Summary
Utvecklingen av optogenetics ger nu möjlighet att exakt stimulera genetiskt definierade nervceller och kretsar, både
Abstract
Belysa mönster av nervkopplingar har varit en utmaning för både klinisk och grundläggande neurovetenskap. Elektrofysiologi har varit den gyllene standarden för att analysera mönster av synaptiska anslutningar, men parade elektrofysiologiska inspelningar kan vara både besvärligt och experimentellt begränsande. Utvecklingen av optogenetics har infört en elegant metod för att stimulera nervceller och kretsar, både in vitro 1 och in vivo 2,3. Genom att utnyttja celltypspecifik promotoraktivitet för att driva opsin uttryck i diskreta neuronala populationer, kan en stimulera just genetiskt definierade neuronala subtyper i distinkta kretsar 4-6. Väl beskrivna metoderna för att stimulera nervceller, däribland elektrisk stimulering och / eller farmakologiska manipulationer, ofta celltyp urskillningslöst, invasiv, och kan skada omgivande vävnader. Dessa begränsningar kan förändra normal synaptisk funktion och / eller krets beteende. Dessutom, på grundtill arten av manipulation, de nuvarande metoderna är ofta akut och terminal. Optogenetics ger förmågan att stimulera nervceller i ett relativt oskadliga sätt, och i genetiskt riktade neuroner. Majoriteten av studier in vivo optogenetics använder idag en optisk fiber leds genom en implanterad kanyl 6,7, men begränsningar av denna metod innefattar skadad hjärnvävnad med upprepat införande av en optisk fiber, och potentiella brott av fibern inuti kanylen. Med tanke på den spirande området optogenetics, är en mer tillförlitlig metod för kronisk stimulering för att underlätta långtidsstudier med minimal säkerhet vävnadsskada. Här ger vi vår modifierat protokoll som en video artikeln att komplettera förfarandet effektivt och elegant beskrivits i Sparta et al. 8 för tillverkning av en fiberoptisk implantat och dess permanent fixering på kraniet hos bedövade möss, liksom monteringen av fiberoptisk kopplare ansluter implantatet till en ljuskälla. Implantatet, förbunden med optiska fibrer till en solid-state laser, möjliggör en effektiv metod för att kroniskt photostimulate funktionell neuronala kretsar med mindre vävnadsskador 9 med små, avtagbara, tjuder. Permanent fixering av fiberoptiska implantat ger konsekvent och långsiktigt in vivo optogenetic studier av neuronala kretsar i vaken, beter möss 10 med minimal vävnadsskada.
Protocol
* Alla material tillsammans med respektive tillverkare och / eller leverantörer är listade nedan protokollet.
1. Montering av implantat
- Förbered en blandning av värmehärdbar fiberoptisk epoxi genom att tillsätta 100 mg härdare till 1 g harts.
- Mät och kapa ca 35 mm 125 nm fiberoptiska med 100 nm kärna genom att göra poäng det med en kil-spets hårdmetall skriftlärd. Placera skrivaren vinkelrätt mot fiberoptiska och poäng i en enda enkelriktad rörelse. Skära fibern fullständigt skadar fiberkärnan.
- Sätt i en LC keramisk hylsa med en 127 nm buro in vice påpekade konvexa sidan nedåt.
- Sätt fiberoptiska i hylsan. Den fiberoptiska ska glida in smidigt och marginellt skjuta utanför den konvexa änden av hylsan (figur 1a).
- Applicera en droppe värmehärdbara fiberoptisk epoxi till platta änden och värme med värmepistol tills epoxi blir svart. Epoxin börfylla hylsan då den värms och innan härdning. Epoxin ska härda i ~ 1 min av konstant värme ansökan.
- Torka bort alla epoxi längs sidorna av hylsan, eftersom det kommer att förhindra gränssnitt med kopplaren.
- Polera den konvexa änden av hylsan med hjälp av en LC fiberoptisk polering skiva (FOPD) om polering aluminiumoxid blad på polerrondell (Figur 1b). Gör cirkulära rotation mönster och polera på fyra betyg i följande ordning: 5, 3, 1 0,3 um korn.
- Skär den fiberoptiska vid den plana änden till lämplig längd så att den riktar det intressanta området. Längden kan bestämmas med användning av stereotaktiska atlas.
- Testa implantatet genom att ansluta den till lasern via kopplaren sladden som beskrivs nedan. Den polerade änden av implantatet förs in hylsa kopplaren och bör direkt kontakt med den motsatta hylsan. Implantatet ska kunna bibehålla 10 mW ljusavgivning, mätt vid spetsen av the implantat fiber. En dålig implantat kommer att ha en svag brännpunkt nära spetsen av den fiberoptiska.
- Förvara de färdiga implantat (Figur 1c) i skum tills användning.
2. Montering av Fiber Optic Coupler Cord
- Förbered en blandning av värmehärdbar fiberoptisk epoxi enligt ovan.
- Mät och kapa en lämplig längd av 220 um fiberoptisk med 200 um kärna genom poängsättning med en kil-spets karbid skriftlärd. Längden av fibern bör tillåta musen att röra sig fritt runt huset men inte tillåta musen för att tugga igenom fibern.
- Sätt fiberoptiska till en längd av slang Furkation något längre än den optiska fiberns längd. Slangen bör ha en inre diameter som är något större än fiberoptiken.
- Strip ~ 25mm i ena änden av fiberoptiska och sätt in det i metall änden av en Multimode FC MM Ferrule Montering med 230 nm bar tills det tar stopp. Den fiberoptiska bör sticka ut genom ferrule änden (Figur 2a).
- Säkra anslutningen med cyanoakrylat (superlim) i metall slutet. Täck anslutningen med en kontakt Boot och polera hylsan änden med en FC FOPD. Gör cirkulära rotation mönster och polera på fyra klasser i följande ordning: 5, 3, 1, 0,3 um korn (figur 2b).
- Skala och den andra änden av den fiberoptiska till en LC keramisk ferrul (230 | im ID hål) med den konvexa änden distala. Applicera en droppe epoxi till den platta änden och värm tills botad.
- Polera den konvexa änden av hylsan med en FC FOPD på polering aluminiumoxidpartiklar ark såsom beskrivits ovan.
- Skjut en LC hylsa hylsa över den konvexa änden av hylsan tills mittpunkten av hylsan.
- Placera Krympslang över Furkation slangen och hylsan och värme för att säkra och skydda anslutningen (Figur 2c).
- Testa kopplaren genom att ansluta den till laserkällan och mäta ljuset UTGut genom kopplaren med en spektrofotometer. Ljuset förlust mellan laserns utgång och den uppmätta kopplingen utgång bör inte överstiga 30%.
3. Kirurgisk implantation
* Detta är en tips-bara proceduren. Instrument är sterila, men handskar behöver inte bero på ständiga manipulering mellan instrument och utrustning.
- Söva musen med en intraperitoneal injektion Ketamin / Xylazin blandning 100 och 10 mg / kg respektive med en 30-gauge nål.
- Raka hårbotten med Clippers. Torka hårbotten med 70% isopropylalkohol följt av Betasept torka (4% klorhexidin lösning) under två minuter, upprepa en gång.
- Placera musen i sterotaxic rigg och säkra huvudet och se till att skallen är nivån. Applicera oftalmisk salva till ögonen för att förhindra torrhet och postoperativ smärta. Upprätthålla anestesi med förflyktigade isofluran (1-3% utspädd med syre beroende på fysiologiska tillstånd mouse, vilket bör kontinuerligt övervakas av svar på en svans nypa).
- Gör ett snitt genom mittlinjen i hårbotten, exponerar kraniet från ögat banor till lambda. Skjuta undan bindväv vid behov.
- Använd Serafin klämmor för att hålla tillbaka huden och upprätthålla en tillgång till kraniet (figur 3a).
- Etsa ett rutmönster över hela ytan av kraniet med en dental plockning. Tvätta bort skräp med steril saltlösning. Torka ordentligt.
- Applicera väteperoxid (3%) till den exponerade kraniet med en bomullspinne för ~ 2-3 sek för att skapa mikroporer. Tvätta flera gånger och torka ordentligt. Alternativt, kan ankare skruvas in i kraniet, som beskrivs i Sparta et al. (2012).
- Återigen etsa ett rutmönster över hela kraniet med en tand plocka och tvätta bort skräp med saltlösning. Torka ordentligt.
- Med hjälp av en roterande verktyg, gör ett litet borrhål kraniotomi (<1 mm i diameter) med en steril borr(Autoklaverad) ovanför området av intresse, som bestäms av stereotaktisk atlas kalibrerad till bregma och lambda. Var noga med att inte bryta dura eller skada någon vävnad. Tvätta bort skräp och torka ordentligt.
- Sätt den fiberoptiska beslaget (implantat) i sondhållaren och ansluter till det stereotaxiska armen.
- Placera implantatet på plats direkt ovanför området av intresse med användning av stereotaktiska armen (figur 3b). Om införande av optiska fibern i hjärnvävnaden, bör fibern fram långsamt med en hastighet av ~ 2 mm / min. Hylsan ska vila på den återstående kranium.
- Förbered en blandning av tandcement. Blandningen bör ha en tillräckligt låg viskositet för att enkelt tillämpas över hela kraniet. Blandning kommer att vara användbara för 2-4 min.
- Med hjälp av en steril tandpetare, applicera ett tunt, jämnt skikt av tandcement över kraniet och på den nedre delen av implantatet. Basskiktet av dentala cement bör täcka så mycket yta på kraniet sommöjligt. Låt inte tandcement kommer i kontakt med huden hos musen. Detta kommer att leda till ökade svårigheter att suturering samt irritation i musen. Om tandcement inte komma i kontakt med huden, tillåter den att delvis torka så att hela skiktet av cement kan skalas av före inställningen.
- Låt den torka helt.
- Applicera jämna skikt av tandcement att bilda en liten kulle över kraniet och runt implantatet, så att varje skikt torka fullständigt (Figur 3c). Lämna ~ 3-5 mm av den konvexa änden av hylsan rent av cement för att möjliggöra en smidig, obehindrad förbindelse.
- Sutur hårbotten över högen av dentala cement och runt implantatet med sterila engångsprodukter siden flätade suturer (6-0) med en C22-nål. Avlägsna efter 7 dagar. Tillval: Använd Vet Bond för ytterligare bindning efter suturering. Var noga med att använda minimalt Vet Bond. Överskott kan leda till allvarliga hudskador på grund av repor.
- Immediately efter kirurgi bör vara mus subkutant med Ketprophen (5 mg / kg) för att minska postoperativ smärta. Detta bör upprepas 24 timmar senare. Applicera topiska analgetika (Bupivicaine) och antibiotika (Neosporin) till den suturerade huden och runt basen av implantatet.
- Placera musen i en bur under en värmefilt för återhämtning från anestesi. Placera musen i en steril, postoperativ återhämtning bur. Återhämtningen bur får inte innehålla något strö för att upprätthålla temperaturen och undvika kvävning. Musen kan återföras till den ursprungliga buren eller en ny bur gång vaken.
Korrekt montering av den fiberoptiska implantatet och resultat kopplare i minimal förlust fotoner mellan ljuskällan och slutet av den fiberoptiska i regionen av intresse. Välputsade fiberoptik bör sända ljus i ett likformigt, koncentrisk cirkel (figur 2d). Med noggrann implantering och suturering, bringar implantatet ingen synlig irritationmusen och kan förbli på plats för långtidsstudier (figur 3d,> 1 månad, opublicerade observationer) utan någon signifikant försämring av den fiberoptiska eller mängden överfört ljus. Felaktig implantation eller suturering kan orsaka irritation och kan resultera i att mus repor genom sin hårbotten, exponerar tandcement, eller brott av hylsan från den tandcement grund ihållande manipulering. Ett schematiskt diagram av det sammansatta systemet kan ses i figur 4.
Figur 1. Montering av implanterbara fiberoptik. (A) Den fiberoptiska införes i hylsan, marginellt skjuter ut utanför den konvexa änden indikeras av pilen. (B) Den konvexa änden av hylsan är poleras med användning av en FOPD på progressivt finare kvaliteter av polering ark. (C) Den färdiga implanterbara fibern optIC. Klicka här för att se större bild .
Figur 2. Montering av fiberoptiska kopplare används för att tjudra den fiberoptisk roterskarv till implantatet. (A) Fiberoptisk fastnar genom hylsan montering. (B) Hylsan sidan av aggregatet införes i FOPD och polerad med progressivt finare kvaliteter av polering papper. (C) Hylsan hylsan monteras över hylsan och fästes med krympslang. (D) Den färdiga fiberoptiska kopplare ska ge en koncentrisk ljus med minimal foton förlust.
Figur 3. Kirurgisk implantation fiberoptiken. (A) hela yta cranium är utsatt och bindväv rensas. (B) Den fiberoptiska implantatet hålls på plats med det stereotaxiska armen. (C) Dental cement appliceras fastställande av fiberoptiska implantatet till kraniet. (D)> 1 månad efter implantation har huden läkt runt implantatet och det finns inga tecken på irritation.
Figur 4. Schematisk beskrivning av funktionssystem
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Optogenetics är en kraftfull ny teknik som gör det möjligt oöverträffad kontroll över specifika neuronala subtyper. Detta kan utnyttjas för att modulera nervbanor med anatomisk och tidsmässig precision, samtidigt som man undviker celltyp urskillningslösa och invasiva effekter av elektrisk stimulering genom en elektrod. Implantation av fiberoptik möjliggör konsekvent, kronisk stimulering av neurala kretsar över flera sessioner i vaken, beter möss med minimal skada på vävnaden. Detta system, som ursprungligen uppfunnen av Sparta et al. 8 och modifieras för att passa våra syften, går ett steg längre än den implanterade kanylen och fixerar fiberoptiska på plats i regionen av intresse att säkerställa en konsekvent inriktning mellan sessioner i långtidsstudier. Implantaten kan anpassas för att stimulera olika regioner i hjärnan.
Olika steg i denna metod kräver precision och känsla för detaljer. Varje korsning av fiberoptisk koppling ärnödvändigtvis polerade för att säkerställa minimal ljusförlust. Efter polering bör ändarna undersökas i mikroskop för att kontrollera att det inte finns någon skada på fiberkärnan. Om ljusförlust mellan källan och den uppmätta produktionen överstiger 30%, ska varje del vara repolished att tillåta maximal fotonflöde eller den del skall kasseras och gjorde om. Om hylsan inte glida in i hylsan, kommer det troligtvis skräp inuti hylsan hindrar hylsan. Vid fastsättning och avlägsnande av kopplaren sladden till implantatet, bör kraften appliceras direkt parallellt med axeln av implantatet. På grund av det faktum att däggdjursvävnad sprider ljus kraftigt och relativt låg energi av blått ljus, bör implantatet placeras så att spetsen på fibern är inom 500 | im i regionen av intresse, där> 10% av ursprunglig ljus effekttäthet kvarstår 6. Under implantation är basen skikt tandcement det kritiska steget, eftersom det är detta skikt som fixerar implantatet till cranium. De efterföljande skikten fästa implantatet till basskiktet och ge skydd. Basskiktet kommer inte vidhäftar väl om kraniet inte är helt torr, om någon sektion inte är vidhäftade väl, är det troligt att manipulering från musen kommer rubba hela implantatet. Alternativt kan ankare för tandcement skruvas in i kraniet för en säkrare fixtur.
I beteendestudier kan externt ljus läcka ger en oavsiktlig kö till musen. Externt ljus läcka är mest sannolikt att uppträda vid anslutningen mellan implantatet och kopplaren sladd direkt över musen. För att minimera Ijusläckage, kan det värme-krympslang vidare förlängas så att den helt täcker hylsan hylsan att ge extra skärmning mot läckage. Om detta alternativ väljs kommer Krympslang täcka fönstret i hylsan som ger visuell feedback för direkt kontakt mellan hylsor och kontakt bör bestämmas med taktil avgiftdback.
Mot vidareutveckling av denna teknik är det möjligt att implantera flera fiberoptik på en enda mus med ytterligare stereotaktiska armar, som beskrivs i Sparta et al 8. Detta skulle göra det möjligt mer komplexa studier genom differentiell våglängd stimulering i samma region på ett tidsmässigt specifikt sätt eller samtidig stimulering av olika regioner. Dessutom kan fiberoptik kopplas med elektroder (optrode) för in vivo-elektrofysiologi för lokal stimulering och inspelning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi skulle vilja att erkänna att denna teknik som ursprungligen beskrevs av Sparta et al. 2012 och har lätt anpassas för användning i vårt labb.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LC Ferrule Sleeve | Precision Fiber Products (PFP) | SM-CS125S | 1.25 mm ID |
| FC MM Pre-Assembled Connector | PFP | MM-CON2004-2300 | 230 μm Ferrule |
| FC MM Pre-Assembled Connector | PFP | MM-CON2004-2300 | 230 μm Ferrule |
| Miller FOPD-LC Disc | PFP | M1-80754 | For LC ferrules |
| Furcation tubing | PFP | FF9-250 | 900 μm o.d., 250 μm i.d. |
| MM LC Stick Ferrule 1.25 mm | PFP | MM-FER2007C-1270 | 127 μm ID Bore |
| MM LC Stick Ferrule 1.25 mm | PFP | MM-FER2007C-2300 | 230 μm ID Bore |
| Heat-curable epoxy, hardener and resin | PFP | ET-353ND-16OZ | |
| FC/PC and SC/PC Connector Polishing Disk | ThorLabs | D50-FC | For FC ferrules |
| Digital optical power and Energy Meter | ThorLabs | PM100D | Spectrophotometer |
| Polishing Pad | ThorLabs | NRS913 | 9" x 13" 50 Durometer |
| Aluminum oxide Lapping (Polishing) Sheets: 0.3, 1, 3, 5 μm grits | ThorLabs | LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P | |
| Standard Hard Cladding Multimode Fiber | ThorLabs | BFL37-200 | Low OH, 200 μm Core, 0.37 NA |
| Fiber Stripping Tool | ThorLabs | T10S13 | Clad/Coat: 200 μm / 300 μm |
| SILICA/SILICA Optical Fiber | Polymicro Technologies | FVP100110125 | High -OH, UV Enhanced, 0.22 NA |
| 1x1 Fiberoptic Rotary Joint | doric lenses | FRJ_FC-FC | |
| Mono Fiberoptic Patchcord | doric lenses | MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC | |
| Heat shrink tubing, 1/8 inch | Allied Electronics | 689-0267 | |
| Heat gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 W; 750-800 °F |
| Cotton tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| VetBond tissue adhesive | Fischer Scientific | 19-027136 | |
| Flash denture base acrylic | Yates Motloid | ColdPourPowder+Liq | |
| BONN Miniature Iris Scissors | Integra Miltex | 18-1392 | 3-1/2"(8.9cm), straight, 15 mm blades |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Integra Miltex | 7-290 | 1-1/2"(3.8 cm), curved |
| MEGA-Torque Electric Lab Motor | Vector | EL-S | |
| Panther Burs-Ball #1 | Clarkson Laboratory | 77.1006 | |
| Violet Blue Laser System | CrystaLaser | CK473-050-O | Wavelength: 473 nm |
| Laser Power Supply | CrystaLaser | CL-2005 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | |
| 5"Straight Hemostat | Excelta | 35-PH | |
| Vise with weighted base | Altex Electronics | PAN381 |
References
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neuronal activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Arenkiel, B. R. In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Trangenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2. Neuron. 54, 205-218 (2007).
- Gradinaru, V. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141, 165-16 (2010).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
- Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy. Nature. 461, 900-907 (2009).
- Zhang, F. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).
- Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450, 420-424 (2007).
- Sparta, D. R. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7, 12-23 (2012).
- Stuber, G. D. Excitatory transmission from the amygdala to nucleus accumbens facilitates reward seeking. Nature. 475, 377-380 (2011).
- Liu, X. Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall. Nature. 484, 381-385 (2012).
