Summary
Le développement de optogénétique offre désormais les moyens de stimuler les neurones génétiquement précisément définies et les circuits, les deux
Abstract
Modèles élucider de connectivité neuronale a été un défi pour les neurosciences cliniques et fondamentales. Électrophysiologie a été l'étalon-or pour l'analyse des tendances de la connectivité synaptique, mais paires enregistrements électrophysiologiques peuvent être à la fois lourd et expérimentalement limitant. Le développement de optogénétique a mis en place une méthode élégante pour stimuler les neurones et les circuits, à la fois in vitro et in vivo 1 2,3. En exploitant un type de cellule activité de promoteur pour diriger l'expression spécifique dans opsine populations neuronales distinctes, on peut justement stimuler génétiquement définies dans les sous-types de neurones circuits distincts 4-6. Méthodes bien décrites pour stimuler les neurones, y compris la stimulation électrique et / ou des manipulations pharmacologiques, sont souvent un type de cellule aveugle, invasive, et peut endommager les tissus environnants. Ces limitations pourraient altérer la fonction synaptique normale et / ou le comportement du circuit. En outre, en raisonde la nature de la manipulation, les méthodes actuelles sont souvent aigu et le terminal. Optogénétique donne la capacité de stimuler les neurones d'une manière relativement inoffensifs, et dans les neurones génétiquement ciblées. La majorité des études portant sur optogénétique vivo actuellement utiliser une fibre optique guidée à travers une canule implantée 6,7, mais les limites de cette méthode sont notamment le tissu cérébral endommagé par insertion répétée d'une fibre optique, et la rupture potentiel de la fibre à l'intérieur de la canule. Étant donné le domaine florissant de optogénétique, une méthode plus fiable de la stimulation chronique est nécessaire pour faciliter études à long terme avec des dommages collatéraux tissulaire minimale. Ici nous fournissons notre protocole modifié comme article de vidéo pour compléter la méthode efficace et élégamment décrit à Sparte et al. 8 pour la fabrication d'un implant de fibre optique et sa fixation permanente sur le crâne de souris anesthésiées, ainsi que le montage de la fibrecoupleur optique connectant l'implant à une source de lumière. L'implant, reliés par des fibres optiques à un laser à semi-conducteur, permet une méthode efficace pour photostimulate fonctionnelle chronique circuits neuronaux avec moins de dommages des tissus 9 à l'aide de petites attaches amovibles,. Fixation permanente des implants fibre optique offre cohérente et à long terme dans des études in vivo optogenetic des circuits neuronaux en éveil, les souris se comportent 10 avec lésion tissulaire minime.
Protocol
* Tous les matériaux ainsi que des fabricants respectifs et / ou des vendeurs sont indiqués ci-dessous le protocole.
1. Assemblée de l'implant
- Préparer un mélange d'époxy thermodurcissable à fibre optique en ajoutant 100 mg de durcisseur pour 1 g de résine.
- Mesurer et couper environ 35 mm de fibre de 125 um optique d'un noyau 100 um en le marquant avec un scribe de coin pointe au carbure. Placez le scribe perpendiculaire à la fibre optique et le score dans un seul mouvement unidirectionnel. Couper la fibre complètement endommager le cœur de la fibre.
- Insérez une céramique LC Embouts de 127 um portaient dans l'étau, côté convexe pointé vers le bas.
- Insérer la fibre optique dans la ferrule. La fibre optique doit glisser doucement et légèrement saillie au-delà de l'extrémité convexe de la virole (figure 1a).
- Appliquez une goutte d'époxy thermodurcissable fibre optique à l'extrémité plate et de chaleur avec un pistolet thermique jusqu'à époxy devient noir. L'époxy doitremplir la virole lorsqu'elle est chauffée et avant le durcissement. L'époxy doit remédier dans ~ 1 min d'application de chaleur constante.
- Enlever la résine époxy le long des côtés de la virole, comme cela entrave l'interfaçage avec le coupleur.
- Polir l'extrémité convexe de la ferrule à l'aide d'un disque de polissage LC fibre optique (FOPD) sur des feuilles de polissage d'oxyde d'aluminium sur la pastille de polissage (figure 1b). Rendre les modes de rotation circulaire et polir sur quatre niveaux dans l'ordre suivant: 5, 3, 1 0,3 um grain.
- Couper la fibre optique à l'extrémité plane de la longueur appropriée de telle sorte qu'il vise la région d'intérêt. La longueur peut être déterminée à l'aide de l'atlas stéréotaxique.
- Tester l'implant en le connectant au laser par l'intermédiaire du cordon d'accouplement décrit ci-dessous. L'extrémité polie de l'implant est inséré dans le manchon du raccord et doit entrer en contact direct avec la virole opposée. L'implant doit être capable de maintenir 10 mW de puissance lumineuse, mesurée à l'extrémité de eFibre implant e. Un implant mauvaise aura un point faible focale près de l'extrémité de la fibre optique.
- Stocker les implants finis (figure 1c) en mousse jusqu'à leur utilisation.
2. Assemblée du cordon Coupleur fibre optique
- Préparer un mélange d'époxy thermodurcissable à fibres optiques comme ci-dessus.
- Mesurer et couper une longueur appropriée de 220 fibres optiques avec 200 um um coeur en le marquant avec un scribe de coin pointe au carbure. La longueur de la fibre devrait permettre la souris pour se déplacer librement dans le boîtier, mais ne permet pas la souris à mâcher à travers la fibre.
- Insérer la fibre optique dans une longueur de tube de furcation légèrement plus longue que la longueur de fibre optique. Le tube doit avoir un diamètre intérieur légèrement plus grand que la fibre optique.
- Bande de ~ 25mm à une extrémité de la fibre optique et l'insérer dans le bout de métal d'un MM multimode FC Ferrule Assemblée avec 230 um portait jusqu'à ce qu'il s'arrête. La fibre optique ne doit dépasser à travers le ferrufin le (Figure 2a).
- Fixez le cadre de cyanoacrylate (super glue) à la fin de métal. Couvrir la connexion avec un connecteur d'amorçage et de polir l'extrémité de la férule d'un FOPD FC. Rendre les modes de rotation circulaire et à polir sur quatre niveaux dans l'ordre suivant: 5, 3, 1, 0,3 um (Figure 2b) grain.
- Enlever et insérer l'autre extrémité de la fibre optique dans un embout en céramique LC (230 um Identifiant du trou) avec l'extrémité distale convexe. Appliquer une goutte d'époxy à l'extrémité plate et de la chaleur jusqu'à la guérison.
- Polir l'extrémité convexe de la virole à l'aide d'un FOPD FC sur des feuilles d'oxyde d'aluminium polissage comme décrit ci-dessus.
- Glisser un manchon LC embout sur l'extrémité convexe de la virole jusqu'à ce que le point médian de la douille.
- Lieu tube thermo-rétractable sur le tube et le manchon furcation et la chaleur de sécuriser et de protéger la connexion (figure 2c).
- Tester le coupleur en le connectant à la source laser et la mesure de la lumière outpUT à travers le coupleur avec un spectrophotomètre. La perte de lumière entre la sortie du laser et le coupleur de sortie mesurée ne doit pas dépasser 30%.
3. Implantation chirurgicale
* Il s'agit d'une procédure conseils uniquement. Instruments sont stériles mais les gants n'ont pas besoin d'être dus à la manipulation constante entre les instruments et les équipements.
- Anesthésier la souris avec une injection de kétamine / xylazine mélange intrapéritonéale 100 et 10 mg / kg, respectivement, à l'aide d'une aiguille de calibre 30.
- Raser le cuir chevelu avec une tondeuse. Essuyez le cuir chevelu avec de l'alcool isopropylique à 70%, suivi par Betasept essuyer (solution de chlorhexidine 4%) pendant deux minutes, en répétant une fois.
- Placez la souris dans la plate-forme sterotaxic et fixer la tête, faire en sorte que le crâne est de niveau. Appliquer une pommade ophtalmique pour les yeux pour éviter le dessèchement et la douleur postopératoire. Maintenir l'anesthésie à l'aide volatilisés isoflurane (1-3% dilué avec de l'oxygène en fonction de l'état physiologique du mousoi, qui doit être contrôlé en permanence par la réponse à un pincement de la queue).
- Pratiquer une incision à travers la ligne médiane du cuir chevelu, l'exposition de la boîte crânienne de l'orbite des yeux de lambda. Écarter le tissu conjonctif, si nécessaire.
- Utilisez des pinces Serafin pour retenir la peau et maintenir un accès au crâne (figure 3a).
- Graver un motif en damier sur toute la surface du crâne avec un cure-dent. Laver les débris avec une solution saline stérile. Séchez soigneusement.
- Appliquer le peroxyde d'hydrogène (3%) de la boîte crânienne exposée avec un coton-tige pour ~ 2-3 sec pour créer des micropores. Laver plusieurs fois et séchez soigneusement. En variante, les ancres peut être vissé dans la boîte crânienne, comme décrit dans Sparte et al. (2012).
- Encore une fois, graver un motif en damier à travers le crâne avec un cure-dent et se laver les débris avec une solution saline. Séchez soigneusement.
- L'utilisation d'un outil rotatif, faire un petit trou de trépan craniotomie (<1 mm de diamètre) avec une mèche stérile(Autoclave) au-dessus de la région d'intérêt, déterminée par l'atlas stéréotaxique calibré pour bregma et lambda. Attention à ne pas casser la dure-mère ou endommager les tissus. Laver et sécher soigneusement les débris.
- Insérez l'embout de fibre optique (implant) dans le support de sonde et raccorder au bras stéréotaxique.
- Positionner l'implant en place au dessus de la région d'intérêt à l'aide du bras stéréotaxique (figure 3b). Si l'insertion de la fibre optique dans le tissu cérébral, la fibre doit être avancé à une vitesse lente d'environ 2 mm / min. La virole doit reposer sur le crâne restant.
- Préparer un mélange de ciment dentaire. Le mélange doit avoir une viscosité suffisamment basse pour appliquer facilement à travers le crâne. Le mélange sera utilisable pendant 2-4 min.
- À l'aide d'un cure-dent stérile, appliquer une couche mince et uniforme de ciment dentaire à travers le crâne et sur la partie inférieure de l'implant. La couche de base de ciment dentaire devrait couvrir la surface aussi bien sur le crâne commepossible. Ne pas laisser le ciment dentaire entrer en contact avec la peau de la souris. Cela conduira à une difficulté accrue à suturer ainsi que l'irritation de la souris. Si le ciment dentaire ne viennent en contact avec la peau, lui permettre de sécher partiellement de telle sorte que l'ensemble de la couche de ciment peut être enlevée avant le réglage.
- Laissez sécher complètement.
- Appliquer couches régulières de ciment dentaire pour former un petit monticule sur le crâne et autour de l'implant, permettant à chaque couche sécher complètement (Figure 3c). Laisser ~ 3-5 mm de l'extrémité convexe de la virole propre de ciment pour permettre à une surface lisse, sans obstruction de connexion.
- Suturer le cuir chevelu au niveau de la motte de ciment dentaire et autour de l'implant en utilisant des sutures stériles, à usage unique de soie tressés (6-0) avec une aiguille de C22. Retirer au bout de 7 jours. En option: Bond Vet utilisation pour la liaison supplémentaire après la suture. Assurez-vous d'utiliser Bond Vet minime. Excès peut conduire à de graves lésions cutanées dues au grattage.
- IMMÉDIATEMENTY après la chirurgie, la souris doit être injecté par voie sous cutanée avec Ketprophen (5 mg / kg) afin de diminuer la douleur post-opératoire. Cela devrait être répété 24 heures plus tard. Appliquer analgésiques topiques (bupivicaïne) et des antibiotiques (Neosporin) à la peau suturée et autour de la base de l'implant.
- Placez la souris dans une cage sur une couverture chauffante pour la récupération de l'anesthésie. Placez la souris dans une solution stérile, cage de récupération post-opératoire. La cage de récupération ne doit pas contenir toute la literie, afin de maintenir la température et éviter l'asphyxie. La souris peut être retourné à la cage d'origine ou une nouvelle cage une fois éveillés.
Un assemblage correct de l'implant à fibres optiques et les résultats de coupleur à la perte de photons minimale entre la source lumineuse et l'extrémité de la fibre optique dans la région d'intérêt. Fibre optique bien polis doit transmettre la lumière de façon uniforme, cercle concentrique (figure 2d). Avec l'implantation attention et la suture, l'implant ne provoque aucune irritation visiblela souris et peut rester en place pour études à long terme (Figure 3d,> 1 mois, observations non publiées) sans aucune dégradation significative de la fibre optique ou la quantité de lumière transmise. L'implantation incorrecte ou suture peut causer une irritation et peut entraîner chez la souris gratter grâce à son cuir chevelu, ce qui expose le ciment dentaire, ou la rupture de l'embout du ciment dentaire due à la manipulation persistante. Un schéma de principe du système assemblé peut être vu dans la figure 4.
Figure 1. Assemblée de la fibre optique implantables. (A) La fibre optique est insérée dans la virole, légèrement en saillie au-delà de l'extrémité convexe indiqué par la flèche. (B) l'extrémité convexe de la virole est polie à l'aide d'un FOPD sur les catégories de plus en plus fines feuilles de polissage. (C) L'opt fini fibre implantableic. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2. Assemblée de coupleur de fibres optiques utilisés pour attacher la fibre optique joint rotatif à l'implant. Collage de fibre (A) optique à travers l'ensemble d'embout. (B) Le côté virole de l'ensemble est inséré dans les classes FOPD et polie à l'aide de plus en plus fines papier à polir. (C) La virole manchon est monté sur la virole et fixés avec gaine thermorétractable. (D) Le coupleur de fibres optiques terminé doit produire une lumière concentrique avec perte minimale de photons.
Figure 3. L'implantation chirurgicale de la fibre optique. (A) La surface totale de la cranium est exposé et le tissu conjonctif est effacé. (B) L'implant fibre optique est maintenue en position avec le bras stéréotaxique. (C) du ciment dentaire est appliquée fixer l'implant à fibre optique à la boîte crânienne. (D)> 1 mois après l'implantation, la peau a cicatrisé autour de l'implant et il n'ya aucun signe d'irritation.
Figure 4. Schéma de principe du système fonctionnel
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Discussion
Optogénétique est une technique puissante qui permet un contrôle sans précédent sur les sous-types neuronaux spécifiques. Cela pourrait être exploité afin de moduler les circuits neuronaux avec une précision anatomique et temporelle, tout en évitant le dénigrement de type cellulaire et des effets envahissants de la stimulation électrique à travers une électrode. L'implantation de la fibre optique permet cohérente, la stimulation chronique des circuits neuronaux au cours de plusieurs sessions en éveil, de se comporter souris avec un minimum de dommages aux tissus. Ce système, à l'origine mis au point par Sparte et al. 8 et modifiés pour s'adapter à nos besoins, va encore plus loin la canule implantée et fixe la fibre optique en place dans la région d'intérêt afin d'assurer la cohérence des objectifs entre les sessions en études à long terme. Les implants peuvent être adaptés pour stimuler différentes régions du cerveau.
Diverses étapes de cette méthode nécessitent la précision et le souci du détail. Chaque jonction de couplage de fibres optiques estnécessairement polie pour assurer un minimum de perte de lumière. Après le polissage, les extrémités doivent être examinés au microscope afin de vérifier qu'il n'ya pas de dommages au cœur de la fibre. Si la perte de lumière entre la source et la sortie mesurée est supérieure à 30%, chaque partie doit être repoli pour permettre le flux de photons maximum ou la partie doit être jeté et refait. Si la virole ne glisse dans le manchon, il est probable débris à l'intérieur du manchon obstruant la virole. Lors de la fixation et le retrait du cordon du coupleur à l'implant, la force doit être appliquée directement parallèlement à l'axe de l'implant. En raison du fait que le tissu de mammifère et disperse la lumière fortement l'énergie relativement basse de la lumière bleue, l'implant doit être positionné de telle sorte que la pointe de la fibre est à l'intérieur de 500 um de la région d'intérêt, où> 10% de la densité de puissance lumineuse initiale persiste 6. Pendant l'implantation, la couche de base de ciment dentaire est une étape cruciale, car c'est cette couche qui fixe l'implant à l'cranium. Les couches suivantes fixer l'implant à la couche de base et fournir une protection. La couche de base n'adhère pas bien si la boîte crânienne n'est pas complètement sec, le cas échéant section n'est pas respectée ainsi, il est probable que la manipulation de la souris se déloger tout l'implant. En variante, les ancres pour le ciment dentaire peut être vissée dans le crâne pour un montage plus sûr.
Dans les études comportementales, fuite de lumière externe peut fournir un signal involontaire à la souris. Fuite de lumière externe est le plus susceptible de se produire au niveau du raccordement entre l'implant et cordon du coupleur directement au-dessus de la souris. Pour limiter les fuites de lumière, le tube flexible rétractable peut être allongée de telle sorte qu'il recouvre complètement la virole manchon supplémentaire pour fournir un blindage contre les fuites. Si cette option est retenue, le tube thermo-rétractable couvrira la fenêtre dans le manchon qui fournit une rétroaction visuelle pour un contact direct entre les viroles et le contact doit être déterminée avec frais tactiledback.
Vers un développement de cette technique, il est possible d'implanter des fibres optiques multiples sur une seule souris en utilisant d'autres bras stéréotaxique, tel que décrit à Sparte et al 8. Cela permettrait des études plus complexes grâce à la stimulation longueur d'onde différentielle dans la même région d'une manière temporellement spécifique ou une stimulation simultanée de différentes régions. En outre, la fibre optique peut être couplé à des électrodes (optrode) pour électrophysiologie in vivo pour la stimulation locale et d'enregistrement.
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Acknowledgments
Nous tenons à souligner que cette technique a été décrite à l'origine par Sparte et al., 2012 et a été facilement adapté pour une utilisation dans notre laboratoire.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LC Ferrule Sleeve | Precision Fiber Products (PFP) | SM-CS125S | 1.25 mm ID |
| FC MM Pre-Assembled Connector | PFP | MM-CON2004-2300 | 230 μm Ferrule |
| FC MM Pre-Assembled Connector | PFP | MM-CON2004-2300 | 230 μm Ferrule |
| Miller FOPD-LC Disc | PFP | M1-80754 | For LC ferrules |
| Furcation tubing | PFP | FF9-250 | 900 μm o.d., 250 μm i.d. |
| MM LC Stick Ferrule 1.25 mm | PFP | MM-FER2007C-1270 | 127 μm ID Bore |
| MM LC Stick Ferrule 1.25 mm | PFP | MM-FER2007C-2300 | 230 μm ID Bore |
| Heat-curable epoxy, hardener and resin | PFP | ET-353ND-16OZ | |
| FC/PC and SC/PC Connector Polishing Disk | ThorLabs | D50-FC | For FC ferrules |
| Digital optical power and Energy Meter | ThorLabs | PM100D | Spectrophotometer |
| Polishing Pad | ThorLabs | NRS913 | 9" x 13" 50 Durometer |
| Aluminum oxide Lapping (Polishing) Sheets: 0.3, 1, 3, 5 μm grits | ThorLabs | LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P | |
| Standard Hard Cladding Multimode Fiber | ThorLabs | BFL37-200 | Low OH, 200 μm Core, 0.37 NA |
| Fiber Stripping Tool | ThorLabs | T10S13 | Clad/Coat: 200 μm / 300 μm |
| SILICA/SILICA Optical Fiber | Polymicro Technologies | FVP100110125 | High -OH, UV Enhanced, 0.22 NA |
| 1x1 Fiberoptic Rotary Joint | doric lenses | FRJ_FC-FC | |
| Mono Fiberoptic Patchcord | doric lenses | MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC | |
| Heat shrink tubing, 1/8 inch | Allied Electronics | 689-0267 | |
| Heat gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 W; 750-800 °F |
| Cotton tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| VetBond tissue adhesive | Fischer Scientific | 19-027136 | |
| Flash denture base acrylic | Yates Motloid | ColdPourPowder+Liq | |
| BONN Miniature Iris Scissors | Integra Miltex | 18-1392 | 3-1/2"(8.9cm), straight, 15 mm blades |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Integra Miltex | 7-290 | 1-1/2"(3.8 cm), curved |
| MEGA-Torque Electric Lab Motor | Vector | EL-S | |
| Panther Burs-Ball #1 | Clarkson Laboratory | 77.1006 | |
| Violet Blue Laser System | CrystaLaser | CK473-050-O | Wavelength: 473 nm |
| Laser Power Supply | CrystaLaser | CL-2005 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | |
| 5"Straight Hemostat | Excelta | 35-PH | |
| Vise with weighted base | Altex Electronics | PAN381 |
References
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