Summary
يوصف أسلوب لمعالجة المواد تجاهل الإنسان الثديية الجراحية. ويمكن تخزين الأنسجة المصنعة، في شكل organoids، مجمدة إلى أجل غير مسمى أو وضعها في الثقافة لنمو طويل الأجل. هذه الطريقة تمكن من فحص تجريبي الإنسان العادي بيولوجيا الخلايا الظهارية، وآثار الاضطرابات الخارجية.
Abstract
دراسة تجريبية لالثديية الإنسان العادي الظهارية السلوك (HMEC) خلية، وكيف يكتسب خصائص الخلايا الطبيعية غير طبيعية، يمكن أن تيسره في نظم الثقافة المختبر بدقة أكبر نموذج في علم الأحياء الجسم الحي. استخدام الإنسان لدراسة مواد مشتقة التمايز الخلوي، والشيخوخة، الشيخوخة، وتخليد أمر مفيد نظرا لكثرة الخلافات الجزيئية كبيرة في هذه الخصائص بين الخلايا البشرية واستخدامها القوارض عادة 1-2. الخلايا الثديية تقديم نموذج مناسب لنظام كميات كبيرة من الأنسجة الطبيعية وغير الطبيعية متوفرة بسبب وتيرة الحد من رأب الثدي وجراحات استئصال الثدي.
الغدة الثديية يتكون من خليط معقد من العديد من أنواع الخلايا متميزة،، الظهارية على سبيل المثال، الدهنية، الوسيطة، البطانية. الخلايا الظهارية هي المسؤولة عن وظيفة الثديية متباينة من الرضاعة،وأيضا أصل الغالبية العظمى من سرطانات الثدي البشرية. وقد وضعنا طرق لمعالجة الغدة الثديية الأنسجة تجاهل الجراحية إلى مكونات نقية الظهارية وكذلك خلايا اللحمة المتوسطة 3. ويمكن تخزين المواد المصنعة المجمدة إلى أجل غير مسمى، أو شرع في الثقافة الأولية. ويتم نقل المواد الجراحية تجاهل إلى المختبر وتشريح يدويا لإثراء الأنسجة التي تحتوي على لالظهارية. الهضم لاحقة من الأنسجة تشريح باستخدام شرائط هيالورونيداز كولاجيناز والمواد اللحمية من ظهائر في الغشاء القاعدي. ويمكن فصل القطع الصغيرة الناتجة من شجرة الظهارية (organoids) من سدى هضمها عن طريق الترشيح متتابعة على الأغشية من حجم المسام الثابتة. اعتمادا على حجم المسام، يمكن الحصول على الكسور التي تتكون من قطعة أكبر الأقنية / السنخية، مجموعات أصغر السنخية، أو الخلايا اللحمية. وقد لاحظنا نمو متفوقة عندما بدأت الثقافات وorganoids بدلا من ديسواحد الخلايا sociated. وضع organoids في استخدام وسائل الإعلام ثقافة حمل منخفضة الإجهاد تدعم النمو على المدى الطويل من HMEC طبيعية مع علامات من أنواع متعددة النسب (، اللمعية ظهاري عضلي، السلف) 4-5. ويمكن الحصول على عدد كاف من خلايا الأنسجة من فرد واحد للسماح باستخدام الفحص التجريبي واسعة دفعات خلية موحدة، وكذلك التحقيق باستخدام أساليب إنتاجية عالية.
وقد استخدمت HMEC مثقف في مجموعة متنوعة واسعة من الدراسات الوبائية التي تبحث في العمليات العادية التي تحكم النمو، والتمايز، والشيخوخة، والشيخوخة، وكيف يتم تغيير هذه العمليات العادية خلال التحول الخالد والخبيثة 4-15،16. ويمكن مقارنة آثار النمو في وجود مواد المصفوفة خارج الخلية، أنواع الخلايا الأخرى، و / أو الثقافة 3D مع النمو على 5،15 البلاستيك. HMEC مثقف، بدءا الخلايا الطبيعية، وتوفير نظام لين العريكة تجريبيا لدراسة العوامل التيقد دفع أو منع الشيخوخة الإنسان والتسرطن.
Protocol
1. معالجة الأنسجة والهضم
- الحصول على الأنسجة الثديية الإنسان كمادة تجاهل من العمليات الجراحية. يمكن الحد من mammoplasties توفير الخلايا الطبيعية أو حميدة؛ fibroadenomas وgynecomastias توفير خلايا حميدة؛ أنسجة الثدي غير السرطانية (الطرفية أو المقابل إلى وجود ورم، أو تحت الجلد) توفير الخلايا التي قد تتراوح من الطبيعي أن تحتوي على حميدة لmicrotumors. ضمان حسن موافقة IRB موجود قبل الحصول على المواد تجاهل. ينبغي أن يعامل جميع المواد بموجب لوائح الممرض ينقلها.
- المواد في حاويات معقمة مكان يحتوي المخزن المؤقت أو وسائل الإعلام (على سبيل المثال متوسطة في 01:01 Dulbecco معدلة النسر وهام في F-12) تستكمل مع 100 U / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، 5 ميكروغرام / مل Fungizone، 50U/ml بوليميكسين B، و 10٪ مصل بقري جنيني، والنقل إلى المختبر في 4 درجات مئوية ويمكن تخزين الأنسجة رأب الثدي أو الحد من شحنها في C ° 4 لمدة 72 ساعة دون أن يؤثر ذلك بشكل كبير سوbsequent الخلية قدرتها على البقاء. قد قطع صغيرة من الأنسجة غير رأب الثدي الحد تتطلب معالجة أكثر الأوامر.
- فصل المناطق الظهارية من المصفوفة اللحمية من الأنسجة الدهنية والأنسجة الضامة والأوعية الدموية باستخدام مزيج من معقمة الملقط، مشرط ومقص. قطع قطعة من النسيج مع مقص ومكان في صحن زجاجي كبير معقم (على سبيل المثال، 150 مم). تشريح بلطف من المناطق الظهارية، والتي تبدو وكأنها خيوط بيضاء جزءا لا يتجزأ من مصفوفة اللحمية اصفرارا، وذلك باستخدام ملقط لعقد المادية ومشرط لكشط بعيدا عن المواد الدهنية بشكل صارخ. لتسهيل عملية الهضم، وقطع الأنسجة الطلائية إلى أجزاء أصغر من 3-4 مم باستخدام المشارط ~ معارضة ومكان في أنبوب اختبار 50 مل. إذا يتم معالجتها كميات كبيرة من الأنسجة، قد تكون هناك حاجة شفرات المشرط الطازجة. إزالة المواد الدهنية من الطبق للتخلص منها وفقا للقواعد المؤسسية.
- في الأنسجة الليفية بشكل كبير (على سبيل المثال، ماس تحت الجلدtectomies مع المرض الشديد فيبروكيستيك)، سيكون هناك أكثر صلابة بيضاء، غير الظهارية المادية. قد يكون من الصعب تشريح خارج الخلايا الظهارية من المصفوفات ليفية من هذا القبيل. ويمكن خفض قطعة كبيرة من المواد الليفية إلى أجزاء أصغر التي هي ~ مم مربع 1-3 في المنطقة وهضمها بشكل منفصل.
- وضع الأنسجة الظهارية تشريح في أنبوب الطرد المركزي المخروطية (50 مل أو 15 مل) مع الأنسجة التي تضم ما لا يزيد عن ثلث حجم الأنبوب. جعل أنبوب يصل إلى حجم كامل، ولم يتبق سوى مساحة صغيرة للسماح الهواء لخلط أثناء التناوب، وذلك باستخدام خليط الهضم الأنسجة (أو ما يعادلها DME/F-12، 10 ميكروغرام / مل الانسولين والمضادات الحيوية على النحو الوارد أعلاه، وتركيز النهائي من 10 FCS٪، 200 كولاجيناز الخام U / مل و 100 هيالورونيداز U / مل.
- أنابيب مكان على محور دوار HulaMixer أنبوب وتدوير 360 درجة بين عشية وضحاها في 8 دورة في الدقيقة في 37 ° C.
- أجهزة الطرد المركزي في 600 XG أنابيب لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف الدهون والمتوسطة في الوفاق التخلصجي لأنظمة المؤسسية.
- تحقق من وجود الانتهاء من عملية الهضم من خلال تمييع قسامة صغيرة من بيليه في المتوسط. الهضم عند اكتمال الفحص المجهري يظهر كتل من الخلايا (organoids) مع الهياكل التي تظهر على نحو سلس الأقنية، السنخية، أو الأقنية السنخية خالية من سدى المرفقة (الشكل 1A). سوف الأنسجة رأب الثدي الحد من عادة لا تزال تظهر سدى المرفقة بعد الهضم ليلة وضحاها، وسوف تحتاج الى مزيد من الوقت الهضم.
- إعادة تعليق بيليه هضمها بشكل غير كامل في الأنسجة الطازجة خليط الهضم وإعادة احتضان-C مع التناوب في ° 37 لمدة ساعة 4-12. كرر الخطوات 1.6 و 1.7. إذا ما زالت غير مكتملة الهضم، إضافة مرة أخرى إلى خليط الهضم بيليه وإعادة احتضان-مع دوران في 37 درجة مئوية خلال الليل. وربما يتم تخفيض تركيز الانزيمات لمنع الإفراط في الهضم بين عشية وضحاها.
- عندما اكتمال عملية الهضم، أجهزة الطرد المركزي في 600 XG أنابيب لمدة 5 دقائق، نضح الملخصأيون المزيج، إعادة تعليق بيليه في المتوسط بالإضافة إلى المضادات الحيوية في أنبوب مل حوالي 15 ml/50، 5 مل أنبوب ml/15.
2. الترشيح وتجميد المواد إستيعاب
- نقل مأخوذة من بيليه معلق على مصفاة معقمة أكثر من 100 ميكرومتر أنبوب 50 مل العقيمة. السماح للاستنزاف المتوسطة في أنبوب، ثم rewash organoids على 1-2X مرات أعلى مع 2-3 مل من المتوسط. تكرار حتى يتم نقل كل من بيليه معلق. إذا كان هناك عدد كبير جدا من organoids على مرشح والمتوسطة لم تعد المصارف بسهولة، استخدم فلتر جديد ل المواد المتبقية. الوجه بعناية إعداد (إعدادات) على رأس أنبوب آخر معقمة وغسل organoids في أنبوب مع أكثر المتوسط. هذا هو عضي 100 ميكرومتر حمام السباحة.
- تأخذ المواد التي استنزفت في أنبوب 50 مل الأصلي وتكرار هذه العملية من 2.1 ميكرون باستخدام مصفاة 40، للحصول على عضي ميكرون 40 بركة، الذي يحتوي على هياكل السنخية في الغالب. المواد التي استنزفت في اله أنبوب يشكل تجمع الترشيح، الذي يحتوي على كتل واحد / صغيرة من الخلايا الظهارية الوسيطة وقطع صغيرة من والأوعية الدموية.
- بيليه للميكرومتر 100، ميكرومتر 40، وبرك الترشيح في 600 x ج لمدة 5 دقائق.
- نضح طاف، إعادة كل أنبوب في CPM II (DME/F-12 أو ما يعادلها مع FCS 44٪ وبنسبة 6٪ DMSO) باستخدام حوالي 1 مل من CPMII في 0.1 مل من بيليه معبأة. الحفاظ على C. ° 4
- البذور طبق اختبار للتجمعات 2 عضي عن طريق وضع 0.1 مل من المواد معلق في زراعة الأنسجة 35 مم قطرة قطرة طبق من البلاستيك كما في 3.2 أدناه. يمكن تجمع الترشيح المصنف مباشرة على البلاستيك زراعة الأنسجة الليفية المتوسطة مع (DME/F-12 أو ما يعادلها مع 10 ميكروغرام / مل الأنسولين و 10٪ FBS).
- قسامة المواد المتبقية معلق في نونك أمبولات تجميد نوع (1 مل / 2 أمبولة مل). بين عشية وضحاها في تجميد C ° -80 ثم نقل على وجه السرعة إلى وحدة التخزين في النيتروجين السائل. نحن لم تلاحظ وجود أية خسائر كبيرة في البقاءفي أمبولات لدينا الأصلي تخزين المجمدة منذ اواخر عام 1970.
3. بذر Organoids مثلجة وثقافة ثانوية الثقافات الابتدائية
- ذوبان الجليد بسرعة أمبولة تحتوي على organoids المجمدة في حمام ماء C ° 37. البذور وorganoids إلى 2 إلى 10 (عادة ~ 6) أطباق 60 ملم، أو أطباق مم 1-3 100، اعتمادا على تقدير البصرية لعدد organoids في أمبولة. organoids 20-40 تقريبا المصنف في صحن 60 ملم هو الأمثل.
- توضع بعناية organoids إذابة، قطرة قطرة، على سطح الطبق مع ماصة 1 مل ماصة باستور أو لتوزيع حتى organoids. وضعت قريبة من بعضها البعض سوف Organoids لديك مساحة محدودة للثمرة، مما أدى إلى عدد أقل من الخلايا للثقافة فرعية أو التجميد. تجنب خدش سطح الطبق (خلايا لا تميل للنمو الماضية السطوح خدش). انتظر دقيقة 1-2 للسماح للorganoids إرفاق ببطء ثم قم بإضافة المتوسطة النمو لتجنب طرد لorganoids (على سبيل المثال 2-3 مم طبق ml/60). أناncubate في 37 ° C في CO 2 حاضنة مرطب. هذه هي الثقافات الأساسية. نستخدم حاليا M87A + الأوكسيتوسين (X) المتوسطة للنمو وHMEC أقوى (الشكل 2).
- بعد 1 يوم، تأكد من أن يتم إرفاق organoids. إضافة متوسطة إضافية (على سبيل المثال 2-3 مم طبق ml/60). ينبغي الهجرة الخلية من organoids تكون مرئية من قبل 24-48 ساعة، وثمرة من 48-72 ساعة الإنقسامية بعد البذر (1B الشكل، C). في بعض الأحيان المرفق الفقراء بعد 24 ساعة، وخاصة إذا تصفيح organoids overdigested أو organoids من كبار السن من النساء، ولكن معظم الاستعدادات سوف نعلق في غضون 72 ساعة. قد قطع صغيرة من الأوعية الدموية وإرفاق تؤدي إلى الخلية الليفية ثمرة (1D الشكل).
- تغذية الثقافات لا يقل عن 3 مرات في الأسبوع. خلايا نمت في وسائل الإعلام من نوع M87A تنمو لالتقاء بالقرب من داخل 5-8 يوم، وهذا يتوقف كثافة البذر.
- إذا كان هناك نموا كبيرا الخلايا الليفية، Trypsinization التفاضلية (DT)، استنادا إلىوهناك حاجة مفرزة من الخلايا الليفية السريع من البلاستيك السطح، لإزالة الخلايا الليفية. عندما تصبح كبيرة بقع الظهارية، ووسائل الإعلام الرشفة، صحن غسيل (على سبيل المثال، 1-2 ml/60 طبق مم) مع STE (المالحة، التربسين 0.05٪، 0.02٪ EDTA)، الرشفة، إضافة جديدة STE مل 0.5 و ترك في درجة حرارة الغرفة لحوالي 1 دقيقة مع ملاحظة مجهرية المستمر. عندما الخلايا الليفية ولكن فصل الخلايا الظهارية لا تزال ملتصقة، ولكن بلطف يطرق بشدة على جانب الطبق ضد سطح صلب لإزاحة الخلايا الليفية ونضح ثم بسرعة. يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، ونضح مرة أخرى. قد الثقافات الملوثة بشكل كبير مع الخلايا الليفية في حاجة الى DT إضافية.
- ثقافة فرعية الثقافات الأساسية عند بقع كبيرة الظهارية موجودة، ولكن قبل التقاء. فإن كثافة البذر وعضي مرفق التأثير على الوقت اللازم. الإبقاء على الثقافة الابتدائية والثانوية لتوليد الثقافات المتعددة، متباعدة على مر الزمن، ونحن أداء Trypsinizations الجزئي (PT).
- الرشفة سائل الإعلام، وغسل صحن 60 ملم مع STE مل 1-2، إضافة 0.5 مل STE جديدة لطبق. مراقبة مفرزة الخلية تحت المجهر في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-5 دقيقة، مع يطرق لطيف للطبق لتعزيز مفرزة الخلية. يجب أن تتوقف عند Trypsinization ~ 50٪ من الخلايا وفصل. وعادة ما يكون في وقت مبكر PTS السريع مفرزة الخلية. لPTS في وقت لاحق، يمكن وضع الخلايا في C ° 37 مفرزة لسرعة، مع رصد دقيق، حيث أن جميع الخلايا قد تؤتي ثمارها بسرعة.
- إضافة 2 مل من مصل المحتوية على وسائل الإعلام إلى الطبق، repipette لغسل، ونقل إلى أنبوب 15 مل العقيمة. تكرار 2X مع وسائط أخرى ~ مل 1-2، إضافة إلى غسل الأنبوب. الطبق الرئيسي Refeed والعودة إلى الحاضنة. عد الخلايا في الأنبوب مع haemocytometer. ويمكن تكرار PTS حوالي 4 إلى 8 مرات مع إعادة نمو الخلايا جيدة في الأطباق الرئيسية ويعادل نمو طويل الأجل من المرتبات الثانية subcultured أو المجمدة (وتسمى الخلايا المقطع الثاني المرتبات الثانية؛ subcultured مرة واحدة، توجد الخلايا الصغرىnger التمهيدية). مرة واحدة المواد عضي لم يعد موجودا في الثقافات الأولية، المرتبات الثانية subcultured تبين انخفاضا في عدد السكان على المدى الطويل المحتملة مضاعفة.
- لثقافة فرعية لالمرتبات الثانية، وخلايا البذور مباشرة من الأنبوب إلى الأطباق. والبذر من 1-2 X 10 5 مم طبق cells/100 في وسط قوي مثل M87A + X يؤدي إلى التقاء في 4-7 أيام. نضيف بكتيريا الكوليرا إلى المتوسطة في المقطع الثاني لزيادة إمكانات التكاثري، تم حذف ذيفان الكوليرا في الثقافة الأولية لأنه يؤدي إلى ثمرة الخلية متعددة المستويات من organoids.
- لتجميد المرتبات الثانية و، بيليه في 600 XG أنبوب لمدة 5 دقائق، و resuspend في CPMII ذات الكثافة النهائية من الخلايا 6 10 / مل. قسامة معلق الخلايا في نونك أمبولات تجميد النوع، بين عشية وضحاها في تجميد -80 درجة مئوية ثم نقل على وجه السرعة والتخزين لفي النيتروجين السائل.
- فمن المستحسن لتجميد الخلايا من PT الأول لحفظها، واستخدام الخلايا من PT الثاني لثقافة فرعية. ويمكن تخزين المواد السمية الثابتة إضافية تجميدها لاستخدامها في المستقبل.
Representative Results
وتظهر الأرقام ممثل لهضم الأنسجة بشكل مناسب لorganoids ووضعها في الثقافة في الشكل 1. سوف تظهر الأنسجة هضم المواد غير كامل لا تزال تعلق على الجزء الخارجي من هذه الهياكل، ومن المحتمل أن يكون بعض نمو الخلايا الأرومة الليفية في الثقافة الأولية، الأمر الذي يتطلب DT إزالته. سوف تظهر الأنسجة Overdigested الحدود الخارجية أقل على نحو سلس، ويمكن أن يستغرق وقتا أطول لإرفاق في الثقافة الأولية. يجب أن تبدأ ثمرة الظهارية ضمن 48-72 ساعة (1B، C). يمكن قطع صغيرة من الأوعية الدموية (1D) أن تكون مصدرا للخلايا اللحمة المتوسطة ثمرة. زيادة نمو الخلايا الطلائية تظهر السكان غير متجانسة شكليا، مع السكان التكاثري التي تحتوي على خليط من الخلايا المرتبطة مع علامات السلف، ظهاري عضلي، والأنساب لمعي (1E، 3C-E). وسيكون معدل النمو في وسائل الإعلام الإجهاد المنخفضة مثل M87A تستكمل مع توكسين الكوليرا والأوكسيتوسين دعم متفوقة على المدى الطويلنمو HMEC قبل الركود العادي مقارنة مع الصيغ السابقة سائل الإعلام (الشكل 2). سوف M87A من نوع وسائل الإعلام أيضا أن تدعم نمو الخلايا اللمعية والسلف من خلال الممرات 4-8 (أرقام 3C-E، 4)؛ بعد ذلك، تظهر علامات معظم الخلايا ظهاري عضلي النسب فقط. يمكن HMEC مثقف على البلاستيك تحتفظ بقدرتها على تشكيل 3D السليم التنظيم الذاتي في micropatterned 3D microwells، مع الخلايا اللمعية الداخلية للخلايا ظهاري عضلي (الشكل 4A، B)، وتشكيل هياكل المنظمة عندما مطلي في Matrigel (4C، D).
الشكل 1. HMEC organoids والثقافة الأولية. (A) عضي تظهر الأقنية السنخ هيكل بعد الهضم والترشيح. (B، C) Organoids تظهر بنية الأقنية والسنخية 2 يوم بعد الإيداع في الثقافة الأولية؛ لاحظ الخلية بداية outgrowth (الأسهم البيضاء). (D) الأوعية الدموية الصغيرة والمرفقة مع بدء ثمرة الخلايا الليفية من ثقافات نفس B، C. (E) ثمرة من الخلايا الظهارية الثقافة عضي الأولية بعد 4 أيام. يتم تحديد الأنساب من تلطيخ مع الأجسام المضادة لK14 (أحمر) وK19 (الأخضر)؛ كانت ملطخة النوى مع دابي (الأزرق). اللمعية (K14-/K19 + والأخضر)، ظهاري عضلي (K14 + /-K19، أحمر)، والسلف (K14 + / + K19، أصفر) الخلايا مرئية. ويلاحظ خلايا غير ملوثين في قلب عضي بسبب اختراق الأجسام المضادة غير مكتملة.
الشكل 2. وبدأت نمو الثقافات HMEC في المستحضرات وسائل الإعلام المختلفة. Organoids تم الحصول عليها من فرد واحد، عينة 184، في الثقافة الأولية باستخدام وسائل الإعلام المختلفة الصيغ. يتم الحصول على أفضل نمو طويل الأجل باستخدام صياغة لدينا أحدث M87A + الأوكسيتوسين (X) 4. كما يدعم هذه الوسيلةنمو الأنساب HMEC متعددة (انظر الشكل 1E). قدمت وسائل الاعلام في وقت سابق صيغة، مم 3 النمو أقل قوة، في حين أن وسائل الإعلام المصل الحرة، MCDB170 (MEGM التجارية) 17 يؤدي إلى الحث السريع للالسيكلين كيناز مثبطات P16 INK4A واختيار للخلايا الشاذة 7،11،13.
الشكل 3. مقارنة النسب التنوع في organoids جاهل ومثقف HMEC في 4 تحليل FACS ال مرور. (A، B) لعضوي وغير مثقف فصلها إنزيمي للتعبير (A) من EpCAM وCD49f/alpha إنتغرين 6، وCD227/Muc1 (B) وCD10/CALLA. (C، D) FACS تحليل من 4 HMEC عشر قبل مرور ركود للتعبير عن (C) إنتغرين 6 EpCAM وCD49f/alpha، و (D) وCD227/Muc1 CD10/CALLA. التعرف عكما وصفت opulations LEP (التعبير عن علامات EPCAM اللمعية أو CD227)، الهندسة الكهربائية والميكانيكية (التعبير عن ظهاري عضلي أو علامات CD49f CD10)، أو PROG (المخصب CD49f + / + السكان EPCAM). نلاحظ أنه خلال التكيف مع ثقافة التنظيم والتغييرات EpCAM CD49f مقارنة organoids جاهل. (E) غير مصنف HMEC وFACS التخصيب LEP والهندسة الكهربائية والميكانيكية في مرور ال 4 ملطخة لتحليلها المناعي من الكيراتين K14 (MEP علامة) وK19 (LEP علامة) للتحقق من تحديد النسب. نوى الملون مع دابي تظهر زرقاء.
الشكل 4. HMEC مثقف قادر على تشكيل هياكل المنظمة مع النسب في العلاقات الجسم الحي مثل عند وضعه في microenvironments المناسبة. (A) كانت قبل مرور ال 4 ركود HMEC FACS التخصيب طn لاللمعية LEP والأنساب MEP ظهاري عضلي باستخدام علامات لCD227 CD10 و، مع هذه الأنساب التحقق من التعبير عن K14 K19 و(لا يظهر). (ب) كانت الخلايا المستزرعة عندما مختلطة معا في microwells micropatterned، وقادرة على التنظيم الذاتي في طبقات ثنائية مع MEP على السطح الخارجي والداخلي LEP [مقتبس من تشانسون وآخرون. 5]. LEP fluorescently المسمى (الأخضر)، والهندسة الكهربائية والميكانيكية (أحمر) وتصويرها باستخدام المجهر متحد البؤر في ساعة 0، على مدار 24 ساعة، وبعد 48 ساعة بالإضافة إلى microwells (العلوي). وصفت بشكل تعسفي السيطرة HMEC مع تسميات نيون أحمر أو أخضر (أقل). (C) صورة مشرقة مجال الخلايا الاصلية FACS التخصيب (cKit +) في الثقافة مطلي (Matrigel) 3D ونمت لمدة 18 يوما. يمكن الهياكل الناتجة عن المعرض التشكل السنخية. (D) تم استخراج الهياكل من Matrigel وملطخة للكشف عن K14 K19 و؛ كانت counterstained النوى مع دابي. تحليل مناعي يظهر هياكل المنظمة مع بولا الصحيح لمعي والقاعديةاألمن.
Discussion
الإنسان معالجة الأنسجة الثديية الطريقة المعروضة هنا يمكن الحصول على الخلايا الظهارية الثديية نقية من خليط غير متجانس من أنواع الخلايا في الثدي الإنسان. الترشيح من خلال مسام حجم ثابت يسمح الفصل بين الفصائل المختلفة في الغدة الثديية (مثل الأقنية والسنخية، مقابل الأقنية السنخية) من المصفوفة اللحمية هضمها. ويمكن الحصول على الخلايا الليفية الثديية إسوية الجينات لتتناسب مع الخلايا الظهارية. احتفظ المجمدة المواد هضمها جدوى جيدة لأكثر من 30 عاما. وقد عملت هذه الطريقة بنجاح على كافة أنسجة الثدي الليفي ولكن جدا، وبسيطة لتنفيذ. الأشكال الأخرى من معالجة الأنسجة الثديية موجودة والتي لا توفر الكسور الظهارية التي هي قابلة للحياة، نظيفة، أو المنفصلين عن ذويهم. وضع organoids معالجتها في الثقافة مع وسائل الاعلام الإجهاد الذي يحفز منخفضة مثل M87A يسمح النمو على المدى الطويل من علامات HMEC مع نسب متعددة. HMEC التي تم زرعها على البلاستيك ما زالت تحتفظ القدرة على أجناسالشركة المصرية للاتصالات مع الهياكل 3D طبيعية في الجسم الحي علاقات النسب مثل. هذه الثقافات HMEC هي مناسبة لتحقيق تجريبية واسعة النطاق، بما في ذلك الإنتاجية العالية، والسلوك العادي وHMEC العوامل التي قد تدفع أو تمنع الشيخوخة والتحول.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
القانون النموذجي للتحكيم، حرس السواحل، ويتم دعم MRS من قبل NIA (R00AG033176 وR01AG040081) ومختبر البحوث الموجهة والتنمية، وزارة الطاقة عقد # DE-AC02-05CH11231.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Petri dish 15 cm | VWR | 89000-308 | |
| Scissors 6.5" | VWR | 82027-594 | |
| Forceps 8" | VWR | 82027-436 | |
| Scalpels disposable | Miltex | 4-411 | |
| Collagenase | SIGMA | C0130 | |
| Hyaluronidase | SIGMA | H3506 | |
| Insulin | SIGMA | I5500 | |
| DMSO | SIGMA | D8418 | |
| Pennicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Fungizone | Life Technologies | 15290-018 | |
| Polymixin B sulfate | Life Technologies | 21850-029 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140-087 | |
| Trypsin 0.05% 100 ml | Life Technologies | 25300-054 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11039-021 | |
| HulaMixer | Life Technologies | 159-20D | |
| Cell strainer 100 μm | BD Falcon | 352360 | |
| Cell strainer 40 μm | BD Falcon | 352340 | |
| Tubes 15 ml | Greiner bio-one | 188-261 | |
| Tubes 50 ml | Greiner bio-one | 227-261 | |
| TC dishes 10 cm | Greiner bio-one | 664-160 | |
| TC dishes 6 cm | Greiner bio-one | 628-160 | |
| Cryogenic vials | Nalgene | 5000-1020 | |
| Heamocytometer | Hauser Scientific | 1490 | |
| Centrifuge | Eppendorf model | 5702 |
References
- Prowse, K. R., Greider, C. W. Developmental and tissue-specific regulation of mouse telomerase and telomere length. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4818-4822 (1995).
- Gil, J., Peters, G. Regulation of the INK4b-ARF-INK4a tumour suppressor locus: all for one or one for all. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 667-677 (2006).
- Stampfer, M. R., Hallowes, R., Hackett, A. J. Growth of Normal Human Mammary Epithelial Cells in Culture. In Vitro. 16, 415-425 (1980).
- Garbe, J. C., Bhattacharya, S., Merchant, B., Bassett, E., Swisshelm, K., Feiler, H. S., Wyrobek, A. J., Stampfer, M. R. Molecular distinctions between the stasis and telomere attrition senescence barriers demonstrated by long-term culture of normal human mammary epithelial cells. Cancer Res. 69, 7557-7568 (2009).
- Chanson, L., Brownfield, D., Garbe, J. C., Kuhn, I., Stampfer, M. R., Bissell, M. J., LaBarge, M. A. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 3264-3269 (2011).
- Stampfer, M. R., Bartley, J. C. Induction of transformation and continuous cell lines from normal human mammary epithelial cells after exposure to benzo(a)pyrene. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 2394-2398 (1985).
- Brenner, A. J., Stampfer, M. R., Aldaz, M. Increased p16 expression with first senescence arrest in human mammary epithelial cells and extended growth capacity with inactivation. Oncogene. 17, 199-205 (1998).
- Olsen, C. L., Gardie, B., Yaswen, P., Stampfer, M. R. Raf-1-induced growth arrest in human mammary epithelial cells is p16-independent and is overcome in immortal cells during conversion. Oncogene. 21, 6328-6339 (2002).
- Stampfer, M. R., Garbe, J., Nijjar, T., Wigington, D., Swisshelm, K., Yaswen, P. Loss of p53 function accelerates acquisition of telomerase activity in indefinite lifespan human mammary epithelial cell lines. Oncogene. 22, 5238-5251 (2003).
- Chin, K., Ortiz de Solorzano, C., Knowles, D., Jones, A., Chou, W., Rodriguez, E. G., Kuo, W. -L., Ljung, B. -M., Chew, K., Myambo, K., Miranda, M., Krig, S., Garbe, J., Stampfer, M., Yaswen, P., Gray, J. W., Lockett, S. J. In situ analysis of genome instability in breast cancer. Nat Gene. 36, 984-988 (2004).
- Li, Y., Pan, J., Li, J. -L., Lee, J. -H., Tunkey, C., Saraf, K., Garbe, J. C., Whitley, M. Z., Jelinsky, S. A., Stampfer, M. R., Haney, S. A. Transcriptional changes associated with breast cancer occur as normal human mammary epithelial cells overcome senescence barriers and become immortalized. Mol. Cancer. 6, (2007).
- Garbe, J. C., Holst, C. R., Bassett, E., Tlsty, T., Stampfer, M. R. Inactivation of p53 function in cultured human mammary epithelial cells turns the telomere-length dependent senescence barrier from agonescence into crisis. Cell Cycle. 6, 1927-1936 (2007).
- Novak, P., Jensen, T. J., Garbe, J. C., Stampfer, M. R., Futscher, B. W. Step-wise DNA methylation changes are linked to escape from defined proliferation barriers and mammary epithelial cell immortalization. Cancer Res. 69, 5251-5258 (2009).
- Vrba, L., Garbe, J. C., Stampfer, M. R., Futscher, B. W. Epigenetic regulation of normal human mammary cell type specific miRNAs. Genom Res. 21, 2026-2037 (2011).
- LaBarge, M. A., Nelson, C. M., Villadsen, R., Fridriksdottir, A., Ruth, J. R., Stampfer, M. R., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integr. Biol. 1, 70-79 (2009).
- Garbe, J. C., Pepin, F., Pelissier, F., Sputova, K., Fridriksdottir, A. J., Guo, D. E., Villadsen, R., Park, M., Petersen, O. W., Barowsky, A., Stampfer, M. R., Labarge, M. A. Accumulation of multipotent progenitors with a basal differentiation bias during aging of human mammary epithelia. Cancer Res. 72, 3687-3701 (2012).
- Hammond, S. L., Ham, R. G., Stampfer, M. R. Serum-free growth of human mammary epithelial cells: rapid clonal growth in defined medium and extended serial passage with pituitary extract. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 5435-5439 (1984).
