냉동 인간 ES 세포

Summary

여기 우리 연구소 색채 인간의 배아 줄기 세포 라인을 멈추 방법을 보여줍니다.

Abstract

여기 우리 연구소 색채 인간의 배아 줄기 세포 라인을 멈추 방법을 보여줍니다. 건강, 기하 급수적으로 팽창 문화 달리 트립신 반응을 끄다 수 잔류 미디어를 제거하는 PBS로 씻어 있습니다. 예열 0.05 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)은 다음 세포를 표지에 추가하고, 플레이트가 실온에서 5 분 위해 부화 허용됩니다. 이 기간 동안 세포는 반올림을 관찰하고, 식민지 접시 표면을 리프팅 수 있습니다. 젠틀 반복 pipetting은 판 표면에서 세포 식민지를 제거합니다. Trypsinized 세포가 남아있는 트립신을 담금질하기 위해 미리 예열 hES 세포 미디어를 포함하는 표준 원뿔 관에 배치하고 냈지 있습니다. 전지는 미디어, 하나 냉동 나누어지는가 10cm의 접시에 문화를 부활 충분합니다 그러한 농도 중 하나 ML 약 100 만 세포의 농도에서 성장 미디어를 resuspended 있습니다. 세포가 적절하게 resuspended 후 얼음 차가운 냉동 미디어는 동일한 볼륨에 추가됩니다. 셀 suspensions는 철저하게 혼합 동결 튜브로 aliquoted, 천천히 24시간 이상 투 - 80C 동결로 사용할 수 있습니다. 냉동 세포가 장기 저장을 위해 액체 질소의 증기 단계로 이동하거나, 약 6 개월 -80에서 남아있을 수 있습니다.

Protocol

1. 건강, 기하 급수적으로 팽창 문화 달리 트립신 반응을 끄다 수 잔류 미디어를 제거하는 PBS로 씻어 있습니다.
2. 예열 0.05 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)은 다음 세포를 표지에 추가하고, 플레이트가 실온에서 5 분 위해 부화 허용됩니다. 이 기간 동안 세포는 반올림을 관찰하고, 식민지 접시 표면을 리프팅 수 있습니다.
3. 젠틀 반복 pipetting은 판 표면에서 세포 식민지를 제거합니다.
4. Trypsinized 세포가 남아있는 트립신을 담금질하기 위해 미리 예열 hES 세포 미디어를 포함하는 표준 원뿔 관에 배치하고 냈지 있습니다.
5. 전지는 매체 중 하나 ML 약 100 만 세포의 농도에서 성장 미디어를 resuspended 있습니다.
6. 세포가 적절하게 resuspended 후 얼음 차가운 냉동 미디어는 동일한 볼륨에 추가됩니다.
7. 셀 suspensions는 철저하게 혼합 동결 튜브로 aliquoted, 천천히 24시간 이상 투 - 80C 동결로 사용할 수 있습니다.
8. 냉동 세포가 장기 저장을 위해 액체 질소의 증기 단계로 이동하거나, 약 6 개월 -80에서 남아있을 수 있습니다.

참고 : 106 세포 / ML의 농도에서 같은 냉동 나누어지는가 10cm의 접시에 문화를 부활하기에 충분합니다.

Discussion

우리는 냉동 색채 세포 라인에 대한 설명이 기술을 효율적으로 색채 셀 라인 또한 관심의 포유 동물 세포를 저장하고 부활을 위해 잘 작동합니다. 핵형의 이상이 발생할 수 있으며, 비정상적인 세포가 신속하게 라인을 대신할 수있는, hES 세포 라인 작업을 할 때 각각의 통과에 세포의 작은 비율을 동결하는 것은 중요한 고려 사항이다. 따라서, 냉동하는 것이 특정 구절에 대형 은행 이외의 모든 통로에서 분리는 매우 바람직합니다.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
HuES Medium	medium			For a total of 651.5 mL, add: 500 mL KO-DMEM + 6.5 mL PenStrep + 6.5 mL L-Glut + 6.5 mL NEAA 6.5 mL + beta-mercapt–thanol 0.6 µL (14.3 M stock) + 65 mL Serum Replacement + 65 mL Plasmanate + 0.65 mL bFGF2 (~10 ng/mL final)
Freezing Medium	medium			80% FCS (fetal calf serum) + 20% DMSO (dimethyl sulfoxide). Stored at 4 °C.