HUES pases madre de embriones humanos líneas celulares con tripsina

Summary

En este video se demuestra cómo nuestro laboratorio de rutina pasajes HUES líneas embrionarias humanas de células madre con tripsina.

Abstract

En este video se demuestra cómo nuestro laboratorio de rutina pasajes HUES líneas embrionarias humanas de células madre con tripsina. Células madre embrionarias humanas son artefactos de cultivo celular, y tienden a adquirir las anomalías del cariotipo con duplicaciones de población. Pases adecuada es esencial para el mantenimiento de una sana, las tonalidades diferenciadas, cariotipo normal de madre humanas embrionarias cultivo de células. En primer lugar, una cultura en expansión se lava con PBS para eliminar los medios de comunicación residuales y los desechos celulares, y luego las células se cubren con un volumen mínimo de agua tibia 0,05% de tripsina-EDTA. Tripsina se deja en las células durante un máximo de cinco minutos, luego las células se desprendió suavemente con una pipeta serológica 2 ml. La suspensión celular se recoge y se mezcla con una gran cantidad de medios tonos, y luego las células se recogieron por centrifugación suave. La mezcla de los medios de comunicación inactiva la tripsina se elimina, y las células se resuspendieron en pre-calentado los medios tonos. Una relación de separación adecuada se calcula (en general, 1:10-01:20), y las células re-chapada en una placa de 1-2 días de edad que contiene una monocapa de células embrionarias de ratones irradiados fibroblastos de alimentación. La placa recién sembrado HUES la cultura se deja en reposo durante 48 horas, entonces el medio se cambia todos los días a partir de entonces. Es importante no trpsinize hasta una suspensión de células individuales, ya que esto aumenta el riesgo de introducir alteraciones del cariotipo.

Protocol

General

Se recomienda descongelar no más de una muestra en un momento dado para facilitar la manipulación. El operario debe tener cuidado de no dejar a temperatura ambiente, las culturas y las bajas emisiones de CO2 durante largos períodos de tiempo. Todos los centrifugación de las células vivas se realiza a 500-600 g durante 5 min a temperatura ambiente.

MEFs (células embrionarias de ratón alimentador)

1. Pre-caliente el MEF los medios de comunicación a 37 ° C. Retire el vial MEF de -80 ° C e inmediatamente se sumerge la parte inferior del tubo en un baño de agua 37 ° C. Se debe tener unos 30-45 segundos antes de que las células son del 80% descongelado (pequeña porción de helado a la izquierda).
2. Llevar rápidamente el tubo a la campana de flujo laminar, rocíe con el 70% de alcohol, y la transferencia de células pre-calentado a los medios de comunicación.
3. Aspirar la solución de gelatina a partir de placas preparado con anterioridad.
4. Alícuota de 2 ml de solución de MEF en una caída de manera inteligente en cada uno de los seis pozos. Asegúrese de distribuir el MEFs uniformemente sobre el bien. Fecha de la placa de MEF, y colocar en una incubadora a 37 ° C durante la noche para permitir que MEFs para conectar a la placa.
5. Después de 6 horas MEFs se une a la placa. Lo mejor es utilizar placas MEF 24-48 horas después de la siembra. NO use una placa de MEF que tiene más de 4 días.
6. Pre-cálidos tonos medios y el 0,05% de tripsina / EDTA a 37 ° C Bajo el capó, prelabel un tubo estéril de 50 ml cónicos.
7. Con cuidado aspirar los medios de comunicación tonalidades de la cultura que se divide. Lave suavemente los pocillos con 2 ml de solución tampón fosfato 1X (PBS) por pocillo. Aspirar el PBS. Añadir 0,75 ml 0,05% de tripsina / EDTA al pozo.
8. Vuelva a colocar la tapa, y observar las células bajo un aumento de 4x. El MEFs alrededor de las colonias HUES debería comenzar a retraerse. Cuando el MEFs son lo suficientemente redondeadas y las fronteras de las colonias Las tonalidades son ásperas, devolver la placa a la capilla. Este proceso debe tomar alrededor de 5 minutos, absolutamente no más de 10 minutos, o sus células no volverá a crecer.
9. Pipeta suavemente hacia arriba y abajo, lavando el fondo del pozo, hasta que el MEF ha monocapa completamente separado (monocapa es pegajosa y puede permanecer en una sola pieza).
10. La transferencia de la suspensión de células a un tubo cónico de 50 ml que contienen los medios de comunicación HUES adicionales. Girar el tubo de células 500xg durante 5 minutos, se aspira de los medios de comunicación, tenga cuidado de no perturbar el sedimento celular.
11. A la placa en un nuevo plato de MEFs, agregar el volumen adecuadamente determinado de células de los medios de comunicación HUES adicionales, y la pipeta la solución 5-7 veces con una pipeta automática.
12. Retire el papel MEF a partir de una placa fresca de MEFs.
13. Alícuota de la caída de HUES solución inteligente a cada pocillo, asegurándose de que la distribución de las gotas uniformemente sobre el bien. Sin mover la placa, con cuidado retorno a las células a una incubadora a 37 ° C durante la noche para dejar la semilla HUES colonias.
14. Células HUES saliendo de una división debe comportarse de manera similar a los que salen de un deshielo.

Discussion

En este vídeo se demuestra la forma en que habitualmente HUES paso humano líneas de células madre embrionarias en nuestro laboratorio. División eficaz y regular y pases es esencial para mantener un saludable humano línea de células madre embrionarias. Paso de la tripsina mediada es una ventaja significativa de las líneas de células HUES, sin embargo, es importante no trypsinize sobre las culturas o de tener una gran proporción de células individuales durante la re-lotificación.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HuES media 651.5 ml
KO-DMEM 500 ml
PenStrep 6.5 ml
GlutaMAXTM 6.5 ml
NEAA 6.5 ml
2-mercapt–thanol 0.5ul
KO Serum Replacement 65 ml
Plasmanate 65 ml
bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml