تجميد الخلايا البشرية ES

Summary

نحن هنا لشرح كيفية مختبرنا يتجمد الأشكال الجذعية الجنينية خطوط الخلايا البشرية.

Abstract

نحن هنا لشرح كيفية مختبرنا يتجمد الأشكال الجذعية الجنينية خطوط الخلايا البشرية. يتم غسلها وصحية ، والثقافة ، بشكل كبير ، مع التوسع في برنامج تلفزيوني لإزالة بقايا وسائل الاعلام التي يمكن أن يشفي إلا رد فعل التربسين. ثم يتم إضافة تحسنت 0.05 ٪ التربسين - EDTA لتغطية الخلايا ، وسمح لوحة لاحتضان لمدة تصل إلى 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ويمكن خلال هذا الوقت لوحظ أن الخلايا التقريب ، ومستعمرات رفع قبالة سطح اللوحة. وسوف تتكرر لطيف pipetting إزالة الخلايا والمستعمرات من سطح اللوحة. وتوضع الخلايا في Trypsinized أنبوب مخروطي القياسية التي تتضمن وسائل الاعلام قبل تحسنت الخلية HES لإرواء التربسين المتبقية ، ونسج ذلك الحين. معلق الخلايا هي وسائط النمو في تركيز حوالي مليون الخلايا في واحد مل من وسائل الإعلام ، والتركيز مثل أن أحد قسامة المجمدة تكفي لإحياء ثقافة على طبق من 10cm. بعد بشكل كاف معلق الخلايا ، يتم إضافة وسائل الاعلام الجليد تجميد الباردة في حجم متساوية. تختلط الايقاف الخلية بدقة ، aliquoted الى تجميد قارورة ، وسمح لتجميد ببطء إلى 80C على مدى 24 ساعة. يمكن تجميد الخلايا ثم انتقلت إلى مرحلة بخار النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل ، أو البقاء في -80 لنحو ستة أشهر.

Protocol

1. يتم غسلها وصحية ، والثقافة ، بشكل كبير ، مع التوسع في برنامج تلفزيوني لإزالة بقايا وسائل الاعلام التي يمكن أن يشفي إلا رد فعل التربسين.
2. ثم يتم إضافة تحسنت 0.05 ٪ التربسين - EDTA لتغطية الخلايا ، وسمح لوحة لاحتضان لمدة تصل إلى 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ويمكن خلال هذا الوقت لوحظ أن الخلايا التقريب ، ومستعمرات رفع قبالة سطح اللوحة.
3. وسوف تتكرر لطيف pipetting إزالة الخلايا والمستعمرات من سطح اللوحة.
4. وتوضع الخلايا في Trypsinized أنبوب مخروطي القياسية التي تتضمن وسائل الاعلام قبل تحسنت الخلية HES لإرواء التربسين المتبقية ، ونسج ذلك الحين.
5. معلق الخلايا هي وسائط النمو في تركيز حوالي مليون الخلايا في واحد مل من وسائل الإعلام.
6. بعد بشكل كاف معلق الخلايا ، يتم إضافة وسائل الإعلام تجمد الجليد الباردة في حجم متساوية.
7. تختلط الايقاف الخلية بدقة ، aliquoted الى تجميد قارورة ، وسمح لتجميد ببطء إلى 80C على مدى 24 ساعة.
8. يمكن تجميد الخلايا ثم انتقلت إلى مرحلة بخار النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل ، أو البقاء في -80 لنحو ستة أشهر.

ملاحظة : هذه قسامة المجمدة عند تركيز من 106 خلية / مل يكفي لإحياء ثقافة على طبق من 10cm.

Discussion

تقنية وصفنا لتجميد خطوط الخلايا الأشكال يعمل بشكل جيد لتخزين بكفاءة وإحياء خطوط الخلايا الأشكال وأيضا أي خلايا الثدييات في المصالح. تجميد نسبة صغيرة من الخلايا في كل مرور اعتبار مهم عند العمل مع خطوط الخلايا HES ، وشذوذ النمط النووي يمكن أن تنشأ خلايا غير طبيعية ويمكن أن تتخذ بسرعة أكثر من خط. وهكذا ، بعد أن جمدت انشقاقات في كل مرور بالإضافة إلى المصارف الكبيرة في بعض المقاطع غير مرغوب فيه للغاية.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
HuES Medium	medium			For a total of 651.5 mL, add: 500 mL KO-DMEM + 6.5 mL PenStrep + 6.5 mL L-Glut + 6.5 mL NEAA 6.5 mL + beta-mercapt–thanol 0.6 µL (14.3 M stock) + 65 mL Serum Replacement + 65 mL Plasmanate + 0.65 mL bFGF2 (~10 ng/mL final)
Freezing Medium	medium			80% FCS (fetal calf serum) + 20% DMSO (dimethyl sulfoxide). Stored at 4 °C.