in espansione è lavato in PBS per rimuovere il supporto residui e detriti cellulari, cellule sono poi sovrapposte con un volume minimo di caldo 0,05% tripsina-EDTA. Tripsina viene lasciato sulle cellule per un massimo di cinque minuti, poi le cellule sono staccato delicatamente con una pipetta sierologica 2 ml. La sospensione cellulare viene raccolto e mescolato con una grande quantità di mezzi toni, poi le cellule sono raccolte per centrifugazione delicata. Il inattivato tripsina miscela dei media viene rimosso e le cellule risospese in pre-riscaldato i media tonalità. Un rapporto di divisione appropriata è calcolato (generalmente 1:10-1:20), e le cellule ri-placcato su una lastra di 1-2 giorni vecchio contenente un monostrato di cellule di fibroblasti embrionali irradiato alimentatore del mouse. La nuova testa di serie cultura RIFLESSI piatto è lasciato riposare per 48 ore, allora il programma viene modificato ogni giorno dopo. E 'importante non trpsinize fino a una sospensione singola cella, in quanto ciò aumenta il rischio di introdurre anomalie del cariotipo.

Protocol

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Generale

Si consiglia di scongelamento non più di un campione in un dato momento per garantire una guida facile. Il gestore deve fare attenzione a non lasciare le culture a temperatura ambiente e di CO2 basse per lunghi periodi di tempo. Tutti centrifugazione di cellule vive è fatto a 500-600 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.

MEF (cellule embrionali di topo alimentatore)

  1. Pre-riscaldare i media MEF a 37 ° C. Rimuovere fiala MEF da -80 ° C e subito immergere la metà inferiore del tubo in un bagno d'acqua a 37 ° C. Occorrono circa 30-45 secondi prima che le cellule sono 80% scongelati (piccola porzione congelata a sinistra).
  2. Portare rapidamente il tubo alla cappa a flusso laminare, spruzzo giù con alcool al 70%, e il trasferimento di cellule pre-riscaldato media.
  3. Aspirare la soluzione di gelatina da piastre preparate in precedenza.
  4. Aliquota di 2 ml di soluzione MEF in una goccia modo sapiente in ognuno dei sei pozzi. Assicurarsi di distribuire il MEF in modo uniforme sul bene. Data la piastra MEF, e mettere in un incubatore a 37 ° C durante la notte per permettere MEF di allegare al piatto.
  5. Dopo 6 ore MEF sarà allegato alla piastra. E 'meglio usare piastre MEF 24-48 ore dopo la placcatura. NON usare una piastra MEF che è più di 4 giorni.
  6. Preriscaldare mezzi colori e 0,05% tripsina / EDTA a 37 ° C Sotto il cofano, prelabel uno sterile tubo da 50 ml.
  7. Con attenzione aspirare i media RIFLESSI dalla cultura da dividere. Lavare delicatamente i pozzetti con 2 ml di soluzione 1X tampone fosfato (PBS) per bene. Aspirare il PBS. Aggiungere 0,75 ml 0,05% tripsina / EDTA al pozzo.
  8. Rimettere il coperchio, e osservare le cellule sotto ingrandimento 4x. Il MEF che circonda le colonie RIFLESSI dovrebbe cominciare a ritrattare. Quando il MEF sono sufficientemente arrotondati ed i confini delle colonie tonalità sono grezzi, la piastra di ritorno alla cappa. Questo processo dovrebbe prendere circa 5 minuti, assolutamente non più di 10 minuti o le cellule non si ri-crescere.
  9. Pipettare delicatamente su e giù, lavare il fondo del pozzo, fino a quando il monostrato MEF ha completamente staccato (monostrato è appiccicoso e può rimanere in un unico pezzo).
  10. Trasferire la sospensione di cellule in una provetta da 50 ml conica contenente ulteriori mezzi di tonalità. Rotazione del tubo delle cellule 500xg per 5 minuti, fuori Aspirare i media, fare attenzione a non disturbare il pellet.
  11. Alla piastra su una nuova piastra di MEF, aggiungere il volume pertinente per definire delle cellule di ulteriori mezzi di sfumature, e pipetta la soluzione 5-7 volte con una pipetta automatica.
  12. Rimuovere il supporto MEF da un piatto fresco del MEF.
  13. Aliquota della soluzione RIFLESSI goccia a goccia in ciascun pozzetto, avendo cura di distribuire uniformemente le gocce per il bene. Senza agitare la piastra, con attenzione ritornare le cellule a 37 ° C in incubatore durante la notte per far RIFLESSI seme colonie.
  14. Cellule RIFLESSI uscendo da una divisa dovrebbe comportarsi in modo simile a quelle che esce da un disgelo.

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Discussion

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In questo video abbiamo dimostrato il modo in cui abitualmente RIFLESSI passaggio embrionali umane linee di cellule staminali nel nostro laboratorio. Suddivisione efficiente e regolare e passaging è essenziale per mantenere un sano embrionali umane linea di cellule staminali. Passaggio mediato tripsina è un vantaggio significativo di linee cellulari sfumature, tuttavia, è importante non trypsinize più culture o di avere un gran numero di singole cellule durante il rientro platting.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
HuES media 651.5 ml
KO-DMEM 500 ml
PenStrep 6.5 ml
GlutaMAXTM 6.5 ml
NEAA 6.5 ml
2-mercapt–thanol 0.5ul
KO Serum Replacement 65 ml
Plasmanate 65 ml
bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml

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References

  1. Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis. Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).
  2. Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).
  3. Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip. PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).
  4. Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
  5. Pierce, C. G. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).
  6. Lee, M. Y. Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).
  7. Meyerhofer, D. Characteristics of resist films produced by spinning. Journal of Applied Physics. 49, (1978).
  8. Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
  9. Chandra, J. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
  10. Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).
  11. Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases. Mycoses. 53, 208-214 (2010).
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Trish, E., Dimos, J., Eggan, K. Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.. J. Vis. Exp. (1), e49, doi:10.3791/49 (2006).More

Trish, E., Dimos, J., Eggan, K. Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.. J. Vis. Exp. (1), e49, doi:10.3791/49 (2006).

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