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Biology

MATIZ Passaging-tronco embrionárias humanas Cell-linhas com Tripsina

doi: 10.3791/49 Published: October 12, 2006

Summary

Neste vídeo mostramos como nosso laboratório rotineiramente passagens MATIZ linhas de células-tronco embrionárias com tripsina.

Abstract

Neste vídeo mostramos como nosso laboratório rotineiramente passagens MATIZ linhas de células-tronco embrionárias com tripsina. Células estaminais embrionárias humanas são artefatos da cultura celular, e tendem a adquirir anormalidades cariotípicas com duplicações populacional. Passaging adequada é essencial para manter uma alimentação saudável, indiferenciado, tons karyotypically normais embrionárias humanas de cultura de células-tronco. Primeiro, uma cultura em expansão é lavado em PBS para remover a mídia residuais e restos celulares, em seguida, as células são cobertas com um volume mínimo de 0,05% quente Tripsina-EDTA. Tripsina é deixado sobre as células por até cinco minutos, e depois as células são delicadamente desalojado com uma pipeta 2 mL sorológicos. A suspensão de células é coletada e misturada com um grande volume de mídia matizes, em seguida, as células são coletadas por centrifugação suave. A mistura de tripsina inativada mídia é removido e as células ressuspendidas em meio pré-aquecido matizes. Uma razão de separação adequada é calculada (geralmente 1:10 - 1:20), e células re-banhado em uma placa 1-2 dia de idade contendo uma monocamada de células irradiadas do mouse alimentador embrionárias fibroblastos. A placa de cultura recém-semeado matizes é deixado em repouso por 48 horas, então a mídia é trocada a cada dia depois disso. É importante não trpsinize para baixo a uma suspensão de células individuais, pois isso aumenta o risco de introdução de anormalidades cariotípicas.

Protocol

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Geral

Recomendamos descongelamento não mais do que uma amostra em um determinado momento para garantir uma fácil manipulação. O manipulador deve tomar cuidado para não deixar culturas à temperatura ambiente e baixas emissões de CO2 por longos períodos de tempo. Todos os centrifugação de células vivas é feito em 500-600 xg por 5 min à temperatura ambiente.

MEFs (células embrionárias de camundongos Feeder)

  1. Pré-aquecer media MEF a 37 ° C. Remover o frasco MEF de -80 ° C e imediatamente mergulhe a metade inferior do tubo em banho-maria a 37 ° C. Deve ter cerca de 30-45 segundos antes de as células são descongeladas 80% (porção pequena congelados esquerda).
  2. Rapidamente trazer o tubo para a capela de fluxo laminar, lavar com álcool a 70%, e de transferência de células pré-aquecido mídia.
  3. Aspirar a solução de gelatina a partir de chapas preparado anteriormente.
  4. Alíquota de 2 ml de solução de MEF em uma queda de maneira sábia em cada um dos seis poços. Certifique-se de distribuir o MEFs uniformemente sobre o bem. Data da placa MEF, e coloque em uma incubadora de 37 ° C durante a noite para permitir MEFs para anexar ao prato.
  5. Após 6 horas MEFs será anexado ao prato. É melhor usar placas MEF 24-48 horas após o plaqueamento. NÃO use uma placa MEF que tem mais de 4 dias de idade.
  6. Pré-aquecer meios tons e 0,05% Tripsina / EDTA a 37 ° C Sob o capô, prelabel um tubo estéril 50 ml.
  7. Aspirar cuidadosamente os meios de comunicação tonalidades da cultura a ser dividida. Delicadamente, lave os poços com 2ml de solução de 1X tampão fosfato (PBS) por poço. Aspirar o PBS. Adicionar 0,75 ml 0,05% Tripsina / EDTA para o bem.
  8. Substituir a tampa, e observar as células sob a ampliação de 4x. O MEFs redor das colônias MATIZ deve começar a retrair. Quando o MEFs são suficientemente arredondadas e as fronteiras das colônias tons são ásperas, devolver o prato para o capô. Este processo deve levar cerca de 5 minutos, absolutamente não mais que 10 minutos ou suas células não vai voltar a crescer.
  9. Pipeta suavemente para cima e para baixo, lavando o fundo do poço, até que a monocamada MEF foi completamente isolada (monocamada é pegajoso e podem permanecer em uma única peça).
  10. Transferir a suspensão celular a um tubo de 50 ml contendo mídia adicional matizes. Girar o tubo de células 500xg por 5 minutos, Aspirar fora da mídia, tenha cuidado para não perturbar o pellet celular.
  11. A placa em um novo prato de MEFs, adicionar o volume adequado de células para determinada mídia adicional matizes, e pipetar a solução 5-7 vezes com uma pipeta automática.
  12. Remova a mídia MEF de uma placa fresca de MEFs.
  13. Alíquota a queda solução MATIZ sábio para cada poço, certificando-se de distribuir as gotas uniformemente sobre o bem. Sem agitar o prato, cuidadosamente as células voltem ao a 37 ° C durante a noite para deixar incubadora MATIZ semente colônias.
  14. MATIZ células saindo de uma separação deve se comportar de forma semelhante aos saindo de um degelo.

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Discussion

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Neste vídeo demonstramos como nós MATIZ rotineiramente passagem humana linhas de células-tronco embrionárias em nosso laboratório. Divisão eficiente e regular e passaging é essencial para manter uma saudável linha de células estaminais embrionárias humanas. Tripsina passagem mediada é uma vantagem significativa de linhas de células MATIZ, no entanto, é importante não para mais de trypsinize culturas ou ter uma grande proporção de células isoladas durante a re-tecendo.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
HuES media 651.5 ml
KO-DMEM 500 ml
PenStrep 6.5 ml
GlutaMAXTM 6.5 ml
NEAA 6.5 ml
2-mercapt–thanol 0.5ul
KO Serum Replacement 65 ml
Plasmanate 65 ml
bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml

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References

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Trish, E., Dimos, J., Eggan, K. Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.. J. Vis. Exp. (1), e49, doi:10.3791/49 (2006).More

Trish, E., Dimos, J., Eggan, K. Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.. J. Vis. Exp. (1), e49, doi:10.3791/49 (2006).

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