הקפאת ES תאים אנושיים

Summary

כאן אנו מדגימים כיצד במעבדה שלנו קופא גוונים האדם עובריים קווי גזע.

Abstract

כאן אנו מדגימים כיצד במעבדה שלנו קופא גוונים האדם עובריים קווי גזע. תרבות בריאה, אקספוננציאלית הרחבת נשטף עם PBS להסיר התקשורת שיורי שיכול אחרת להרוות את התגובה טריפסין. חימם 0.05% טריפסין-EDTA הוא הוסיף אז כדי לכסות את תאים, הצלחת מותר דגירה של עד 5 דקות בטמפרטורת החדר. במהלך הזמן הזה התאים ניתן לראות עיגול, ומושבות מרימים את פני הצלחת. Pipetting חזר עדין יסיר מושבות תאים מפני השטח צלחת. תאים Trypsinized ממוקמים צינור חרוטי סטנדרטי המכיל מראש חימם התקשורת הס תא להרוות טריפסין הנותרים, וסובב אז. תאים הם resuspended התקשורת צמיחה בריכוז של כמיליון תאים למ"ל אחד בתקשורת, ריכוז כזה שאף אחד aliquot קפוא מספיקה כדי להחיות תרבות על צלחת 10 ס"מ. אחרי התאים resuspended כראוי, קרים כקרח התקשורת מקפיא נוסף בהיקף זהה. המתלים Cell מעורבבים היטב, aliquoted לתוך צלוחיות מקפיא, ואיפשר לאט לקפוא-80C מעל 24 שעות. תאים קפואים יכול מכן מועבר בשלב אדים של חנקן נוזלי לצורך אחסון לטווח ארוך, או להישאר כ -80 שישה חודשים.

Protocol

1. תרבות בריאה, אקספוננציאלית הרחבת נשטף עם PBS להסיר התקשורת שיורי שיכול אחרת להרוות את התגובה טריפסין.
2. חימם 0.05% טריפסין-EDTA הוא הוסיף אז כדי לכסות את תאים, הצלחת מותר דגירה של עד 5 דקות בטמפרטורת החדר. במהלך הזמן הזה התאים ניתן לראות עיגול, ומושבות מרימים את פני הצלחת.
3. Pipetting חזר עדין יסיר מושבות תאים מפני השטח צלחת.
4. תאים Trypsinized ממוקמים צינור חרוטי סטנדרטי המכיל מראש חימם התקשורת הס תא להרוות טריפסין הנותרים, וסובב אז.
5. תאים הם resuspended התקשורת צמיחה בריכוז של כמיליון תאים למ"ל אחד בתקשורת.
6. אחרי התאים resuspended כראוי, קרים כקרח מדיה מקפיא נוסף בהיקף זהה.
7. המתלים Cell מעורבבים היטב, aliquoted לתוך צלוחיות מקפיא, ואיפשר לאט לקפוא-80C מעל 24 שעות.
8. תאים קפואים יכול מכן מועבר בשלב אדים של חנקן נוזלי לצורך אחסון לטווח ארוך, או להישאר כ -80 שישה חודשים.

הערה: כזה aliquot קפוא בריכוז של 106 תאים / מ"ל ​​מספיקה כדי להחיות תרבות על צלחת 10 ס"מ.

Discussion

הטכניקה אנו מתארים עבור קווי גוונים תא הקפאה עובד היטב עבור אחסון יעיל להחיות גוונים שורות תאים וכן כל תא יונקים של עניין. הקפאת חלק קטן של תאים במעבר זה הוא שיקול חשוב בעת עבודה עם שורות הס התא, כמו הפרעות קריוטיפ יכול להתעורר תאים חריגים יכולים במהירות להשתלט על הקו. לפיכך, לאחר קפוא מפצלת במעבר בכל בנוסף הבנקים הגדולים על קטעים מסוימים רצוי מאוד.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
HuES Medium	medium			For a total of 651.5 mL, add: 500 mL KO-DMEM + 6.5 mL PenStrep + 6.5 mL L-Glut + 6.5 mL NEAA 6.5 mL + beta-mercapt–thanol 0.6 µL (14.3 M stock) + 65 mL Serum Replacement + 65 mL Plasmanate + 0.65 mL bFGF2 (~10 ng/mL final)
Freezing Medium	medium			80% FCS (fetal calf serum) + 20% DMSO (dimethyl sulfoxide). Stored at 4 °C.