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Neuroscience

Implantação de fibra óptica para Estimulação Crônica optogenética do Tecido Cerebral

Published: October 29, 2012 doi: 10.3791/50004

Summary

O desenvolvimento de Optogenetics agora fornece os meios para estimular precisamente neurônios geneticamente definidas e circuitos, tanto

Abstract

Elucidando padrões de conectividade neuronal tem sido um desafio para a neurociência clínica e básica. Eletrofisiologia tem sido o padrão ouro para analisar padrões de conectividade sináptica, mas emparelhados registros eletrofisiológicos pode ser tanto complicado e experimentalmente limitante. O desenvolvimento de Optogenetics introduziu um método elegante para estimular os neurónios e circuitos, tanto in vitro e in vivo 1 2,3. Ao explorar tipo de célula-atividade do promotor específico para dirigir a expressão opsina em discretos populações neuronais, pode-se precisamente estimular geneticamente definidas subtipos neuronais em circuitos distintos 4-6. Métodos bem descritos para estimular os neurônios, incluindo a estimulação elétrica e / ou manipulações farmacológicas, são muitas vezes de células do tipo indiscriminada, invasivo e pode danificar os tecidos circundantes. Estas limitações podem alterar a função sináptica normal e / ou o comportamento do circuito. Além disso, devidoa natureza da manipulação, os métodos actuais são, muitas vezes aguda e terminal. Optogenetics proporciona a capacidade de estimular os neurónios de uma maneira relativamente inócua, e em neurónios alvo geneticamente. A maioria dos estudos in vivo envolvendo em Optogenetics actualmente utilizar uma fibra óptica guiada através de uma cânula implantada 6,7, no entanto, limitações deste método incluem o tecido cerebral danificado com inserção repetida de uma fibra óptica, e quebra potencial da fibra no interior da cânula. Dada a florescente campo de optogenética, um método mais confiável de estimulação crônica é necessária para facilitar estudos de longo prazo com o mínimo de danos colaterais tecido. Aqui nós fornecemos nosso protocolo modificado tal como um artigo de vídeo para complementar o método eficaz e elegante descrito em Sparta et al. 8 para o fabrico de um implante de fibra óptica e a sua fixação permanente sobre o crânio de ratos anestesiados, assim como a montagem do fibraacoplador óptico de ligar o implante a uma fonte de luz. O implante, conectado com fibras ópticas a um laser de estado sólido, permite um método eficiente para cronicamente photostimulate circuito neuronal funcional com menos danos do tecido 9 usando pequenos destacáveis, amarras. Fixação permanente dos implantes de fibra óptica fornece consistentes, a longo prazo, em estudos in vivo optogenética de circuitos neuronais em ratos acordados, comportando 10 a uma lesão tecidual mínima.

Protocol

* Todos os materiais, juntamente com respectivos fabricantes e / ou fornecedores estão listados a seguir o protocolo.

1. Assembleia de Implante

  1. Prepara-se uma mistura de calor epoxi curável de fibra óptica através da adição de 100 mg de endurecedor a 1 g de resina.
  2. Medir e cortar aproximadamente 35 mm de 125 fibra óptica com 100 mM mM núcleo marcando-lo com um escriba carboneto cunha ponta. Posicione o escriba perpendicular à fibra óptica e pontuação em um movimento único unidirecional. Cortando a fibra completamente irá danificar o núcleo da fibra.
  3. Insira uma cerâmica LC ponteira com um 127 mM levavam para o vice, lado convexo apontou para baixo.
  4. Insira o de fibra óptica no ponteira. A fibra óptica deve deslizar suavemente e marginalmente se projetam além do final convexa da ponteira (Figura 1a).
  5. Aplique uma gota de calor curável epóxi fibra óptica para a extremidade plana e calor com a arma de fogo até epóxi fica preta. O epóxi deveencher a virola como ele é aquecido e antes da cura. O epóxi deve curar dentro de ~ 1 min de aplicação de calor constante.
  6. Limpar qualquer epoxi ao longo dos lados da manga, uma vez que irá dificultar a interface com o acoplador.
  7. Polir a extremidade convexa da virola com um disco de polimento LC fibra óptica (FOPD) em folhas de alumínio óxido de polimento sobre a almofada de polimento (Figura 1b). Fazer padrões circulares de rotação e polonês em quatro graus, na seguinte ordem: 5, 3, 1 grão mM 0,3.
  8. Cortar a fibra óptica na extremidade plana com o comprimento adequado de tal forma que tem como alvo a região de interesse. O comprimento pode ser determinado utilizando o atlas estereotáxico.
  9. Testar o implante, ligando-a a laser, através do cabo de acoplamento descrito abaixo. A extremidade polida do implante é inserido na manga do dispositivo de acoplamento e deve entrar directamente em contacto com a virola de oposição. O implante deve ser capaz de manter a 10 mW de saída de luz, medida na extremidade do thfibra implante e. Um implante mau terá um ponto fraco focal próximo da ponta da fibra óptica.
  10. Armazenar os implantes acabados (Figura 1c) de espuma, até utilização.

2. Assembleia de Cabo Acoplador de fibra óptica

  1. Prepara-se uma mistura de calor epoxi curável de fibra óptica como descrito acima.
  2. Meça e corte um comprimento adequado de 220 fibra óptica com 200 mM mM núcleo marcando-lo com um escriba carboneto de cunha ponta. O comprimento da fibra deve permitir que o rato se mover livremente em torno da caixa, mas não permitem que o rato para mastigar através da fibra.
  3. Inserir a fibra óptica para um comprimento de tubagem de furca ligeiramente mais longo do que o comprimento da fibra óptica. O tubo deve ter um diâmetro interior ligeiramente maior do que a da fibra óptica.
  4. Faixa ~ 25mm em uma das extremidades da fibra óptica e inseri-la na extremidade de metal de um MM FC Multimode virola Assembly com 230 uM furo até que pare. A fibra óptica deve ficar fora através da ferrule final (Figura 2a).
  5. Assegurar a ligação com o cianoacrilato (super-cola) na extremidade de metal. Cubra a conexão com um conector de inicialização e polir a final com uma ponteira FOPD FC. Fazer padrões circulares de rotação e polimento em quatro graus na seguinte ordem: 5, 3, 1, 0,3 mM grão (Figura 2b).
  6. Tira e insira a outra extremidade da fibra óptica para uma cerâmica LC virola (230 uM ID furo) com a extremidade distal convexa. Aplicar uma gota de epóxido para a extremidade plana e calor até a cura.
  7. Polir a extremidade convexa da virola com um FOPD FC em folhas de alumínio óxido de polimento como descrito acima.
  8. Deslizar a manga LC virola sobre a extremidade convexa do casquilho até ao ponto médio da manga.
  9. Lugar tubo termorretráctil sobre o tubo de bifurcação e manga e calor para fixar e proteger a ligação (Figura 2c).
  10. Testar o acoplador, ligando-a à fonte de laser e de medição da luz output através do acoplador com um espectrofotómetro. A perda de luz entre a saída do laser e o acoplador de saída medido não deve exceder 30%.

3. Implantação cirúrgica

* Este é um procedimento pontas apenas. Instrumentos são estéreis mas as luvas não precisam ser devido a manipulação constante entre os instrumentos e equipamentos.

  1. Anestesiar o rato com uma injecção intraperitoneal mistura ketamina / xilazina 100 e 10 mg / kg, respectivamente, utilizando uma agulha de calibre 30.
  2. Raspar o couro cabeludo com clippers. Limpar o couro cabeludo, com 70% de álcool isopropílico seguida de Betasept limpar (solução de clorexidina a 4%) durante dois minutos, repetindo-se uma vez.
  3. Posicione o mouse na plataforma sterotaxic e proteger a cabeça, garantindo que o crânio é de nível. Aplicar pomada oftálmica nos olhos para evitar a secura e dor pós-operatória. Manter a anestesia usando% isoflurano (1-3 volatilizados diluído com o oxigênio, dependendo do estado fisiológico do mouse, o qual deve ser continuamente monitorizado por resposta a uma pitada de cauda).
  4. Fazer uma incisão pela linha média do couro cabeludo, expondo o crânio das órbitas oculares de lambda. Afastar do tecido conjuntivo, como necessário.
  5. Use grampos Serafin para segurar a pele e manter um acesso ao crânio (Figura 3a).
  6. Um padrão quadriculado Etch toda a superfície do crânio com uma palheta dental. Lave os detritos com uma solução salina estéril. Seque bem.
  7. Aplicar o peróxido de hidrogénio (3%) ao crânio exposta com uma mecha de algodão para ~ 2-3 segundos para criar microporos. Lave várias vezes e seque bem. Alternativamente, as âncoras pode ser aparafusado na cavidade craniana, como descrito em Sparta et al. (2012).
  8. Novamente, um padrão xadrez etch todo o crânio com uma picareta dental e lavar os detritos com solução salina. Seque bem.
  9. Usando uma ferramenta rotativa, fazer um pequeno orifício de trepanação craniotomia (<1 mm de diâmetro) com uma broca estéril(Autoclavado) acima da região de interesse, determinada pelo atlas estereotáxico calibrado para bregma e lambda. Tenha cuidado para não quebrar a dura ou danificar qualquer tecido. Lave e seque bem os detritos.
  10. Insira a ponteira de fibra óptica (implante) para o suporte da sonda e ligar para o braço estereotáxico.
  11. Posicionar o implante no local directamente acima da região de interesse, utilizando o braço estereotáxico (Figura 3b). Se a inserção da fibra óptica no tecido cerebral, a fibra deve ser avançada lentamente, a uma taxa de ~ 2 mm / min. A ponteira deve descansar no crânio restante.
  12. Prepara-se uma mistura de cimento dentário. A mistura deve ter uma viscosidade suficientemente baixa para aplicar facilmente através do crânio. Mistura será utilizável para 2-4 min.
  13. Utilizando um palito estéril, aplicar uma camada fina e uniforme de cimento dentário através do crânio e para a porção inferior do implante. A camada de base de cimento dental deve cobrir área de superfície, tanto no crânio comopossível. Não deixe que o cimento dental entrar em contacto com a pele do rato. Isto levará a dificuldade acrescida de sutura, bem como irritação para o rato. Se o cimento dental não entrar em contacto com a pele, permitir a secar parcialmente de tal forma que toda a camada de cimento pode ser retirada antes do ajuste.
  14. Deixe-a secar completamente.
  15. Aplicar até mesmo camadas de cimento dentário para formar um pequeno monte por cima do crânio e em torno do implante, permitindo que cada camada secar completamente (Figura 3c). Deixar ~ 3-5 mm da extremidade convexa da ponteira limpa de cimento para permitir uma ligação suave e desobstruído.
  16. Suturar o couro cabeludo sobre o monte de cimento dentário e em torno do implante usando suturas estéreis, de uso único de seda entrançada (6-0) com uma agulha de C22. Remover após 7 dias. Opcional: Bond Vet Uso para ligação adicional após a sutura. Certifique-se de usar de Bond Vet mínimo. O excesso pode levar a danos na pele graves devido a arranhões.
  17. Immediately após a cirurgia, o rato deve ser injectado por via subcutânea com Ketprophen (5 mg / kg) para diminuir a dor no pós-operatório. Isto deve ser repetido 24 horas depois. Aplicar analgésicos tópicos (Bupivicaine) e antibióticos (Neosporin) para a pele suturada e em torno da base do implante.
  18. Posicione o mouse em uma gaiola sobre uma manta de aquecimento para a recuperação da anestesia. Posicione o mouse em uma gaiola estéril, recuperação pós-operatória. A gaiola de recuperação não deve conter qualquer cama a fim de manter a temperatura e evitar a asfixia. O rato pode ser devolvida à gaiola original ou uma nova gaiola uma vez acordado.

Montagem adequada do implante de fibra óptica e os resultados do acoplador na perda de fotões mínima entre a fonte de luz e a extremidade da fibra óptica na região de interesse. Ótica bem polidas fibra devem transmitir a luz em um uniforme, círculo concêntrico (Figura 2d). Com a implantação cuidadosa e sutura, o implante não causa irritação visívelo rato e pode permanecer no lugar por estudos de longo prazo (Figura 3D,> 1 mês, observações não publicadas), sem qualquer degradação significativa da fibra óptica ou da quantidade de luz transmitida. Implantação inadequada ou sutura pode causar irritação e pode resultar no rato arranhões através do seu couro cabeludo, expondo o cimento dentário, ou quebra da ponteira do cimento dental devido à manipulação persistente. Um diagrama esquemático do sistema montado pode ser visto na Figura 4.

Figura 1
Figura 1. Assembleia da fibra óptica implantáveis. (A) A fibra óptica é inserido na manga, ligeiramente saliente para além da extremidade convexa indicada pela seta. (B) A extremidade convexa da virola é polida utilizando um FOPD em graus progressivamente mais finos de folhas de polimento. (C) O opt fibra acabado implantávelIC. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 2
Figura 2. Montagem do acoplador de fibra óptica utilizado para amarrar o conjunto rotativo de fibra óptica para o implante. (A) a aderência fibra óptica através do conjunto ponteira. (B) O lado da virola do conjunto é inserido nos graus FOPD e polidas usando progressivamente mais finas de papel de lustro. (C) A manga ponteira é colocada sobre a manga e fixada com um tubo de retracção térmica. (D) O acoplador de fibra óptica deve terminar produzem uma luz concêntrico com perda mínima de fotões.

Figura 3
Figura 3. Implante cirúrgico das fibras ópticas. (A) A superfície total do cranium é exposta e o tecido conjuntivo é apagada. (B) O implante de fibra óptica é mantida em posição com o braço estereotáxico. (C) de cimento dental é aplicado fixação do implante de fibra óptica ao crânio. (D)> 1 mês após a implantação, a pele tenha cicatrizado em torno do implante e não existem sinais de irritação.

Figura 4
Figura 4. Diagrama esquemático do sistema funcional

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Discussion

Optogenética é uma nova e poderosa técnica que permite o controle sem precedentes sobre subtipos específicos de neurônios. Isto pode ser explorado para modular os circuitos neurais com precisão anatómica e temporal, evitando ao mesmo tempo o tipo de célula indiscriminada e efeitos invasivas de estimulação eléctrica através de um eléctrodo. O implante de fibras ópticas permite uma estimulação consistente e crónica dos circuitos neurais mais sessões múltiplas em desperto, comportando camundongos com danos mínimos para o tecido. Este sistema, originalmente lançada pela Sparta et al. 8 e modificado para atender a nossos propósitos, vai um passo além da cânula implantada e fixa a fibra óptica no lugar na região de interesse para garantir consistente, dirigida entre as sessões de estudos de longo prazo. Os implantes podem ser adaptada para estimular a diferentes regiões do cérebro.

Vários passos dentro deste método exige precisão e atenção aos detalhes. Cada junção de acoplamento de fibra óptica énecessariamente polidas para assegurar a perda de luz mínimo. Após o polimento, as extremidades deve ser examinada sob um microscópio para verificar que não haja danos para o núcleo da fibra. Se a perda de luz entre a fonte ea saída medida exceder 30%, cada parte deve ser repolished para permitir fluxo de fótons máximo ou a parte deverá ser descartado e refeito. Se a ponteira não deslizar para dentro da manga, é provável que os detritos no interior da manga de obstruir a virola. Ao fixar e retirar o cabo de acoplamento ao implante, a força deve ser aplicada directamente em paralelo ao eixo do implante. Devido ao facto de o tecido de mamífero de luz dispersa e fortemente a energia relativamente baixa de luz azul, o implante deve ser posicionado de tal forma que a ponta da fibra está dentro de 500 fim da região de interesse, onde> 10% da densidade de potência inicial de luz persistir 6. Durante a implantação, a camada de base de cimento dentário é o passo crítico, uma vez que é esta camada que fixa o implante no cranium. As camadas subsequentes fixar o implante para a camada de base e proporcionar uma protecção. A camada de base não adere bem se o crânio não está completamente seca, se qualquer secção não é bem aderido, é provável que a manipulação do rato irá desalojar o implante inteiro. Em alternativa, as escoras para o cimento dental pode ser aparafusado na cavidade craniana para uma fixação mais segura.

Em estudos comportamentais, vazamento de luz externa pode fornecer uma sugestão involuntária ao mouse. Vazamento de luz externa é mais provável que ocorra no ponto de ligação entre o implante eo acoplador cabo directamente sobre o rato. A fim de minimizar a perda de luz, o tubo termo-retráctil pode ser ainda mais alargado de tal modo que ela cubra completamente a manga de virola para proporcionar blindagem adicional contra vazamento. Se esta opção for exercida, a tubulação de calor retráteis vai cobrir a janela na manga que fornece feedback visual para o contato direto entre ponteiras e contato devem ser determinados com taxa tátildback.

No sentido do desenvolvimento adicional desta técnica, é possível implantar as fibras ópticas múltiplas em um único rato usando braços estereotáxicas adicionais, como descrito em Sparta et al 8. Isto permitiria estudos mais complexas através da estimulação diferencial de comprimentos de onda na região do mesmo de uma forma temporal específico ou a estimulação simultânea de diferentes regiões. Além disso, as fibras ópticas podem ser acoplados com os eléctrodos (optrode) para in vivo para electrofisiologia estimulação local e gravação.

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Acknowledgments

Gostaríamos de reconhecer que esta técnica foi descrita originalmente por Sparta et al., 2012 e foi facilmente adaptado para uso em nosso laboratório.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LC Ferrule Sleeve Precision Fiber Products (PFP) SM-CS125S 1.25 mm ID
FC MM Pre-Assembled Connector PFP MM-CON2004-2300 230 μm Ferrule
FC MM Pre-Assembled Connector PFP MM-CON2004-2300 230 μm Ferrule
Miller FOPD-LC Disc PFP M1-80754 For LC ferrules
Furcation tubing PFP FF9-250 900 μm o.d., 250 μm i.d.
MM LC Stick Ferrule 1.25 mm PFP MM-FER2007C-1270 127 μm ID Bore
MM LC Stick Ferrule 1.25 mm PFP MM-FER2007C-2300 230 μm ID Bore
Heat-curable epoxy, hardener and resin PFP ET-353ND-16OZ
FC/PC and SC/PC Connector Polishing Disk ThorLabs D50-FC For FC ferrules
Digital optical power and Energy Meter ThorLabs PM100D Spectrophotometer
Polishing Pad ThorLabs NRS913 9" x 13" 50 Durometer
Aluminum oxide Lapping (Polishing) Sheets: 0.3, 1, 3, 5 μm grits ThorLabs LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P
Standard Hard Cladding Multimode Fiber ThorLabs BFL37-200 Low OH, 200 μm Core, 0.37 NA
Fiber Stripping Tool ThorLabs T10S13 Clad/Coat: 200 μm / 300 μm
SILICA/SILICA Optical Fiber Polymicro Technologies FVP100110125 High -OH, UV Enhanced, 0.22 NA
1x1 Fiberoptic Rotary Joint doric lenses FRJ_FC-FC
Mono Fiberoptic Patchcord doric lenses MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC
Heat shrink tubing, 1/8 inch Allied Electronics 689-0267
Heat gun Allied Electronics 972-6966 250 W; 750-800 °F
Cotton tipped applicators Puritan Medical Products Company 806-WC
VetBond tissue adhesive Fischer Scientific 19-027136
Flash denture base acrylic Yates Motloid ColdPourPowder+Liq
BONN Miniature Iris Scissors Integra Miltex 18-1392 3-1/2"(8.9cm), straight, 15 mm blades
Johns Hopkins Bulldog Clamp Integra Miltex 7-290 1-1/2"(3.8 cm), curved
MEGA-Torque Electric Lab Motor Vector EL-S
Panther Burs-Ball #1 Clarkson Laboratory 77.1006
Violet Blue Laser System CrystaLaser CK473-050-O Wavelength: 473 nm
Laser Power Supply CrystaLaser CL-2005
Dumont #2 Laminectomy Forceps Fine Science Tools 11223-20
Probe Fine Science Tools 10140-02
5"Straight Hemostat Excelta 35-PH
Vise with weighted base Altex Electronics PAN381

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References

  1. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neuronal activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
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  10. Liu, X. Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall. Nature. 484, 381-385 (2012).

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Neurociência Edição 68 optogenética fibra ótica a implantação o circuito neuronal estimulação crônica
Implantação de fibra óptica para Estimulação Crônica optogenética do Tecido Cerebral
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Ung, K., Arenkiel, B. R. Fiber-optic More

Ung, K., Arenkiel, B. R. Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue. J. Vis. Exp. (68), e50004, doi:10.3791/50004 (2012).

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