Congelamento células ES

Summary

Aqui demonstramos como nosso laboratório congela MATIZ embrionárias humanas linhas de células estaminais.

Abstract

Aqui demonstramos como nosso laboratório congela MATIZ embrionárias humanas linhas de células estaminais. Uma cultura saudável, ampliando exponencialmente é lavado com PBS para remover a mídia residual que poderiam saciar a reação Tripsina. Aqueceu 0,05% Tripsina-EDTA é adicionado para cobrir as células, ea placa permitido incubar por até 5 minutos em temperatura ambiente. Durante esse tempo, as células podem ser observadas de arredondamento, e as colônias de elevação da superfície da placa. Pipetagem repetida gentil irá remover células e de colônias a partir da superfície da placa. Tripsinizados células são colocadas em um tubo cônico contendo padrão pré-aquecido media CTeh para saciar a tripsina restantes, e então girou. Células são ressuspendidas meios de crescimento em uma concentração de aproximadamente um milhão de células em um mL de mídia, uma concentração de tal forma que uma alíquota é suficiente para ressuscitar uma cultura em uma placa de 10cm. Depois que as células sejam adequadamente ressuspenso, media gelo frio é adicionado ao volume igual. Suspensões de células são bem misturados, aliquotado em frascos de congelamento, e permitiu a lenta congelamento a-80C durante 24 horas. Células congeladas pode, então, mudou-se para a fase de vapor de nitrogênio líquido para o armazenamento de longo prazo, ou permanecer em temperatura de -80 por aproximadamente seis meses.

Protocol

1. Uma cultura saudável, ampliando exponencialmente é lavado com PBS para remover a mídia residual que poderiam saciar a reação Tripsina.
2. Aqueceu 0,05% Tripsina-EDTA é adicionado para cobrir as células, ea placa permitido incubar por até 5 minutos em temperatura ambiente. Durante esse tempo, as células podem ser observadas de arredondamento, e as colônias de elevação da superfície da placa.
3. Pipetagem repetida gentil irá remover células e de colônias a partir da superfície da placa.
4. Tripsinizados células são colocadas em um tubo cônico contendo padrão pré-aquecido media CTeh para saciar a tripsina restantes, e então girou.
5. Células são ressuspendidas meios de crescimento em uma concentração de aproximadamente um milhão de células em um mL de mídia.
6. Depois que as células sejam adequadamente ressuspenso, Media gelada congelamento é adicionado ao volume igual.
7. Suspensões de células são bem misturados, aliquotado em frascos de congelamento, e permitiu a lenta congelamento a-80C durante 24 horas.
8. Células congeladas pode, então, mudou-se para a fase de vapor de nitrogênio líquido para o armazenamento de longo prazo, ou permanecer em temperatura de -80 por aproximadamente seis meses.

Nota: como uma alíquota congelado a uma concentração de 106 células / ml é suficiente para ressuscitar uma cultura em uma placa de 10cm.

Discussion

A técnica que descrevemos para congelar linhas MATIZ celular funciona bem para armazenar de forma eficiente e ressuscitar MATIZ linhas celulares e também quaisquer células de mamíferos de interesse. Congelar uma pequena proporção de células em cada passagem é uma consideração importante quando se trabalha com linhagens de células-tronco embrionárias humanas, como anormalidades do cariótipo podem surgir e as células anormais podem rapidamente assumir a linha. Assim, tendo congelado racha em cada passagem, além de grandes bancos em certas passagens é altamente desejável.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
HuES Medium	medium			For a total of 651.5 mL, add: 500 mL KO-DMEM + 6.5 mL PenStrep + 6.5 mL L-Glut + 6.5 mL NEAA 6.5 mL + beta-mercapt–thanol 0.6 µL (14.3 M stock) + 65 mL Serum Replacement + 65 mL Plasmanate + 0.65 mL bFGF2 (~10 ng/mL final)
Freezing Medium	medium			80% FCS (fetal calf serum) + 20% DMSO (dimethyl sulfoxide). Stored at 4 °C.