Congelamento cellule staminali embrionali umane

Summary

Qui mostriamo come il nostro laboratorio si blocca RIFLESSI embrionali umane linee di cellule staminali.

Abstract

Qui mostriamo come il nostro laboratorio si blocca RIFLESSI embrionali umane linee di cellule staminali. Una sana cultura espansione esponenziale viene lavato con PBS per rimuovere il supporto residuo che altrimenti potrebbero spegnere la reazione tripsina. Riscaldato 0,05% tripsina-EDTA è poi aggiunto per coprire le cellule, e la piastra di permesso di incubare fino a 5 minuti a temperatura ambiente. Durante questo periodo le cellule possono essere osservati arrotondamento, e le colonie di sollevamento dalla superficie della piastra. Gentle pipettaggio ripetuto rimuove le cellule e le colonie dalla superficie della piastra. Cellule Trypsinized sono posti in un tubo standard conica contenente pre-riscaldato mezzi cellula hES per placare la tripsina rimanenti, e poi filata. Le cellule sono risospese mezzi di crescita ad una concentrazione di circa un milione di cellule in un ml di media, una concentrazione tale che una aliquota congelati è sufficiente per far risorgere una cultura su un piatto di 10 cm. Dopo che le cellule sono risospese adeguatamente, i media congelamento ghiacciata si aggiunge al medesimo volume. Sospensioni di cellule sono mescolate accuratamente, aliquotati in fiale congelamento, e ha permesso di congelare lentamente a-80C oltre 24 ore. Cellule congelate possono poi spostato nella fase vapore di azoto liquido per la conservazione a lungo termine, o rimanere a -80 per circa sei mesi.

Protocol

1. Una sana cultura espansione esponenziale viene lavato con PBS per rimuovere il supporto residuo che altrimenti potrebbero spegnere la reazione tripsina.
2. Riscaldato 0,05% tripsina-EDTA è poi aggiunto per coprire le cellule, e la piastra di permesso di incubare fino a 5 minuti a temperatura ambiente. Durante questo periodo le cellule possono essere osservati arrotondamento, e le colonie di sollevamento dalla superficie della piastra.
3. Gentle pipettaggio ripetuto rimuove le cellule e le colonie dalla superficie della piastra.
4. Cellule Trypsinized sono posti in un tubo standard conica contenente pre-riscaldato mezzi cellula hES per placare la tripsina rimanenti, e poi filata.
5. Le cellule sono risospese mezzi di crescita ad una concentrazione di circa un milione di cellule in un ml di media.
6. Dopo che le cellule siano adeguatamente risospesi, Media congelamento ghiacciata si aggiunge al medesimo volume.
7. Sospensioni di cellule sono mescolate accuratamente, aliquotati in fiale congelamento, e ha permesso di congelare lentamente a-80C oltre 24 ore.
8. Cellule congelate possono poi spostato nella fase vapore di azoto liquido per la conservazione a lungo termine, o rimanere a -80 per circa sei mesi.

Nota: tale aliquota congelata a una concentrazione di 106 cellule / ml è sufficiente per far risorgere una cultura su un piatto di 10 cm.

Discussion

La tecnica che descriviamo per il congelamento linee cellulari RIFLESSI funziona bene per memorizzare in modo efficiente e resuscitando linee cellulari colori e anche le cellule di mammiferi di interesse. Congelamento una piccola percentuale di cellule ad ogni passaggio è una considerazione importante quando si lavora su linee cellulari hES, come anormalità del cariotipo possono sorgere e le cellule anormali può assumere rapidamente oltre la linea. Così, dopo aver congelato divide ad ogni passaggio oltre alle banche di grandi dimensioni in alcuni passaggi è altamente auspicabile.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
HuES Medium	medium			For a total of 651.5 mL, add: 500 mL KO-DMEM + 6.5 mL PenStrep + 6.5 mL L-Glut + 6.5 mL NEAA 6.5 mL + beta-mercapt–thanol 0.6 µL (14.3 M stock) + 65 mL Serum Replacement + 65 mL Plasmanate + 0.65 mL bFGF2 (~10 ng/mL final)
Freezing Medium	medium			80% FCS (fetal calf serum) + 20% DMSO (dimethyl sulfoxide). Stored at 4 °C.