Summary
Lo sviluppo di optogenetics ora fornisce i mezzi per stimolare i neuroni geneticamente definiti con precisione e circuiti, sia
Abstract
Modelli chiarire di connettività neuronale è stata una sfida sia per clinica e di base delle neuroscienze. Elettrofisiologia è stato il gold standard per l'analisi dei modelli di connettività sinaptica, ma accoppiati registrazioni elettrofisiologiche possono essere sia ingombrante e sperimentalmente limitante. Lo sviluppo di optogenetics ha introdotto un metodo elegante per stimolare i neuroni e circuiti, sia in vitro che in vivo 1 e 2,3. Sfruttando cellula-tipo di attività specifica promotore per guidare l'espressione opsin in discrete popolazioni di neuroni, si può stimolare con precisione geneticamente definiti sottotipi neuronali distinti circuiti 4-6. Metodi ben descritti per stimolare neuroni, compresi stimolazione elettrica e / o manipolazioni farmacologiche, sono spesso del tipo cellulare indiscriminata, invasivo, e può danneggiare i tessuti circostanti. Queste limitazioni possono alterare la normale funzione sinaptica e / o di comportamento del circuito. Inoltre, a causaalla natura della manipolazione, i metodi attuali sono spesso acuta e terminale. Optogenetics offre la capacità di stimolare i neuroni in modo relativamente innocuo, e nei neuroni geneticamente mirati. La maggior parte degli studi riguardanti optogenetics in vivo attualmente utilizza una fibra ottica guidato attraverso una cannula impiantata 6,7, tuttavia, le limitazioni di questo metodo includono tessuto cerebrale danneggiato con inserimento ripetuto di una fibra ottica, e una possibile rottura della fibra all'interno della cannula. Dato il campo in rapida crescita della optogenetics, un metodo più affidabile di stimolazione cronica è necessaria per facilitare studi a lungo termine con il minimo danno tissutale collaterali. Qui forniamo il nostro protocollo modificato come video articolo per integrare il metodo efficace ed elegantemente descritto in Sparta et al. 8 per la realizzazione di un impianto in fibra ottica e la sua fissazione permanente sul cranio di topi anestetizzati, così come l'assemblaggio del fibraaccoppiatore ottico collega l'impianto di una fonte di luce. L'impianto, collegato con fibre ottiche ad un laser a stato solido, permette un metodo efficiente per photostimulate cronicamente funzionale circuiteria neuronale con danno tissutale meno 9 utilizzando piccoli, staccabili, cavezze. Fissaggio permanente degli impianti in fibra ottica provvede a mantenere a lungo termine in vivo studi optogenetic di circuiti neuronali in Svegliatevi, topi si comportano 10 con minimo danno tissutale.
Protocol
* Tutti i materiali insieme a rispettivi produttori e / o fornitori sono elencati di seguito il protocollo.
1. Assemblaggio di impianto
- Preparare una miscela di calore epossidica induribile fibra ottica aggiungendo 100 mg di catalizzatore a 1 g di resina.
- Misurare e tagliare circa 35 mm di 125 micron in fibra ottica da 100 micron nucleo segnando con un cuneo scriba punta in metallo duro. Posizionare la perpendicolare scriba alla fibra ottica e punteggio in un unico movimento unidirezionale. Tagliare la fibra completamente danneggiare il nucleo della fibra.
- Inserire una ceramica LC capocorda con un 127 micron hanno sostenuto nel vizio, parte convessa rivolta verso il basso.
- Inserire la fibra ottica nella ghiera. La fibra ottica deve scorrere agevolmente e marginalmente sporgono oltre l'estremità della ferrula convessa (Figura 1a).
- Applicare una goccia di calore-curable epossidica fibra ottica fino alla fine piatto e calore con pistola termica fino epossidica diventa nero. La resina epossidica dovrebberiempire la ferrula come è riscaldata e prima della polimerizzazione. La resina epossidica dovrebbe curare entro ~ 1 minuto di applicazione di calore costante.
- Eliminare eventuali epossidica lungo i lati della ghiera, come sarà ostruire interfacciamento con l'accoppiatore.
- Lucidare l'estremità convessa della boccola con un disco di lucidatura fibra ottica LC (FOPD) su fogli di ossido di alluminio lucidatura sul cuscinetto di lucidatura (Figura 1b). Crea modelli di rotazione circolari e lucidare su quattro gradi nel seguente ordine: 5, 3, 1 0,3 micron grana.
- Tagliare la fibra ottica al termine piatta alla lunghezza appropriata in modo tale che si rivolge alla regione di interesse. La lunghezza può essere determinata utilizzando l'atlante stereotassico.
- Testare l'impianto collegandolo al laser tramite il cavo accoppiatore descritto di seguito. La fine del lucido impianto viene inserito nel manicotto dell'accoppiatore e deve entrare in contatto diretto con il puntale avversaria. L'impianto dovrebbe essere in grado di mantenere 10 mW di luce emessa, misurato alla punta di the fibra dell'impianto. Un impianto bad avrà un punto debole focale vicino alla punta della fibra ottica.
- Conservare gli impianti finiti (Figura 1c) in schiuma fino al momento dell'uso.
2. Assemblea di cavo di fibra ottica accoppiatore
- Preparare una miscela di calore epossidica induribile fibra ottica come sopra.
- Misurare e tagliare un congruo spazio di 220 micron in fibra ottica da 200 micron nucleo segnando con un cuneo scriba punta in metallo duro. La lunghezza della fibra dovrebbe consentire il mouse per muoversi liberamente nel contenitore, ma non consentono il mouse per masticare attraverso la fibra.
- Inserire la fibra ottica in un tratto di tubo di sfioccamento leggermente più lungo della lunghezza della fibra ottica. Il tubo deve avere un diametro interno leggermente maggiore rispetto alla fibra ottica.
- Strip ~ 25mm ad una estremità della fibra ottica e inserirlo nell'estremità di un metallo MM Multimode FC Virola Assembly con 230 micron foro fino all'arresto. La fibra ottica deve sporgere attraverso il ferruLe estremità (Figura 2a).
- Fissare il collegamento con cianoacrilato (colla super) alla fine metallo. Coprire il collegamento con un connettore di avvio e lucidare l'estremità con un puntale FOPD FC. Crea modelli di rotazione circolari e lucidare su quattro gradi nel seguente ordine: 5, 3, 1, 0.3 micron grana (Figura 2b).
- Striscia e inserire l'altra estremità della fibra ottica in ceramico LC ghiera (230 um id foro) con l'estremità distale convessa. Applicare una goccia di resina epossidica per l'estremità piatta e riscaldare fino guarito.
- Lucidare l'estremità della ferrula convessa utilizzando un FOPD FC su fogli di ossido di alluminio lucidatura come descritto sopra.
- Far scorrere un manicotto LC boccola sull'estremità convessa della boccola fino al punto medio del manicotto.
- Inserire una guaina termoretraibile sopra il tubo e il manicotto forcazione e calore per assicurare e proteggere la connessione (Figura 2c).
- Testare l'accoppiatore collegandolo alla sorgente laser e misurando la luce output attraverso l'accoppiatore con uno spettrofotometro. La perdita di luce tra l'uscita e l'uscita laser accoppiatore misurata non deve superare il 30%.
3. Impianto chirurgico
* Si tratta di una sola procedura di consigli. Gli strumenti sono sterili, ma i guanti non hanno bisogno di essere a causa della manipolazione costante tra gli strumenti e le attrezzature.
- Anestetizzare il mouse con una iniezione intraperitoneale ketamina / Xilazina miscela di 100 e 10 mg / kg, rispettivamente usando un ago da 30 gauge.
- Shave il cuoio capelluto con Clippers. Pulire il cuoio capelluto con il 70% di alcool isopropilico seguito da Betasept wipe (soluzione di clorexidina al 4%) per due minuti, ripetendo una volta.
- Posizionare il mouse nella rig sterotaxic e bloccare la testa, in modo che il cranio sia a livello. Applicare pomata oftalmica per gli occhi per prevenire la secchezza e il dolore post-operatorio. Mantenere l'anestesia con isoflurano volatilizzato (1-3% diluito con ossigeno a seconda dello stato fisiologico del mouse, che deve essere continuamente monitorate da risposta ad una presa di coda).
- Praticare un'incisione attraverso la linea mediana del cuoio capelluto, esponendo il cranio dalle orbite oculari per lambda. Spingere da parte del tessuto connettivo, se necessario.
- Utilizzare pinze Serafin per tenere indietro la pelle e mantenere un accesso al cranio (Figura 3a).
- Etch un motivo a scacchi in tutta la superficie del cranio con uno strumento apposito. Lavare via i residui con soluzione salina sterile. Asciugare con cura.
- Applicare il perossido di idrogeno (3%) al cranio esposto con un batuffolo di cotone per ~ 2-3 secondi per creare micropori. Lavare più volte e asciugare accuratamente. In alternativa, possono ancore essere avvitata nel cranio, come descritto in Sparta et al. (2012).
- Anche in questo caso, incidere un motivo a scacchi in tutto il cranio con uno strumento apposito e lavare via i residui con soluzione fisiologica. Asciugare con cura.
- Utilizzando un utensile rotante, fare un piccolo foro bava craniotomia (<1 mm di diametro) con una punta sterile(Autoclave) sopra la regione di interesse, determinato dal atlante stereotassico calibrata bregma e lambda. Fare attenzione a non rompere la dura madre o danneggiare qualsiasi tessuto. Lavare via i residui e asciugare accuratamente.
- Inserire la ghiera fibra ottica (impianto) nel supporto sonda e collegare al braccio stereotassico.
- Posizionare l'impianto in posizione direttamente sopra la regione di interesse utilizzando il braccio stereotassico (Figura 3b). Se si inserisce la fibra ottica nel tessuto cerebrale, la fibra deve essere avanzato lentamente ad una velocità di circa 2 mm / min. La ghiera deve poggiare sul cranio rimanente.
- Preparare una miscela di cemento dentale. La miscela deve avere una viscosità sufficientemente bassa per applicare facilmente attraverso il cranio. Miscela sarà utilizzabile per 2-4 min.
- Utilizzando uno stuzzicadenti sterile, applicare un sottile strato di cemento dentale attraverso il cranio e sulla parte inferiore dell'impianto. Lo strato di base del cemento dentale dovrebbe coprire superficie tanto sul cranio comepossibile. Non lasciare che il cemento dentale venire a contatto con la pelle del topo. Questo porterà a maggiore difficoltà nel suturare così come irritazione al mouse. Se il cemento dentale viene a contatto con la pelle, lasciare asciugare parzialmente tale che l'intero strato di cemento può essere rimosso prima impostazione.
- Lasciare asciugare completamente.
- Applicare anche strati di cemento dentale in modo da formare un piccolo tumulo sul cranio e intorno alla protesi, permettendo ad ogni strato si asciughi completamente (Figura 3c). Lasciare ~ 3-5 mm dell'estremità convessa della ferrula pulita di cemento per consentire un agevole, collegamento senza ostacoli.
- Suturare il cuoio capelluto sopra il tumulo di cemento dentale e intorno all'impianto utilizzando sterili, monouso suture di seta intrecciati (6-0) con un ago C22. Rimuovere dopo 7 giorni. Opzionale: Bond Vet uso per il legame aggiuntivo dopo sutura. Assicurarsi di utilizzare Obbligazioni minima Vet. In eccesso può portare a gravi danni alla pelle a causa di graffi.
- IMMEDIATAMENTEy dopo la chirurgia, mouse dovrebbe essere iniettati sottocute con Ketprophen (5 mg / kg) per ridurre il dolore postoperatorio. Questo dovrebbe essere ripetuta dopo 24 h. Applicare analgesici topici (Bupivicaine) e antibiotici (Neosporin) alla pelle suturata e intorno alla base dell'impianto.
- Posizionare il mouse in una gabbia su una coperta termica per il recupero dall'anestesia. Posizionare il mouse in un contenitore sterile, gabbia di recupero post-operatorio. La gabbia di recupero non deve contenere lettiera per mantenere la temperatura ed evitare asfissia. Il mouse può essere restituito alla gabbia originale o una nuova gabbia una volta sveglio.
Corretto montaggio dell'impianto fibra ottica e risultati accoppiatore in minima perdita di fotoni tra la sorgente luminosa e l'estremità della fibra ottica nella regione di interesse. Ben lucidate fibre ottiche deve trasmettere la luce in modo uniforme, cerchi concentrici (figura 2d). Con l'impianto attento e sutura, l'impianto non provoca irritazioni visibili ail mouse e può rimanere in posizione per studi a lungo termine (figura 3D,> 1 mese, osservazioni non pubblicate) senza alcuna degradazione significativa della fibra ottica o la quantità di luce trasmessa. Impiantazione improprio o sutura può causare irritazione e può comportare il mouse graffiare attraverso la cute, esponendo il cemento dentale, o la rottura della ghiera dal cemento dentale a causa della manipolazione persistente. Un diagramma schematico del sistema assemblato può essere visto in Figura 4.
Figura 1. Assemblea delle fibre ottiche impiantabili. (A) La fibra ottica è inserito nella boccola, leggermente sporgente oltre l'estremità convessa indicata dalla freccia. (B) L'estremità convessa della boccola viene lucidata con una FOPD sulla qualità progressivamente più sottili fogli di lucidatura. (C) La clausola finito fibra impiantabileic. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Assemblea di fibra ottica accoppiatore utilizzato per legare la fibra ottica giunto rotante all'impianto. (A) incollaggio a fibre ottiche attraverso il gruppo ghiera. (B) Il lato ghiera del gruppo è inserito nei gradi FOPD e lucidati usando progressivamente più sottili di carta lucidatura. (C) Il manicotto ghiera è montato sul puntale e fissato con guaina termorestringente. (D) L'accoppiatore fibra ottica finito dovrebbe produrre una luce concentrica con perdita minima fotone.
Figura 3. Impianto chirurgico le fibre ottiche. (A) L'intera superficie del cranium è esposta e tessuto connettivo è azzerato. (B) L'impianto fibra ottica viene tenuto in posizione con il braccio stereotassico. (C) il cemento dentale viene applicata la protesi fissa in fibra ottica al cranio. (D)> 1 mese dopo l'impianto, la guarigione della pelle attorno all'impianto e non ci sono segni di irritazione.
Figura 4. Schema del sistema funzionale
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Discussion
Optogenetics è una tecnica nuova e potente che consente il controllo senza precedenti su specifici sottotipi neuronali. Ciò può essere sfruttato per modulare circuiti neurali con precisione anatomica e temporale, evitando il tipo cellulare e indiscriminata effetti invasivi di stimolazione elettrica attraverso un elettrodo. L'impianto di fibre ottiche permette di coerenza, stimolazione cronica dei circuiti neurali più sessioni in sveglio, comportandosi topi con il minimo danno al tessuto. Questo sistema, originariamente introdotta da Sparta et al. 8 e modificato per adattarsi nostri scopi, va un passo oltre la cannula impiantata e fissa la fibra ottica in luogo nella regione di interesse per assicurare il targeting coerente tra le sessioni in studi a lungo termine. Gli impianti possono essere adattati per stimolare diverse regioni del cervello.
Varie fasi all'interno di questo metodo richiedono precisione e attenzione ai dettagli. Ogni giunzione di fibre ottiche è giuntonecessariamente lucidati per garantire minima perdita di luce. Dopo la lucidatura, le estremità devono essere esaminati al microscopio per verificare che non vi siano danni al nucleo della fibra. Se la perdita di luce tra la sorgente e l'uscita misurata supera il 30%, ogni parte deve essere rilucidato per consentire flusso di fotoni massima o della parte deve essere eliminato e rifatto. Se la ghiera non scorre nel manicotto, è probabile detriti all'interno del manicotto ostruendo la ghiera. Quando si attacca e rimuovendo il cavo accoppiatore all'impianto, forza deve essere applicato direttamente parallela all'asse dell'impianto. A causa del fatto che il tessuto di mammifero luce disperde fortemente e l'energia relativamente bassa di luce blu, l'impianto deve essere posizionato in modo che la punta della fibra è entro 500 micron della regione di interesse, in cui> 10% della densità di potenza di luce iniziale persiste 6. Durante l'impianto, lo strato di base di cemento dentale è la fase critica, in quanto è questo strato che fissa la protesi al cranium. Gli strati successivi fissare l'impianto per lo strato di base e fornire protezione. Lo strato di base non aderirà bene se il cranio non è completamente asciutta; se ogni sezione non è rispettato bene, è probabile che la manipolazione del mouse rimuovere l'intero impianto. In alternativa, ancoraggi per il cemento dentale può essere avvitato nel cranio per un fissaggio più sicuro.
Negli studi comportamentali, perdita di luce esterna può fornire uno stimolo non intenzionale al mouse. Perdita di luce esterna è più probabile che si verifichi il collegamento tra l'impianto e il cavo di accoppiamento direttamente sopra il mouse. Per ridurre al minimo la dispersione della luce, la guaina termoretraibile può essere ulteriormente esteso tale da coprire completamente il manicotto ghiera per fornire ulteriore schermatura contro le perdite. Se questa opzione viene perseguito, la guaina termoretraibile coprirà la finestra nella manica che fornisce un feedback visivo per contatto diretto tra ghiere e il contatto deve essere determinato a pagamento tattiledback.
Verso ulteriore sviluppo di questa tecnica, è possibile impiantare fibre ottiche multiple su un singolo mouse utilizzando ulteriori bracci stereotassiche, come descritto in Sparta et al 8. Ciò consentirebbe studi più complessi attraverso la stimolazione lunghezza d'onda differenziale nella stessa regione in modo temporalmente specifico o stimolazione simultanea di diverse regioni. Inoltre, le fibre ottiche possono essere accoppiati con elettrodi (optrode) per elettrofisiologia in vivo per la stimolazione e la registrazione locali.
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Acknowledgments
Vorremmo riconoscere che questa tecnica è stata originariamente descritta da Sparta et al., 2012 ed è stato facilmente adattato per l'uso nel nostro laboratorio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LC Ferrule Sleeve | Precision Fiber Products (PFP) | SM-CS125S | 1.25 mm ID |
| FC MM Pre-Assembled Connector | PFP | MM-CON2004-2300 | 230 μm Ferrule |
| FC MM Pre-Assembled Connector | PFP | MM-CON2004-2300 | 230 μm Ferrule |
| Miller FOPD-LC Disc | PFP | M1-80754 | For LC ferrules |
| Furcation tubing | PFP | FF9-250 | 900 μm o.d., 250 μm i.d. |
| MM LC Stick Ferrule 1.25 mm | PFP | MM-FER2007C-1270 | 127 μm ID Bore |
| MM LC Stick Ferrule 1.25 mm | PFP | MM-FER2007C-2300 | 230 μm ID Bore |
| Heat-curable epoxy, hardener and resin | PFP | ET-353ND-16OZ | |
| FC/PC and SC/PC Connector Polishing Disk | ThorLabs | D50-FC | For FC ferrules |
| Digital optical power and Energy Meter | ThorLabs | PM100D | Spectrophotometer |
| Polishing Pad | ThorLabs | NRS913 | 9" x 13" 50 Durometer |
| Aluminum oxide Lapping (Polishing) Sheets: 0.3, 1, 3, 5 μm grits | ThorLabs | LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P | |
| Standard Hard Cladding Multimode Fiber | ThorLabs | BFL37-200 | Low OH, 200 μm Core, 0.37 NA |
| Fiber Stripping Tool | ThorLabs | T10S13 | Clad/Coat: 200 μm / 300 μm |
| SILICA/SILICA Optical Fiber | Polymicro Technologies | FVP100110125 | High -OH, UV Enhanced, 0.22 NA |
| 1x1 Fiberoptic Rotary Joint | doric lenses | FRJ_FC-FC | |
| Mono Fiberoptic Patchcord | doric lenses | MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC | |
| Heat shrink tubing, 1/8 inch | Allied Electronics | 689-0267 | |
| Heat gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 W; 750-800 °F |
| Cotton tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| VetBond tissue adhesive | Fischer Scientific | 19-027136 | |
| Flash denture base acrylic | Yates Motloid | ColdPourPowder+Liq | |
| BONN Miniature Iris Scissors | Integra Miltex | 18-1392 | 3-1/2"(8.9cm), straight, 15 mm blades |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Integra Miltex | 7-290 | 1-1/2"(3.8 cm), curved |
| MEGA-Torque Electric Lab Motor | Vector | EL-S | |
| Panther Burs-Ball #1 | Clarkson Laboratory | 77.1006 | |
| Violet Blue Laser System | CrystaLaser | CK473-050-O | Wavelength: 473 nm |
| Laser Power Supply | CrystaLaser | CL-2005 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | |
| 5"Straight Hemostat | Excelta | 35-PH | |
| Vise with weighted base | Altex Electronics | PAN381 |
References
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