Пассирования оттенков эмбриональных стволовых клеток человека линий с Трипсин

Summary

В этом видео показано, как в нашей лаборатории регулярно проходы оттенки человеческих линий эмбриональных стволовых клеток трипсином.

Abstract

В этом видео показано, как в нашей лаборатории регулярно проходы оттенки человеческих линий эмбриональных стволовых клеток трипсином. Человека эмбриональные стволовые клетки являются артефактами культуры клеток, и, как правило, приобретают кариотипические аномалии с высокой удвоений популяции. Правильное пассажей имеет важное значение для поддержания здорового, недифференцированной, karyotypically нормальные оттенки человеческих стволовых эмбриональных клеточных культур. Во-первых, расширение культуры промывают в PBS для удаления остатков средств массовой информации и сотовых мусора, то клетки с наложением минимальный объем теплого 0,05% трипсина-EDTA. Трипсин остается на клетки на срок до пяти минут, после чего клетки аккуратно выбили с 2 мл серологические пипетки. Клеточной суспензии, собирается и смешивается с большим количеством оттенков средств массовой информации, то клетки собирают нежные центрифугирования. Инактивированной трипсина СМИ смесь снять, и клетки ресуспендировали в подогретого оттенков СМИ. Соответствующем соотношении разделить рассчитывается (в основном от 1:10 до 1:20), и клетки снова высевали на 1-2 день старые пластины, содержащей монослоя облученного мышиных эмбриональных фибробластов фидерные клетки. Вновь посеянных оттенков культуры пластина не трогать в течение 48 часов, то средства массовой информации меняется каждый день после этого. Важно, чтобы не trpsinize до суспензии отдельных клеток, так как это увеличивает риск появления аномалий кариотипа.

Protocol

Общий

Мы рекомендуем оттаивания не более одного образца в данный момент времени, чтобы обеспечить удобство в обращении. Обработчик должен заботиться, чтобы не оставить культур при комнатной температуре и низкой CO2 в течение длительных периодов времени. Все центрифугирования живых клеток происходит при температуре 500-600 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.

MEFs (мышь эмбриональных клеток для подачи)

1. Предварительно теплой MEF средствах массовой информации до 37 ° C. Удалить MEF флакон от -80 ° C и сразу же погрузить нижнюю часть трубки в 37 ° С водяной бане. Это должно занять около 30-45 секунд, прежде чем клетки 80% талой (малая часть замороженных слева).
2. Быстро довести трубку ламинарном боксе, спрей вниз с 70% спиртом, и передачи клеткам подогретого СМИ.
3. Аспирируйте раствора желатина из плит подготовлено раньше.
4. Алиготе 2 мл раствора в MEF падение мудрым образом в каждый из шести скважин. Будьте уверены, чтобы распределять равномерно MEFs о хорошо. Дата пластины MEF, и места в 37 ° С инкубатор ночь, чтобы позволить MEFs приложить к пластине.
5. После 6 часов MEFs будет прикреплен к пластине. Лучше всего использовать MEF пластин через 24-48 часов после покрытия. НЕ используйте MEF пластина, которая в течение 4 дней.
6. Предварительно теплых оттенков средств массовой информации и 0,05% трипсин / ЭДТА до 37 ° C Под капотом prelabel один стерильные 50 мл коническую трубку.
7. Тщательно аспирата оттенков средств массовой информации из культура должны быть разделены. Осторожно промыть скважин с 2 мл 1X фосфатным буферным раствором (PBS) в каждую лунку. Аспирируйте PBS. Добавить 0,75 мл 0,05% трипсин / ЭДТА к колодцу.
8. Замените крышку, и наблюдать клетки под 4-кратным увеличением. MEFs окружающих оттенков колонии должны начать отказаться. Когда MEFs достаточно округлые и границ оттенков колонии грубая, возвращение пластины к капоту. Этот процесс должен занять около 5 минут, абсолютно не дольше 10 минут, или ваши клетки не будут заново расти.
9. Аккуратно пипетку вверх и вниз, стиральная дно колодца, пока монослой MEF полностью съемный (монослой является липким и могут оставаться в одной части).
10. Передача клеточной суспензии в 50 мл коническую трубку с дополнительным медиа оттенков. Спиновые трубки клеток 500xg в течение 5 минут, аспирацию от средств массовой информации, будьте осторожны, чтобы не потревожить осадок клеток.
11. Для пластины на новые пластины MEFs, добавить надлежащим определенного объема клетки дополнительных средств массовой информации оттенков, и пипетки раствор 5-7 раз с автоматизированной пипетки.
12. Удалить MEF средств массовой информации из свежих пластины MEFs.
13. Алиготе падение оттенков решение мудрым в каждую лунку, убедившись, что для распространения капель равномерно о хорошо. Без тряски плиты, осторожно вернуть клеткам 37 ° С инкубатор ночь, чтобы оттенки колонии семени.
14. Оттенки клетки выходят из разделить должны вести себя так же, тех, кто прибывает из оттепель.

Discussion

В этом видео мы продемонстрировали, как мы обычно оттенки человеческих прохождения линии эмбриональных стволовых клеток в нашей лаборатории. Эффективное и регулярное расщепление и пассажи очень важны для поддержания здоровых человеческих эмбриональных стволовых клеток. Трипсин опосредованный переход является существенным преимуществом линий оттенков клетки, однако, важно не переусердствовать trypsinize культур или иметь большую долю отдельных клеток во время повторного Платтинг.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HuES media 651.5 ml
KO-DMEM 500 ml
PenStrep 6.5 ml
GlutaMAXTM 6.5 ml
NEAA 6.5 ml
2-mercapt–thanol 0.5ul
KO Serum Replacement 65 ml
Plasmanate 65 ml
bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml