Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Glasvezel-implantatie voor chronische Optogenetic Stimulatie van hersenweefsel

Published: October 29, 2012 doi: 10.3791/50004

Summary

De ontwikkeling van optogenetics biedt nu de middelen om nauwkeurig te stimuleren genetische gedefinieerde neuronen en circuits,

Abstract

Het ophelderen van de patronen van neuronale connectiviteit is een uitdaging voor zowel de klinische en fundamentele neurowetenschappen. Elektrofysiologie is de gouden standaard voor het analyseren van patronen van synaptische connectiviteit, maar gekoppeld elektrofysiologische opnames kunnen zowel omslachtig en experimenteel te beperken. De ontwikkeling van optogenetics introduceert een elegante methode om neuronen en circuits stimuleren, zowel in vitro en in vivo een 2,3. Door gebruik celtype specifieke promoter activiteit opsin expressie in discrete neuronale populaties kan men nauwkeurig stimuleren genetisch gedefinieerde neuronale subtypes in verschillende circuits 4-6. Goed beschreven methoden neuronen, inclusief elektrische stimulatie en / of farmacologische manipulaties, stimuleren vaak willekeurig celtype, invasieve en kunnen beschadigen omliggende weefsels. Deze beperkingen kunnen veranderen normale synaptische functie en / of circuit gedrag. Bovendien wegensde aard van de manipulatie, de huidige methoden vaak acute en terminal. Optogenetics biedt de mogelijkheid om neuronen te stimuleren in een relatief onschadelijke wijze en in genetisch gerichte neuronen. De meeste studies met in vivo optogenetics momenteel een optische vezel geleid via een canule geïmplanteerd 6,7, maar beperkingen van deze methode zijn beschadigd hersenweefsel met herhaalde inbrengen van een optische vezel en potentiële breuk van de vezel binnen de canule. Gezien de snel groeiende gebied van de optogenetics, een meer betrouwbare methode van chronische stimulatie is noodzakelijk om op lange termijn studies te vergemakkelijken met een minimale collaterale weefselbeschadiging. Hier geven we onze gemodificeerd protocol als video artikel de werkwijze effectief en elegant beschreven in Sparta et al. vullen. 8 voor de vervaardiging van een glasvezel implantaat en zijn vaste bevestiging op de schedel van verdoofde muizen, en de montage van de fiberoptische koppeling verbinden van het implantaat aan een lichtbron. Het implantaat, verbonden met optische vezels om een solid-state laser, maakt een efficiënte methode om functionele neuronale circuits chronisch photostimulate met minder weefselschade 9 met kleine, afneembare tethers. Permanente bevestiging van de glasvezel implantaten zorgt voor een consistente, op lange termijn in vivo optogenetic studies van neuronale circuits in wakker, gedragen muizen 10 met minimale weefselbeschadiging.

Protocol

* Alle materialen samen met de respectieve fabrikanten en / of leveranciers worden onder het protocol.

1. Montage van Implant

  1. Een mengsel van warmte hardbare epoxy glasvezel door toevoeging van 100 mg verharder 1 g hars.
  2. Meet en snijd ongeveer 35 mm van 125 urn glasvezel met 100 micrometer kern door het scoren van het met een wig-tip carbide schrijver. Plaats de schrijver loodrecht op de glasvezel en de score in een enkele, unidirectionele beweging. Het snijden van de vezels volledig beschadigt de vezel kern.
  3. Plaats een LC keramische ferrule met een 127 micrometer boren zich in de bankschroef, bolle zijde naar beneden gericht.
  4. Plaats de glasvezel in de ferrule. De glasvezel moet schuiven soepel en marginaal voorbij het ​​convexe einde van de ferrule (figuur 1a).
  5. Breng een druppel van warmte-uithardende glasvezel epoxy aan het platte uiteinde en warmte met warmte kanon tot epoxy wordt zwart. De epoxy moetVul de ring als het wordt verwarmd voor huidvorming. De epoxy moet genezen binnen ~ 1 min van constante warmte applicatie.
  6. Verwijder alle epoxy langs de zijden van de ferrule, omdat het zal verhinderen interfacing met de koppeling.
  7. Polish de bolle kant van de klemring met een LC glasvezel polijstschijf (FOPD) op aluminiumoxide hard vellen op het polijstkussen (figuur 1b). Maak cirkelvormige rotatie patronen en polijsten op vier cijfers in de volgende volgorde: 5, 3, 1 0,3 micrometer grit.
  8. Snijd de glasvezel aan het platte uiteinde op de juiste lengte zodanig dat het gebied van belang gericht. De lengte kan worden bepaald met de stereotactische atlas.
  9. Test het implantaat door deze op de laser via het snoer van hieronder beschreven. De gepolijste uiteinde van het implantaat in de huls van de koppeling en moet direct contact met de tegenoverliggende ferrule. Het implantaat moet kunnen 10 mW van lichtopbrengst behouden gemeten bij de punt van ee implantaat vezels. Een slechte implantaat een zwak brandpunt nabij het uiteinde van de glasvezel.
  10. Bewaar de afgewerkte implantaten (figuur 1c) in schuim tot gebruik.

2. Montage van Fiber Optic Koppeling Cord

  1. Een mengsel van warmte hardbare epoxy glasvezel als hierboven.
  2. Meet en knip de juiste lengte van 220 micrometer glasvezel met 200 pm kern door het scoren van het met een wig-tip carbide schrijver. De lengte van de vezel moet toelaten de muis vrij bewegen de behuizing maar laat de muis te kauwen door de vezel.
  3. Plaats de glasvezel in een lengte van furcatie slang iets langer dan de optische lengte. De buis moet een binnendiameter iets groter dan de glasvezel.
  4. Strip ~ 25mm aan de ene kant van de glasvezel en plaats deze in het metalen uiteinde van een multimode FC MM Huls Vergadering met 230 micrometer droeg totdat deze stopt. De glasvezel moet steken door de Ferrule uiteinde (figuur 2a).
  5. Bevestig de verbinding met cyanoacrylaat (super lijm) aan het metalen uiteinde. Bedek de verbinding met een connector Boot en polijst de ferrule eindigen met een FC FOPD. Maak cirkelvormige rotatie patronen en polish op vier cijfers in de volgende volgorde: 5, 3, 1, 0,3 um grit (Figuur 2b).
  6. Strippen en het andere uiteinde van de glasvezel in een LC keramische ring (230 pm id boring) met de bolle kant distale. Breng een druppel epoxy op het platte uiteinde en verhit tot genezen.
  7. Polish de bolle kant van de klemring met een FC FOPD op aluminiumoxide polijsten platen zoals hierboven beschreven.
  8. Schuif een LC ferrule huls over de bolle kant van de ferrule tot halverwege de huls.
  9. Plaats Krimpkous over de furcatie buis en mof en warmte te beveiligen en beschermen van de verbinding (figuur 2c).
  10. Test de koppeling door deze op de laserbron en het meten van de lichtopbrengstut door de koppeling met een spectrofotometer. Het licht verlies tussen de laser output en de gemeten koppeling uitgang mag niet meer dan 30%.

3. Chirurgische implantatie

* Dit is een tips-only procedure. Instrumenten zijn steriel maar handschoenen hoeven niet te wijten zijn aan een constante manipulatie tussen de instrumenten en apparatuur.

  1. Verdoven de muis met een intraperitoneale injectie Ketamine / Xylazine mengsel 100 en 10 mg / kg met een 30-gauge naald.
  2. Scheer de hoofdhuid met tondeuse. Veeg de hoofdhuid met 70% isopropylalcohol, gevolgd door Betasept (4% Chloorhexidine-oplossing) schoonmaken voor twee minuten, eenmaal te herhalen.
  3. Plaats de muis in de sterotaxic rig en zet het hoofd, ervoor te zorgen dat de schedel niveau. Breng oogzalf voor de ogen tot droog en postoperatieve pijn te voorkomen. Behoud anesthesie met isofluraan vervluchtigde (1-3% verdund met zuurstof, afhankelijk van de fysiologische toestand van de mouse, die voortdurend moet worden gecontroleerd door reactie op een staart knijpen).
  4. Maak een insnijding door de middellijn van de hoofdhuid, waardoor de schedel uit het oog banen te lambda. Verdringen bindweefsel nodig.
  5. Gebruik Serafin klemmen te leggen dat de huid en onderhouden van een toegang tot de schedel (figuur 3a).
  6. Etch een geruit patroon over het gehele oppervlak van de schedel met een tandheelkundige pick. Weg te wassen puin met een steriele zoutoplossing. Goed afdrogen.
  7. Breng waterstofperoxide (3%) om de blootgestelde schedel met een wattenstaafje voor ~ 2-3 seconden aan microporiën maken. Was meerdere malen en afdrogen. Als alternatief kunnen ankers worden geschroefd in de schedel, zoals beschreven in Sparta et al.. (2012).
  8. Nogmaals, etsen een geruit patroon in de schedel met een tandheelkundige pick en weg te spoelen vuil met een zoutoplossing. Goed afdrogen.
  9. Met een draaiend gereedschap, een kleine boorgat craniotomie (<1 mm in diameter) met een steriele boor(Geautoclaveerd) boven het gebied van belang, bepaald door de stereotactische atlas gekalibreerd bregma en lambda. Zorg ervoor dat u de dura breken of beschadigt weefsel. Wegspoelen puin en afdrogen.
  10. Plaats de glasvezel ferrule (implantaat) in de probe houder en sluit de stereotactische arm.
  11. Plaats het implantaat op zijn plaats direct boven het gebied van belang met het stereotactische arm (figuur 3b). Als u de optische vezel in het hersenweefsel, moet de vezel langzaam voortbewogen met een snelheid van ~ 2 mm / min. De ferrule moet rusten op de resterende schedel.
  12. Maak een mengsel van tandheelkundig cement. Het mengsel moet een voldoende lage viscositeit om gemakkelijk passen in de schedel. Mengsel bruikbaar voor 2-4 minuten.
  13. Met een steriele tandenstoker een dunne, gelijkmatige laag tandheelkundig cement in de schedel en op het onderste gedeelte van het implantaat. De basislaag van tandheelkundig cement omvat ten zoveel oppervlakte op de schedel alsmogelijk. Laat de tandheelkundig cement in contact komen met de huid van de muis. Dit zal leiden tot meer problemen bij het hechten en irritatie van de muis. Als het tandheelkundig cement in contact komt met de huid, laat het gedeeltelijk drogen zodat de gehele laag cement kan worden afgepeld voor setting.
  14. Laat het dan volledig opdrogen.
  15. Breng ook lagen van tandheelkundig cement om een kleine verhoging vormen over de schedel en rond het implantaat, waardoor elke laag volledig laten drogen (Figuur 3c). Laat ~ 3-5 mm van de bolle kant van de ferrule schoon van cement, zodat een gladde, vrij verbinding.
  16. Hechten de hoofdhuid over de heuvel van tandheelkundige cement en rond het implantaat met steriele, voor eenmalig gebruik zijde gevlochten hechtdraad (6-0) met een C22 naald. Verwijder na 7 dagen. Optioneel: Gebruik Vet Bond voor extra binding na het hechten. Zorg ervoor dat u minimaal Vet Bond te gebruiken. Teveel kan leiden tot ernstige beschadiging van de huid als gevolg van krabben.
  17. ONMIDDELLIJKy na de operatie moet muis subcutaan worden geïnjecteerd met Ketprophen (5 mg / kg) om postoperatieve pijn te verminderen. Dit zou 24 uur later herhaald. Topische toepassing analgetica (Bupivicaine) en antibiotica (Neosporin) gehecht aan de huid en rond de basis van het implantaat.
  18. Plaats de muis in een kooi boven een verwarming deken voor het herstel van anesthesie. Plaats de muis in een steriele, postoperatief herstel kooi. Het herstel kooi mogen geen beddengoed om de temperatuur te behouden en stikken. De muis kan worden teruggegeven aan de oorspronkelijke kooi of een nieuwe kooi een keer wakker.

Juiste assemblage van de optische implantaat en koppeling resulteert in een minimale foton verlies tussen de lichtbron en het einde van de glasvezel in het gebied van belang. Goed gepolijste glasvezel moet zenden licht in een uniform, concentrische cirkel (figuur 2d). Met een zorgvuldige implantatie en hechten, het implantaat veroorzaakt geen zichtbare irritatie aande muis en kan ter plaatse blijven voor langdurige studies (figuur 3d,> 1 maand ongepubliceerde waarnemingen) zonder significante afbraak van de glasvezel of de hoeveelheid doorgelaten licht. Onjuiste implantatie of hechten kan irritatie en kan resulteren in de muis krassen door de hoofdhuid, waardoor de tandheelkundig cement, of breuk van de flensbus van de tandheelkundig cement door persistent manipulatie. Een schematisch diagram van het samengestelde systeem kan worden gezien in figuur 4.

Figuur 1
Figuur 1. Montage van implanteerbare glasvezel. (A) De glasvezel wordt in de ferrule, iets uitsteekt voorbij de bolle kant aangegeven door de pijlpunt. (B) de bolle kant van de ring wordt gepolijst met een FOPD op steeds fijnere soorten vellen polijsten. (C) De afgewerkte implanteerbare vezel optic. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 2
Figuur 2. Montage van glasvezel koppeling gebruikt om de ketting glasvezel afdichting aan het implantaat. (A) Glasvezel steken door de ferrule montage. (B) De ferrule zijde van het samenstel wordt ingebracht in de FOPD en gepolijst met steeds fijnere soorten polijstpapier. (C) De ferrule huls is aangebracht over de ferrule en vastgezet met krimpkous. (D) De afgewerkte glasvezel koppeling moet produceren een concentrische licht met minimale foton verlies.

Figuur 3
Figuur 3. Chirurgische implantatie van de glasvezel. (A) Het gehele oppervlak van de cranium wordt blootgesteld en bindweefsel wordt gewist. (B) De glasvezel implantaat in positie wordt gehouden met de stereotactische arm. (C) Dental cement wordt toegepast vaststelling van de glasvezel implantaat aan de schedel. (D)> 1 maand na implantatie, is de huid genezen is rond het implantaat en er zijn geen tekenen van irritatie.

Figuur 4
Figuur 4. Schematische weergave van de functionele systeem

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Optogenetics is een krachtige nieuwe techniek die ongekende controle over specifieke neuronale subtypes mogelijk maakt. Dit kan worden benut moduleren neurale circuits met anatomische en temporele precisie, maar worden de celtype willekeurige en invasieve effecten van elektrische stimulering door een elektrode. Implantatie van glasvezel zorgt voor consistente, chronische stimulering van neurale circuits meerdere sessies in wakker gedragen muizen met minimale schade aan weefsel. Dit systeem, dat oorspronkelijk ontwikkeld door Sparta et al.. 8 en aangepast aan onze doeleinden te passen, gaat nog een stap verder dan de geïmplanteerde canule en fixeert de glasvezel op zijn plaats in het gebied van belang om ervoor te zorgen consistente richten tussen de sessies in lange termijn studies. De implantaten kunnen worden aangepast aan verschillende gebieden van de hersenen.

Verschillende stappen binnen deze methode vereisen precisie en aandacht voor detail. Elk knooppunt van glasvezel koppelingse gepolijst tot een minimale lichtverlies te garanderen. Na polijsten moet de uiteinden worden onderzocht onder een microscoop te verifiëren dat er geen schade aan de vezelkern. Als lichtverlies tussen de bron en het gemeten vermogen van meer dan 30%, moet elk onderdeel worden repolished om maximale foton flux of het onderdeel moet worden weggegooid en opnieuw gemaakt. Als de ring niet in de huls schuiven, is er waarschijnlijk vuil in de huls belemmeren van de ferrule. Bij het bevestigen en verwijderen van het snoer van het implantaat moet kracht uitgeoefend evenwijdig aan de as van het implantaat. Vanwege het feit dat zoogdierweefsel verstrooit licht sterk en relatief lage energie blauw licht het implantaat worden geplaatst dat het uiteinde van de vezel binnen 500 pM van het gebied van belang, waarbij> 10% van de initiële licht vermogensdichtheid blijft 6. Tijdens implantatie de basislaag van tandheelkundige cement is de belangrijkste stap, aangezien het deze laag dat het implantaat bepaalt de cranium. De volgende lagen beveiligen het implantaat met de basislaag en beschermt. De basislaag wordt niet goed hecht als de schedel niet volledig droog, als een sectie niet goed gehecht, is het waarschijnlijk dat manipulatie van de muis loskomt het gehele implantaat. Als alternatief kan ankers voor de tandheelkundige cement worden vastgeschroefd in de schedel voor een veiliger inrichting.

In gedragsstudies, extern licht lek kan een onbedoelde cue te bieden aan de muis. Buitenlicht lekkage waarschijnlijk optreden bij de verbinding tussen het implantaat en snoer van direct boven de muis. Om lichtlek minimaliseren, kan de krimpkous worden uitgebreid zodat deze volledig de ferrule huls omvat om extra afscherming bieden tegen lekkage. Als deze optie wordt nagestreefd, de krimpkous zal het venster in de hoes die visuele feedback zorgt voor direct contact tussen adereindhulzen en contact dient zodanig te worden vastgesteld met tactiele vergoedingdback.

Tot verdere ontwikkeling van deze techniek is het mogelijk om meerdere glasvezel implanteren op een muis gebruikt extra stereotactische armen, zoals beschreven in Sparta et al. 8. Hierdoor zou meer complexe studies door verschil golflengte stimulatie in dezelfde regio in een tijdelijk specifieke wijze of simultane stimulatie van verschillende regio's. Bovendien kan glasvezel worden gekoppeld met elektroden (optrode) in vivo elektrofysiologie voor lokale stimulatie als opname.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

We willen bevestigen dat deze techniek oorspronkelijk beschreven door Sparta et al.., 2012 en is gemakkelijk worden aangepast voor gebruik in ons laboratorium.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LC Ferrule Sleeve Precision Fiber Products (PFP) SM-CS125S 1.25 mm ID
FC MM Pre-Assembled Connector PFP MM-CON2004-2300 230 μm Ferrule
FC MM Pre-Assembled Connector PFP MM-CON2004-2300 230 μm Ferrule
Miller FOPD-LC Disc PFP M1-80754 For LC ferrules
Furcation tubing PFP FF9-250 900 μm o.d., 250 μm i.d.
MM LC Stick Ferrule 1.25 mm PFP MM-FER2007C-1270 127 μm ID Bore
MM LC Stick Ferrule 1.25 mm PFP MM-FER2007C-2300 230 μm ID Bore
Heat-curable epoxy, hardener and resin PFP ET-353ND-16OZ
FC/PC and SC/PC Connector Polishing Disk ThorLabs D50-FC For FC ferrules
Digital optical power and Energy Meter ThorLabs PM100D Spectrophotometer
Polishing Pad ThorLabs NRS913 9" x 13" 50 Durometer
Aluminum oxide Lapping (Polishing) Sheets: 0.3, 1, 3, 5 μm grits ThorLabs LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P
Standard Hard Cladding Multimode Fiber ThorLabs BFL37-200 Low OH, 200 μm Core, 0.37 NA
Fiber Stripping Tool ThorLabs T10S13 Clad/Coat: 200 μm / 300 μm
SILICA/SILICA Optical Fiber Polymicro Technologies FVP100110125 High -OH, UV Enhanced, 0.22 NA
1x1 Fiberoptic Rotary Joint doric lenses FRJ_FC-FC
Mono Fiberoptic Patchcord doric lenses MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC
Heat shrink tubing, 1/8 inch Allied Electronics 689-0267
Heat gun Allied Electronics 972-6966 250 W; 750-800 °F
Cotton tipped applicators Puritan Medical Products Company 806-WC
VetBond tissue adhesive Fischer Scientific 19-027136
Flash denture base acrylic Yates Motloid ColdPourPowder+Liq
BONN Miniature Iris Scissors Integra Miltex 18-1392 3-1/2"(8.9cm), straight, 15 mm blades
Johns Hopkins Bulldog Clamp Integra Miltex 7-290 1-1/2"(3.8 cm), curved
MEGA-Torque Electric Lab Motor Vector EL-S
Panther Burs-Ball #1 Clarkson Laboratory 77.1006
Violet Blue Laser System CrystaLaser CK473-050-O Wavelength: 473 nm
Laser Power Supply CrystaLaser CL-2005
Dumont #2 Laminectomy Forceps Fine Science Tools 11223-20
Probe Fine Science Tools 10140-02
5"Straight Hemostat Excelta 35-PH
Vise with weighted base Altex Electronics PAN381

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neuronal activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
  2. Arenkiel, B. R. In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Trangenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2. Neuron. 54, 205-218 (2007).
  3. Gradinaru, V. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141, 165-16 (2010).
  4. Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
  5. Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy. Nature. 461, 900-907 (2009).
  6. Zhang, F. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).
  7. Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450, 420-424 (2007).
  8. Sparta, D. R. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7, 12-23 (2012).
  9. Stuber, G. D. Excitatory transmission from the amygdala to nucleus accumbens facilitates reward seeking. Nature. 475, 377-380 (2011).
  10. Liu, X. Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall. Nature. 484, 381-385 (2012).

Tags

Neuroscience optogenetics glasvezel implantatie neuronale circuits chronische stimulering
Glasvezel-implantatie voor chronische Optogenetic Stimulatie van hersenweefsel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ung, K., Arenkiel, B. R. Fiber-optic More

Ung, K., Arenkiel, B. R. Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue. J. Vis. Exp. (68), e50004, doi:10.3791/50004 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter