Summary
optogeneticsの開発は今正確に遺伝的に定義されたニューロンと回路の両方を刺激するための手段を提供する
Abstract
神経結合の解明パターンは臨床と基礎の両方の神経科学の課題となっている。電気生理学はシナプス接続のパターンを分析するためのゴールドスタンダードとされてきたが、対になった電気生理学的記録は面倒で実験的に制限することの両方が可能。 optogeneticsの開発は 、in vitro および in vivo 1 2,3 の両方で 、神経細胞や回路を刺激するエレガントな方法を導入しています。離散的なニューロン集団でオプシン発現を駆動するために細胞型特異的プロモーター活性を利用することによって、人は正確に別個の回路4-6に遺伝的に定義されたニューロンのサブタイプを刺激することができる。電気刺激および/または薬理学的操作を含むニューロンを刺激するためによく記載されている方法は、多くの場合、侵襲的な細胞型無差別、であり、周囲の組織を損傷することがあります。これらの制限は、正常なシナプス機能および/または回路の動作を変更することがあります。加えて、原因操作の性質のために、現在の方法は、多くの場合、急性および端末です。 Optogeneticsは比較的無害な方法で、遺伝子標的ニューロンに神経細胞を刺激する能力を与える。 生体 optogenetics に関与する研究の大半は現在移植カニューレ6,7を通じて案内光ファイバを使用しますが、この方法の限界は、光ファイバの繰り返し挿入し、カニューレ内部の繊維の潜在的な破損と損傷脳組織が 含まれています。 optogeneticsの急成長分野を考えると、慢性的な刺激のより信頼性の高い方法は、最小限の巻き添え組織の損傷との長期的な研究を促進することが必要である。ビデオの記事は、効果的かつエレガントなスパルタらに記載の方法を補完するとして、ここで我々は修正されたプロトコルを提供します。8は、光ファイバインプラントの作製とその恒久的な固定のために麻酔したマウスの頭蓋と同様、アセンブリの上に繊維光源にインプラントを接続するファイバカプラ。固体レーザへの光ファイバで接続インプラントは、慢性的に少ない組織損傷9は小、取り外し可能な、テザーを用いて機能的な神経回路をphotostimulateする効率的な方法が可能になります。光ファイバーインプラントの永久固定は最小限の組織損傷で目を覚まし、行動マウスにおける神経回路10 の in vivo optogenetic試験において 、一貫した長期を提供しています。
Protocol
それぞれの製造者および/またはベンダーと一緒に*すべての材料は、プロトコルの下に表示されます。
1。インプラントの組み立て
- 樹脂1gに硬化剤100 mgを追加することで、熱硬化性光ファイバエポキシの混合物を準備します。
- メジャーとくさび先端カーバイドスクでそれを得点に100μmコアを持つ光ファイバ125μmファイバーの約35mmを切った。単一、単方向の動きで光ファイバーとスコアにスクライブ垂直に置きます。繊維を切断して完全に光ファイバのコアにダメージを与えます。
- バイスに穴127μmのフェルールのLCセラミックを挿入し、凸側がダウンして指摘した。
- フェルールに光ファイバを挿入します。光ファイバーはスムーズにスライドし、わずかにフェルール（ 図1a）の凸端を越えて突出する必要があります。
- エポキシが黒くなるまで、ヒートガンで平らな端と熱に熱硬化性のエポキシ樹脂の光ファイバの1滴を適用します。エポキシべきそれを加熱して硬化される前にフェルールを埋める。エポキシは、一定の熱アプリケーションの〜1分以内に治す必要があります。
- それはカプラとのインタフェース邪魔になるため、フェルールの側面に沿って任意のエポキシを拭き取ります。
- 研磨パッド上に酸化アルミニウム研磨シート（ 図1b）でLC光ファイバ研磨ディスク（FOPD）を使用して、フェルールの凸端を磨く。円形の回転パターンを作成し、次の順序で4つのグレードに磨く：5、3、10.3μmのグリット。
- それは関心領域を対象としているような適切な長さに平らな端で光ファイバをカットします。長さは脳地図を用いて決定することができる。
- 後述のカプラーコードを介してレーザーに接続することによってインプラントをテストします。インプラントの研磨端は、カプラのスリーブ内に挿入され、対向するフェルールとの直接の接触を行う必要があります。インプラントは番目の先端で測定、光出力10 mWを維持することができるはずeのインプラント繊維。悪いインプラントは、光ファイバの先端付近の弱い焦点を持つことになります。
- 使用するまで泡の完成インプラント（ 図1c）を格納します。
2。光ファイバカプラのコードのアセンブリ
- 上記のような熱硬化性光ファイバエポキシの混合物を準備します。
- くさび先端カーバイドスクでそれを得点に200μmコアを持つ光ファイバ220μmファイバーの適切な長さを測定し、カット。繊維の長さは、マウスが住宅の周りを自由に移動することができますが、マウスがファイバを通じてかむを許すべきではない。
- 光ファイバの長さよりわずかに長い根分岐部のチューブの長さに光ファイバーを挿入します。チューブは光ファイバーよりもわずかに大きい内径を有するべきである。
- ストリップ〜止まるまで230μmのボアと光ファイバの一端に25mmとマルチモードのFC MMの金属端に挿入し、アセンブリをフェルール。光ファイバーはferru通って固執する必要がありますル·エンド（ 図2a）。
- 金属の終わりに（スーパー接着剤）シアノアクリレートとの接続を固定します。コネクタのブーツとの接続をカバーするとFC FOPDとフェルール端面を研磨する。 5、3、1、0.3μmのグリット（ 図2b）は、次の順序で4学年上の円形の回転パターンとポリッシュを行います。
- 遠凸端を有するLCセラミックフェルール（230μmのIDボア）に光ファイバのもう一方の端を取り除き、挿入します。硬化するまで平らな端および熱に対するエポキシのドロップを適用します。
- 上記のように酸化アルミニウムの研磨シートでFC FOPDを使用して、フェルールの凸端を磨く。
- スリーブの中点までフェルールの端の上に凸のLCフェルールスリーブをスライドさせます。
- 場所、熱収縮チューブと分岐接続（ 図2c）を確保し、保護するスリーブと熱上のチューブを。
- レーザ光源に接続し、光OUTPを測定することによりカプラをテスト分光光度計を用いてカプラを介してUT。レーザー出力と測定されたカプラ出力との間の光損失は30％を超えてはならない。
3。外科的移植
*これはヒントのみの手順です。 Instrumentsは、滅菌されているが、手袋は器具および装置との間に一定の操作に起因している必要はありません。
- 30ゲージの針を用いてそれぞれ腹腔内注射をケタミン/キシラジン混合物100及び10 mg / kgでマウスを麻酔。
- バリカンで頭皮を剃る。 Betasept続いて70％イソプロピルアルコールで頭皮を拭い回繰り返し、2分間（4％クロルヘキシジン溶液）を拭きます。
- sterotaxicリグにマウスを置き、頭部を固定し、頭蓋骨が水平であることを保証します。乾燥や術後の痛みを防ぐために、目に眼軟膏を適用します。畝の生理状態に応じて酸素で希釈揮発イソフルラン（1〜3％を使用して麻酔を維持連続テールピンチへの応答）によって監視されるべきであるSE、。
- ラムダにある目の軌道から頭蓋を露出させ、頭皮の正中線を通って切り込みを入れる。必要に応じて結合組織を押し退ける。
- 肌を抑えて頭蓋（ 図3a）へのアクセスを維持しセラフィン·クランプを使用しています。
- デンタルピックと頭蓋の表面全体にエッチ市松模様。滅菌生理食塩水を離れて破片を洗ってください。徹底的に乾燥させます。
- 微細孔を作成するために〜2-3秒間綿棒で露出した頭蓋に過酸化水素（3％）を適用します。複数回洗い、よく乾かします。スパルタらで説明したように別の方法として、アンカーは、頭蓋にねじ込むこともできます。 （2012）。
- 繰り返しになりますが、歯のピックと頭蓋全体に市松模様のエッチングと食塩水で残骸を洗い流す。徹底的に乾燥させます。
- 回転工具を用いて、滅菌ドリルビット小さな穿頭孔開頭術（直径<1 mm）を作る（オートクレーブ）関心領域の上に、ブレグマとラムダに校正脳地図によって決定されます。硬膜を壊すか、または任意の組織に損傷を与えないように注意してください。破片を離れて洗い、よく乾かします。
- プローブホルダーに光ファイバーフェルール（インプラント）を挿入し、定位アームに接続します。
- 直接定位アーム（ 図3b）を使用して、関心領域の上に所定の位置にインプラントを置きます。脳組織内の光ファイバを挿入した場合、繊維は約2 mm / minの速度でゆっくりと進めなければならない。フェルールは、残りの頭蓋上にくるようにします。
- 歯科用セメントの混合物を準備します。混合物は容易に頭蓋全体に適用されるのに十分低い粘度を持っている必要があります。混合物は2-4分間使用可能になります。
- 滅菌つまようじを使用して、頭蓋全体およびインプラントの下部への歯科用セメントの薄い均一な層を適用します。として歯科用セメントのベース層は、頭蓋にできるだけ多くの表面積をカバーすべきである可能。歯科用セメントは、マウスの皮膚に接触させないでください。これは、増加した縫合の難しさだけでなく、マウスへの刺激につながる。歯科用セメントが皮膚に接触しない場合、それは部分的にセメントのレイヤー全体が設定する前に剥離することができるように乾燥することができます。
- それが完全に乾燥することができます。
- それぞれの層は（ 図3c）完全に乾燥させ、頭蓋の上、インプラントの周りの小さなマウンドを形成するために、歯科用セメントの偶数層を適用します。滑らかで、遮るもののない接続を可能にするためにセメントのきれいなフェルールの凸端の約3〜5 mmのままにしておきます。
- 歯科用セメントのマウンドの上およびC22針付き滅菌の単回使用絹編組縫合糸（6-0）を使用して、インプラントの周りに頭皮を縫合。 7日後に削除します。オプション：縫合した後、追加のバインドに使用獣医ボンド。最小限の獣医ボンドを必ず使用してください。過剰は引っかき傷に起因する重篤な皮膚の損傷につながることができます。
- Immediatel手術後のY、マウスの皮下術後疼痛を減少させるためにKetprophen（5 mg / kgの）を注射しなければならない。これは24時間後に繰り返されるべきである。縫合し、皮膚への局所鎮痛薬（Bupivicaine）と抗生物質（ネオスポリン）を適用して、インプラントの根元。
- 麻酔からの回復のための毛布の上にケージにマウスを置きます。滅菌し、術後の回復ケージにマウスを置きます。回復ケージには温度を維持し、窒息を避けるために、どんな寝具を含むべきではありません。マウスは、元のケージまたは一回目が覚めて、新しいケージに戻すことができます。
光源と関心領域内の光ファイバーの端部との間の最小の光子損失の光ファイバインプラントとカプラ結果の適切な組み立て。洗練された光ファイバーは同心円（ 図2d）、均一に光を透過する必要があります。慎重に注入し、縫合では、インプラントは、には目に見える刺激を起こさないマウスや光ファイバーまたは透過する光の量の有意な低下させることなく、長期的な研究（ 図3d、> 1ヶ月、未発表の観察）のための場所に留まることができる。不適切な注入や縫合は炎症を引き起こすことができ、その頭皮を通してスクラッチマウスになる可能性があり、歯科用セメントを露出したり、永続的な操作に起因する歯科用セメントからフェルールの破損。組み立てられたシステムの概略図を図4に示します。
図1：植込み型光ファイバーの組立。 （a）は、光ファイバはわずかに矢印で示す凸端を越えて突出、フェルールに挿入されます。 （b）のフェルールの凸端は、研磨シートの徐々に細かいグレードにFOPDを用いて研磨されています。 （c）に完成した植込み型繊維のオプトインIC。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2：光ファイバカプラの組立は、インプラントにテザーへの光ファイバーロータリージョイントを使用していました。フェルールアセンブリから（a）の光ファイバスティッキング。 （b）は、アセンブリのフェルール側は研磨紙の使用FOPDと洗練徐々に細かいグレードに挿入されます。 （c）のフェルール、フェルールスリーブの上に取り付けられ、熱収縮チューブで固定されています。 （d）を終え、光ファイバカプラは、最小限の光子損失と同心光を生成する必要があります。
図3：外科的移植光ファイバー。 craniuの（a）の全面メートルが露出していると結合組織はクリアされます。 （b）は光ファイバインプラントは、定位固定アーム付き位置に保持されている。 （C）歯科用セメントは、頭蓋に光ファイバを固定するインプラントが適用されます。 （d）は移植後> 1ヶ月、皮膚がインプラントの周囲に治癒したと刺激の兆候はありません。
図4機能的なシステムの概略図
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Discussion
Optogeneticsは、特定の神経細胞サブタイプ上前例のない制御を可能にする強力な新技術です。これは、電極を介して電気刺激の細胞型無差別かつ侵襲の影響を回避しながら、解剖学的および時間的な精度で神経回路を調節するために悪用される可能性があります。光ファイバーの注入は組織への最小限のダメージでマウスを行動、覚醒では、複数のセッションにまたがる神経回路の一貫性があり、慢性的な刺激が可能になります。このシステムは、もともとスパルタらによって開拓され、図8および我々の目的に合わせて修正されたが、移植されたカニューレから一歩進んで、長期的な研究の合間ターゲティング一貫性を保証するために、関心領域の代わりに光ファイバーを修正しています。インプラントは、脳の異なる領域を刺激するように適合させることができます。
このメソッド内で様々な手順が詳細に精度と注意を払う必要があります。光ファイバーカップリングの各接合部がある必ずしも最小限の光損失を確実にするために磨いた。研磨した後、両端がファイバコアに損傷がないことを確認するために、顕微鏡下で検討すべきである。ソースと測定された出力との間の光の損失が30％を超える場合は、それぞれの部分が最大の光子束または一部が破棄されるべき許可し、リメイクしrepolishedされるべきである。フェルールがスリーブにスライドしない場合は、フェルールを妨害スリーブ内側そう残骸があります。取り付け、インプラントにカプラーのコードを抜くときは、力がインプラントの軸に直接並列に適用する必要があります。 、インプラントは、ファイバの先端は関心領域の500μmであり、どこに>初期光パワー密度の10％以内となるように配置されるべきである重く哺乳類の組織を散乱光と青色光の比較的低エネルギーという事実のために6を永続化します 。それはCRANにインプラントを修正し、この層であるとして注入時に、歯科用セメントのベース層は、非常に重要なステップですイウム。後続の層は、基材層にインプラントを確保し、保護を提供します。頭蓋骨が完全に乾いていない場合はベース層は十分に接着しません。どのセクションがよく付着していないなら、それは、マウスからの操作が全体のインプラントを除去すると思われます。あるいは、歯科用セメントのアンカーは、より安全な固定に頭蓋にねじ込むこともできます。
行動の研究では、外光漏れは、マウスへの意図しないキューを提供することがあります。外光漏れが直接マウスオーバーインプラントとカプラーのコードとの間の接続で発生する可能性が最も高い。光漏れを最小限にするために、熱収縮チューブは、さらに、それが完全に漏洩に対する遮蔽を提供するために余分なフェルールスリーブを覆うように拡張することができます。このオプションが追求されている場合は、熱収縮チューブは、触覚料して決定されるべきであるフェルールとコンタクトと直接接触するための視覚的なフィードバックを提供するスリーブの窓をカバーしますDBACK。
スパルタら 8に記載のように、この技術のさらなる発展に向けて、それは、追加の定位武器を使用して単一のマウスに複数の光ファイバを注入することが可能です。これは、一時的に特定の方法または異なる領域の同時刺激で同一地域内の差の波長刺激を介して、より複雑な研究を可能にするでしょう。また、光ファイバは局所刺激および記録のためのin vivo電気生理学におけるための電極（オプトロード）と結合することができる。
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Acknowledgments
我々は、この技術はもともとスパルタら 、2012によって記述されていたと簡単に私たちの研究室での使用に適合されていることを承認したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LC Ferrule Sleeve | Precision Fiber Products (PFP) | SM-CS125S | 1.25 mm ID |
| FC MM Pre-Assembled Connector | PFP | MM-CON2004-2300 | 230 μm Ferrule |
| FC MM Pre-Assembled Connector | PFP | MM-CON2004-2300 | 230 μm Ferrule |
| Miller FOPD-LC Disc | PFP | M1-80754 | For LC ferrules |
| Furcation tubing | PFP | FF9-250 | 900 μm o.d., 250 μm i.d. |
| MM LC Stick Ferrule 1.25 mm | PFP | MM-FER2007C-1270 | 127 μm ID Bore |
| MM LC Stick Ferrule 1.25 mm | PFP | MM-FER2007C-2300 | 230 μm ID Bore |
| Heat-curable epoxy, hardener and resin | PFP | ET-353ND-16OZ | |
| FC/PC and SC/PC Connector Polishing Disk | ThorLabs | D50-FC | For FC ferrules |
| Digital optical power and Energy Meter | ThorLabs | PM100D | Spectrophotometer |
| Polishing Pad | ThorLabs | NRS913 | 9" x 13" 50 Durometer |
| Aluminum oxide Lapping (Polishing) Sheets: 0.3, 1, 3, 5 μm grits | ThorLabs | LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P | |
| Standard Hard Cladding Multimode Fiber | ThorLabs | BFL37-200 | Low OH, 200 μm Core, 0.37 NA |
| Fiber Stripping Tool | ThorLabs | T10S13 | Clad/Coat: 200 μm / 300 μm |
| SILICA/SILICA Optical Fiber | Polymicro Technologies | FVP100110125 | High -OH, UV Enhanced, 0.22 NA |
| 1x1 Fiberoptic Rotary Joint | doric lenses | FRJ_FC-FC | |
| Mono Fiberoptic Patchcord | doric lenses | MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC | |
| Heat shrink tubing, 1/8 inch | Allied Electronics | 689-0267 | |
| Heat gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 W; 750-800 °F |
| Cotton tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| VetBond tissue adhesive | Fischer Scientific | 19-027136 | |
| Flash denture base acrylic | Yates Motloid | ColdPourPowder+Liq | |
| BONN Miniature Iris Scissors | Integra Miltex | 18-1392 | 3-1/2"(8.9cm), straight, 15 mm blades |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Integra Miltex | 7-290 | 1-1/2"(3.8 cm), curved |
| MEGA-Torque Electric Lab Motor | Vector | EL-S | |
| Panther Burs-Ball #1 | Clarkson Laboratory | 77.1006 | |
| Violet Blue Laser System | CrystaLaser | CK473-050-O | Wavelength: 473 nm |
| Laser Power Supply | CrystaLaser | CL-2005 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | |
| 5"Straight Hemostat | Excelta | 35-PH | |
| Vise with weighted base | Altex Electronics | PAN381 |
References
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