Frysning Mänskliga ES-celler

Summary

Här kan vi visa hur vårt labb fryser nyanser mänskliga embryonala stamcellslinjer.

Abstract

Här kan vi visa hur vårt labb fryser nyanser mänskliga embryonala stamcellslinjer. En frisk, exponentiellt växande kultur tvättas med PBS att avlägsna rester av media som annars skulle kunna släcka Trypsin reaktion. Uppvärmd 0,05% Trypsin-EDTA tillsätts sedan för att täcka celler, och plattan får inkubera i upp till 5 minuter i rumstemperatur. Under denna tid celler kan observeras avrundning, och kolonier lyfta av plattan. Gentle upprepad pipettering kommer att ta bort celler och kolonier från plåtytan. Trypsinized celler placeras i ett vanligt koniskt rör som innehåller förvärmda hES cell media för att släcka resterande trypsin och sedan spunnits. Celler är återsuspenderade tillväxt media vid en koncentration av cirka en miljon celler i en ml av media, en koncentration så att en frusen alikvot är tillräcklig för att återuppväcka en kultur på en 10cm tallrik. Efter att cellerna är tillräckligt återsuspenderade, är iskall frysning media läggas till samma volym. Cellsuspensioner blandas ordentligt, alikvoteras till frysning flaskor, och får långsamt frysa till-80C under 24 timmar. Frysta celler kan sedan flyttas till gasfasen av flytande kväve för långtidsförvaring, eller ligger kvar på -80 i ungefär sex månader.

Protocol

1. En frisk, exponentiellt växande kultur tvättas med PBS att avlägsna rester av media som annars skulle kunna släcka Trypsin reaktion.
2. Uppvärmd 0,05% Trypsin-EDTA tillsätts sedan för att täcka celler, och plattan får inkubera i upp till 5 minuter i rumstemperatur. Under denna tid celler kan observeras avrundning, och kolonier lyfta av plattan.
3. Gentle upprepad pipettering kommer att ta bort celler och kolonier från plåtytan.
4. Trypsinized celler placeras i ett vanligt koniskt rör som innehåller förvärmda hES cell media för att släcka resterande trypsin och sedan spunnits.
5. Celler är återsuspenderade tillväxt media vid en koncentration av cirka en miljon celler i en ml av media.
6. Efter att cellerna är tillräckligt återsuspenderade, är iskall Frysning Media läggas till samma volym.
7. Cellsuspensioner blandas ordentligt, alikvoteras till frysning flaskor, och får långsamt frysa till-80C under 24 timmar.
8. Frysta celler kan sedan flyttas till gasfasen av flytande kväve för långtidsförvaring, eller ligger kvar på -80 i ungefär sex månader.

Obs: en sådan frusen alikvot vid en koncentration av 106 celler / ml är tillräckligt för att återuppväcka en kultur på en 10cm tallrik.

Discussion

Tekniken vi beskriver för frysning nyanser cellinjer fungerar bra för att effektivt lagra och återuppväcka nyanser cellinjer och även eventuella däggdjursceller av intresse. Frysning en liten andel av celler vid varje passage är en viktig faktor när man arbetar med HES cellinjer som karyotyp avvikelser kan uppstå och onormala celler kan snabbt ta över linjen. Således är att ha fryst spricker vid varje passage förutom stora bankerna på vissa ställen mycket önskvärt.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
HuES Medium	medium			For a total of 651.5 mL, add: 500 mL KO-DMEM + 6.5 mL PenStrep + 6.5 mL L-Glut + 6.5 mL NEAA 6.5 mL + beta-mercapt–thanol 0.6 µL (14.3 M stock) + 65 mL Serum Replacement + 65 mL Plasmanate + 0.65 mL bFGF2 (~10 ng/mL final)
Freezing Medium	medium			80% FCS (fetal calf serum) + 20% DMSO (dimethyl sulfoxide). Stored at 4 °C.