Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Endothelin-1 المستحثة انسداد الشريان الدماغي الأوسط نموذج للالسكتة الدماغية مع التوجيه بالليزر Flowmetry دوبلر في الجرذ

Published: February 16, 2013 doi: 10.3791/50014
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 4, 4, 1, 3
1Department of Neurosurgery, University of Florida, 2Department of Anatomical Sciences, Shiraz University of Medical Sciences, Shiraz, Iran, 3Department of Physiology and Functional Genomics, University of Florida, 4Department of Neurology, University of Florida

Summary

وقد وضعت عدة نماذج حيوانية من نقص التروية الدماغية لمحاكاة حالة الإنسان من السكتة الدماغية. هذا البروتوكول يصف endothelin-1 (ET-1) التي يسببها انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAO) نموذج للسكتة الدماغية الإقفارية في الفئران. وبالإضافة إلى ذلك، تتم مناقشة اعتبارات هامة، ومزايا، وأوجه القصور في هذا النموذج.

Abstract

السكتة الدماغية هي السبب رقم واحد للإعاقة والسبب الرئيسي الثالث للوفاة في العالم، تكلف ما يقدر ب 70 مليار دولار في الولايات المتحدة في 2009 1، 2. وقد وضعت عدة نماذج من نقص التروية الدماغية لتقليد الإنسان للحالة السكتة الدماغية. فقد قيل أن ما يصل إلى 80٪ من السكتات الدماغية نتيجة كل من التلف الإقفاري في الشريان الدماغي الأوسط (MCA) مساحتها 3. في 1990s في وقت مبكر، endothelin-1 (ET-1) تم استخدام 4 إلى إحداث نقص التروية قبل تطبيقه مباشرة بالقرب من سطح MCA بعد حج القحف. في وقت لاحق، تم تعديل هذا النموذج 5 باستخدام حقنة التجسيمي من 1-ET المتاخمة للMCA لإنتاج نقص التروية الدماغية البؤرية. المزايا الرئيسية لهذا النموذج تشمل القدرة على تنفيذ الإجراء بسرعة، والقدرة على التحكم في انقباض الشريان عن طريق تغيير جرعة من ET-1 تسليمها، لا حاجة لمعالجة الأوعية خارج القحف توريد الدم إلى الدماغ وكذلك التدريجي reperfusiعلى أن أكثر معدلات يحاكي بشكل وثيق ضخه في البشر 5-7. من ناحية أخرى، فإن نموذج ET-1 له مساوئ التي تشمل الحاجة إلى حج القحف، فضلا عن ارتفاع التباين في حجم المخ 8. ويمكن تخفيض هذا التباين مع استخدام الليزر دوبلر flowmetry (LDF) للتحقق من خلال ضخ نقص التروية الدماغية ET-1. العوامل التي تؤثر على السكتة الدماغية تشمل تقلب دقة التسريب ودفعة من 1-ET المستخدمة 6. وهناك اعتبار آخر مهم هو أنه على الرغم من ضخه أمر شائع في المخ البشري، قد مدة انسداد لET-1 MCAO الناجم عن كثب أن لا تحاكي الإنسان من السكتة الدماغية حيث أن العديد من المرضى ضخه جزئية على مدى فترة من ساعات إلى أيام بعد انسداد 9، 10. ووصف هذا البروتوكول بالتفصيل ET-1 نموذج MCAO الناجم عن السكتة الدماغية في الفئران. سوف يلفت الانتباه أيضا إلى اعتبارات خاصة وعيوب محتملة في جميع أنحاء الداخلي.

Protocol

وقد وافق هذا البروتوكول من قبل رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام (IACUC) في جامعة ولاية فلوريدا ومتوافق مع "دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية" (الطبعة الثامنة، والأكاديمية الوطنية للعلوم، 2011).

المواد

  1. الحيوانات: ثمانية أسابيع من العمر، من الذكور، سبراغ داولي الفئران (تشارلز ريفر مزارع، ويلمنجتون، MA، الولايات المتحدة الأمريكية) وزنها 250-300 ز في وقت الجراحة.
  2. خدر
    1. استنشاق التخدير نظام (VetEquip شركة، بليسانتون، CA، الولايات المتحدة الأمريكية)
    2. Isoflurane مخدر (الصيدلانيات باكستر، ديرفيلد، IL، الولايات المتحدة الأمريكية)
  3. التجسيمي النظام (ديفيد KOPF الصكوك، Tujunga، CA، الولايات المتحدة الأمريكية)
    1. نظام الحيوانات الصغيرة التجسيمي
    2. غير تمزق الأذن القضبان لالفئران
    3. حامل الغاز رئيس التخدير بالنسبة للفئران
  4. درجة الحرارة التنظيم
    1. BAT-12 ميزان حرارة المسبار الميكروي (البنك أدوات دقيقة، وشركة، ساراسوتا، FL، الولايات المتحدة الأمريكية)
    2. T / PUMP، TP600 بطانية الحرارية (صناعات Gaymar، وشركة، بستان حديقة، NY، USA)
  5. الأدوات الجراحية
    1. مشرط مقبض ونصل رقم 11، ملقط القزحية، غريف ملقط، الكامشات المشبك البلدغ، مفك، 10 ميكرولتر مع حقنة إبرة قياس 26 مشطوف (أدوات دقيقة العالمي، وشركة، ساراسوتا، FL، الولايات المتحدة الأمريكية)
    2. محرك صغروي الحفر وحامل التجسيمي، نقابة المحامين التجسيمي الحاقن (Stoelting، الخشب دايل، IL، الولايات المتحدة الأمريكية)
    3. 1.0 ملم بر حفر الجولة، 1.0 مم الحفر مخروط مقلوب بر (Roboz الجراحية الصك المحدودة، وشركة، غايثرسبيرغ، MD، الولايات المتحدة الأمريكية)
  6. اللوازم الجراحية
    1. تصاعد مسامير 0-80 X 3/32 مع 2.4 ملم طول رمح، 21 عيار دليل قنية [4MM طويلة دون رمى] وقنية همية (بلاستيك واحد، رونوك، VA، الولايات المتحدة الأمريكية)
    2. طائرة الاكريليك أسنان والسائلة (لانج الأسنان شركة التصنيع، وشركة، ويلنج، IL، الولايات المتحدة الأمريكية)
    3. 3،0 النايلون خياطة (الواحة، Mettawa، IL، الولايات المتحدة الأمريكية)
    4. مسحات القطن، Puralube مرهم العين (فيشر العلمية، بتسبرغ، PA، الولايات المتحدة الأمريكية)
    5. كليبرز الشعر الكهربائية (اوستر، بروفيدانس، رود آيلند، الولايات المتحدة الأمريكية)
  7. المواد الكيميائية
    1. Endothelin-1 (الأمريكية الببتيد، سانيفيل، CA، الولايات المتحدة الأمريكية)
    2. الكلورهيكسيدين 2٪ (Agrilabs، وسانت جوزيف، MO، الولايات المتحدة الأمريكية)
    3. البوبرينورفين حمض الهيدروكلوريك (هوسبيرا شركة، ليك فورست، IL، الولايات المتحدة الأمريكية)
  8. التصور معدات
    1. المجهر الجراحي (SEILER الصك وتصنيع؛ سانت لويس، MO، الولايات المتحدة الأمريكية)
    2. إضاءة الألياف البصرية (TechniQuip شركة، ليفرمور، CA، الولايات المتحدة الأمريكية)
  9. الليزر دوبلر flowmetry النظام (ADInstruments، وشركة، كولورادو سبرينغز، CO، الولايات المتحدة الأمريكية)
    1. شandard رصاص دقق
    2. التحقيق حامل
    3. مقياس التدفق الدم
    4. Powerlab 4/30 مع LabChart 7
  10. قياس حجم احتشاء
    1. الفئران مصفوفة المخ (Zivic ميلر مختبر.، وشركة، أليسون بارك، PA، الولايات المتحدة الأمريكية)
    2. 2،3،5-triphenyltetrazolium كلوريد (سيغما الدريخ شركة، وسانت لويس، MO، الولايات المتحدة الأمريكية) المخفف إلى 0.05٪ في برنامج تلفزيوني
    3. مسطحة الماسح الضوئي (إبسون الكمال V30، إبسون الأمريكية، وشركة، لونغ بيتش، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية)
    4. الصورة J البرمجيات (يماغيج 1.42q البرامج والمعاهد الامريكية الوطنية للصحة في بيثيسدا، MA، الولايات المتحدة الأمريكية)

1. خطوات ما قبل الجراحة

  1. قبل الجراحة، ويعيش الفئران تحت دائرة الضوء / الظلام 12:12 مع حرية الوصول إلى المياه والقوارض تشاو.
  2. هو فعل التخدير مع 4٪ isoflurane في 100٪ خليط الغاز O 2 في دائرة الحث حتى الفئران لم تعد السحب لقرصة مخلب الخلفي.
  3. Aينبغي الحفاظ على أسلوب التحليل خلال هذا الإجراء بما في ذلك استخدام قفازات معقمة، والأدوات الجراحية المعقمة، وثنى الجراحية المعقمة 11.
  4. وحلق تاج الرأس مع الشعر كليبرز الكهربائية.
  5. يتم وضع الفئران في وضعية الانبطاح على وسادة ماصة الكذب على سطح التشغيل التحكم في درجة حرارته (بطانية الحرارية).
  6. يتم وضع الرأس في جهاز التجسيمي بدءا من وضع قناع الوجه الغاز مخدر.
  7. المقبل، يتم إدراج أشرطة الأذن وشددت.
  8. خلال إجراء التخدير يتم الاحتفاظ بنسبة 2٪ isoflurane في 100٪ خليط الغاز O 2.
  9. يتم تطبيق مواد التشحيم مرهم عيني لكلتا العينين، والجفون مغلقة لمنع جفاف العين خلال العملية الجراحية.
  10. يتم إدراج التحقيق درجة حرارة الجسم الأساسية للحفاظ على درجة حرارة ثابتة الحيوانية من 37 ± 0.5 ° C.
  11. مع رئيس عقدت بحزم في التجسيميالجهاز، منطقة العمليات الجراحية هو تطهير بالتناوب مع الكلورهيكسيدين 2٪ والمالحة ثلاث مرات.

2. خطوات الجراحية

  1. باستخدام مشرط، يتم إجراء شق خط الوسط على الجلد المغطي للالقبة من أكثر الجوانب الذيلية للعيون (nasion) إلى ما بين الأذنين (الخط القفوي متفوقة).
  2. وتراجع الجلد ثم أفقيا مع المشابك البلدغ 3.
  3. تتم إزالة النسيج الضام من الجمجمة باستخدام قطعة قطن جافة بحيث يمكن رؤية الهياكل متعددة بشكل واضح. وتشمل هذه bregma، وخياطة الاكليلية، والحق ريدج الجمجمة الجانبي. وتستخدم قطعة قطن لإزالة الدم من جراحي ميداني.
  4. باستخدام المجهر الجراحي، ويقع bregma، ويتم ضبط المتلاعبين التجسيمي حتى يتم ركزت الجولة 1.0 مم بر الحفر في bregma.
  5. يتم نقل بعد ذلك إلى بر الحفر 1.6 مم و 5.2 مم الأمامي الجانبي لbregma.
  6. وحفر حفرة بر التي تخترق الجمجمة لالقناالتنسيب العلا (الشكل 1). يتم مسح باستمرار الحطام الزائدة والدم باستخدام قطعة قطن.

عند هذه النقطة، يمكن إدراج قنية دليل (الخطوة 7) أو يمكن القيام بها مباشرة ET-1 حقن من خلال ثقب بر (الانتقال مباشرة إلى الخطوة 16).

  1. يتم حفر المقبل، والثقوب بر لمدة 3 مسامير التركيب من خلال سمك جزئية من الجمجمة باستخدام 1.0 ملم الحفر مخروط مقلوب بر (الشكل 1). وحفر حفرة واحدة في كل عظم الجبهي الأمامي حوالي 1-2 ملم لخياطة الاكليلية و 1-2 مم الوحشي للخياطة السهمي. وحفر حفرة واحدة في العظم الجداري الخلفي حوالي 2-3 ملم لخياطة الاكليلية و 2-3 مم الوحشي للخياطة السهمي المماثل لثقب دليل بر قنية. 0-80 يتم وضعها ثلاثة X 3/32 مسامير المتصاعدة في هذه الثقوب بر وسوف توفر الدعم للأسمنت القابضة في قنية. يجب أن تكون مسامير فقط متقدمة 2 أو 3 حتى لا يتحول إلى تلف هذه المسألة الجافية. يتم وضع قنية في دليل حامل قنية التجسيمي ويقع bregma.
  2. يتم ضبط المتلاعبين التجسيمي حتى يتم ركزت على قنية دليل على bregma. يتم نقل قنية إلى الحفرة تقع بر 1.6 مم و 5.2 مم الأمامي الجانبي لbregma.
  3. وأخيرا، يتم خفض قنية دليل في حفرة بر مع الموقف النهائي من طرف 4.5 مم البطني لbregma.
  4. الليزر دوبلر تدفق تحقيق موضع (اختياري)
    1. من أجل رصد تدفق الدم في الدماغ باستخدام LDF، يمكن وضع حامل التحقيق في الموقف قبل الالصاق قنية دليل مع الاسمنت الأسنان.
    2. يتم قطع قاعدة حامل التحقيق تدفق مع التمثال باستثناء علامة التبويب إسفين صغيرة الشكل.
    3. ثم يتم وضع مسبار حامل الخلفي للقنية دليل وسطي عادل لريدج الجمجمة الجانبي مع علامة التبويب الموجهة بشكل إعلامي (الشكل 1).
    4. صاحب التحقيق وزتلصق uide قنية معا باستخدام الاسمنت الأسنان.
  5. ثم يتم استخدام الاسمنت الأسنان لتأمين قنية في المكان. الاسمنت على اتصال مع جميع المسامير الثلاثة ويحيط قاعدة كاملة من قنية.
  6. يجب أن تكون جافة تماما الأسمنت قبل إزالة حامل قنية. هذا يستغرق حوالي 5 دقائق.

بعد هذه الخطوات، يمكن إغلاق الشق الجراحي ويمكن مشدود دمية قنية قنية في الدليل. وبدلا من ذلك، يمكن إجراء ET-1 يسببها MCAO على الفئران بعد فترة من التعافي من جراحة زرع قنية. لهذا الأسلوب، يجب تنفيذ الخطوة 19 التالي ويمكن تنفيذ الخطوات 14-18 في وقت لاحق. دليل لأداء قنية الحقن وزرع ET-1 خلال نفس الجراحة، ينبغي تنفيذ الخطوة ال 14 المقبلة.

  1. يتم تحميل المحقنة مع ضخ ET-1 (مخففة إلى 80 ميكرومتر في PBS) ثم تقام في حاقن التجسيمي.
  2. التم تعديل المتلاعبين التجسيمي حتى يتم ركزت طرف الإبرة في حافة قنية الدليل.
  3. وخفضت طرف الإبرة من خلال قنية دليل على موقف قدرها 17.2 مم البطني إلى حافة قنية الدليل. إذا لم يتم استخدام قنية دليل، وركزت طرف الإبرة في bregma وخفضت من خلال ثقب إلى بر مم 8،7 موقف بطني لbregma.
  4. هي التي غرست 3 ميكرولتر من 80 في ET1 ميكرومتر بمعدل 1 ميكرولتر لكل دقيقة.
  5. ترك الحقنة في مكان لمدة 3 دقائق بعد اكتمال ضخ ومن ثم إزالة ببطء.
  6. يتم إغلاق شق مع الدرز النايلون 3.0 و هو مشدود دمية قنية في قنية.
  7. وينبغي استخدام جرعة من مسكن مناسب (أي البوبرينورفين في 0،05-0،1 ملغ / كلغ) بعد الجراحة لتقليل الألم وعدم الراحة أثناء فترة النقاهة.
  8. تتم إزالة الفئران من الجناح الجراحي ووضعها في الحارة أو المنطقة الانتعاش الجافة لمنع انخفاض حرارة الجسم، مع إمكانية الوصول، مجانا سهلة لينة في الغذاء والماء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

1. بعد العملية تقييم العصبية

بعد الحيوان يستعيد وعيه، يمكن استخدام مجموعة واسعة من الاختبارات لتقييم العجز العصبية بما في ذلك التوازن، قوة قبضة، ووضع مخلب، وعدم التماثل الوضعي سلم التسلق. المهمة بذور عباد الشمس هو تقييم الإجمالي للمحرك وظيفة الحسية التي لديها ارتباط كبير مع حجم احتشاء 7 و 12. خلال هذه المهمة، هي في الوقت المناسب والفئران أثناء فتح استهلاك بذور عباد الشمس 5. توضع البذور خمسة في زاوية واحدة من فارغة، القفص، والبلاستيك الجاف يتم تسجيل الوقت الذي يقضيه التلاعب البذور. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تسجيل عدد القطع قذيفة في القفص بعد أن تم فتح جميع البذور والمستهلكة. سوف الفئران مع عجز أكبر العصبية يستغرق وقتا أطول لفتح وتستهلك البذور وسوف كسر قذائف في أكثر من قطعة. وإن لم يكن جزءا من هذه المهمة الرسمية، فمن السهل أن نلاحظ سوء متكررة واسقاط من بذور عباد الشمسS من الفئران بعد السكتة الدماغية التجريبية. وهذا يشمل استخدام forepaw 1 في المقام الأول، وغير فعالة العض من خلال شل محاولات لفتح.

2. تلطيخ وقياس كمي لحجم احتشاء الدماغ

بعد انسداد وضخه من MCA لإقامة نقص التروية الدماغية العابرة والحيوانات ويصرح باستخدامها ملطخة أدمغتهم مقطوع coronally مع 2،3،5-triphenyltetrazolium كلوريد (TTC) لتقييم حجم احتشاء (الشكل 2) كما هو مبين في منشوراتنا السابقة 7 و 13.

الشكل 1
الشكل 1. مشاهدة الظهري للجمجمة الفئران التي تصور وضع الأجهزة. هذا الرأي الظهري للجمجمة الفئران مع التوجه الأمامي إلى اليسار يبين موقع bregma وامدا فيما يتعلق الغرز التي يمكن تصور بعد تطهير الضامالأنسجة من سطح الجمجمة. وتبين ايضا الحافة الجانبية الجمجمة، دليل قنية، LDF صاحب التحقيق، وترسيخ مسامير على الرسم التخطيطي مع العلاقات نسبة إلى الأرض علامات الجمجمة وبعضها البعض.

الشكل 2
الشكل 2. TTC الملطخة مسلسل أقسام الدماغ الاكليلية (2 ملم) من الفئران التعرض للET-1 MCAO المستحث. ويرد ممثل الدماغ من الفئران بعد ET-1 MCAO المستحث. تمت إزالة هذا الدماغ وتشطف في الجليد الباردة PBS قبل أن يصبح مقطوع coronally في القسمين 2 مم سميكة ابتداء الذيلية عادل لمبات حاسة الشم. ثم حضنت شرائح 0.05٪ في TTC مخففة في PBS في 37 ° C قبل أن يتم مروي في برنامج تلفزيوني ثم إصلاح لفترة وجيزة في الفورمالين. ملطخة الأنسجة الحمراء بعد التعرض لTTC تمثل المادة الرمادية قابلة للحياة. ويمكن مقارنة هذه المسألة قابلة للحياة الرمادية في نصف الكرة المماثل ل1-ET حقن لم الرماديatter من نصف الكرة المقابل لحساب مساحة من احتشاء دماغي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وET-1 يسببها MCAO هو نموذج الموضوع للالسكتة الدماغية التجريبية التي تستخدم بانتظام في سلالات الفئران متعددة. يمكن العديد من المتغيرات، مثل سلالة الفئران، العمر الحيوان، درجة حرارة الجسم، وطريقة التخدير، والخبرة عامل يؤدي إلى زيادة التقلبات في حجم احتشاء عند استخدام هذا النموذج 5، 14. ومع ذلك، فقد أظهرت عدة محققين أن مزايا هذا النموذج تتضمن نهج نسبيا غير الغازية، والاستجابة جرعة من تدفق الدم إلى المخ لET-1، والقدرة على تجنب التخدير تماما عن طريق التسريب من ET-1 في الفئران واعية 14 و 15. ومن الجدير بالذكر أن هناك العديد من الاختلافات في سلالة الفئران والسن استخدامه خلال الأدب، وليس من المستغرب أن يتم الإبلاغ عن إحداثيات التجسيمي مختلفة اعتمادا على هذه المتغيرات. هي الأمثل لتنسيق المستخدمة في بروتوكول لدينا لمدة 8 أسابيع الفئران الذكور القديمة داولي سبراغ. فإن أي انحراف عن هذه السلالة أو الجنس أو السن أو تتطلب على الأرجح داخل المخ حقنيتبع أيون من الصبغة عن طريق التشريح لتحديد إحداثيات صالح لهذا الإجراء. بالإضافة إلى ذلك، خفض ET-1 المستحث في تدفق الدم في الدماغ هي الجرعة التي تعتمد. استخدام جرعة في هذا الأسلوب يؤدي إلى احتشاء من 30-40٪ تقريبا من المادة الرمادية في نصف الكرة المماثل للحقن مع الخطأ المعياري للمتوسط ​​حوالي 4-5٪ خلال تجربة 7 و 16. رؤية مباشرة من أجزاء القريبة من MCA يكشف عن قطر اللمعية الذي يذهب إلى 0٪ من خط الأساس في غضون 3 دقائق ويعود إلى خط الأساس في حوالي 30 دقيقة 7. باستخدام LDF، وقد تبين أن ينخفض ​​التدفق الأقصى إلى ما يقرب من 10٪ من خط الأساس في تدفق 5-7 دقائق مع العودة التدريجية إلى 60٪ من خط الأساس بعد 1 ساعة الرصد التي توقفت 16.

تفاصيل تقنية محددة أخرى المسرودة أدناه ذكر أمر:

  1. تحديد مكان والتصفير بشكل صحيح المعدات التجسيمي في bregma (بتوجيه المجهرية) أمر حاسم لinduciنانوغرام في المخ ناجحة. وينبغي التحقق من إحداثيات التجسيمي لضخ ET-1 للمعدات التجريبية محددة وسلالة الفئران قبل التجريب. فمن المحتمل أن لا الآفة سوف يحدث إذا التسريب ليس تقع ضمن نطاق 0.5 ملم من MCA 6.
  2. والحرص على عدم تسبب تلف في خلايا المخ عندما حفر حفرة بر الأولية للقنية الدليل. فمن المستحسن أن يتم استخدام سرعة بطيئة لبدء الحفر في الحفرة بر ومرة ​​أخرى قرب نهاية وذلك للتقليل من فرص اختراق في الدماغ.
  3. عندما حفر ثقوب للمسامير بر تصاعد مستمر، واستخدام الحفر مخروط مقلوب بر لخلق ثقب بر أن جزئيا فقط تخترق الجمجمة. حفر عميقة بما فيه الكفاية فقط بحيث مسامير مستقرة.
  4. عندما تدعيم قنية في مكان لا شك فيه للحفاظ على الاسمنت واضحة في الجلد فضلا عن ذراع التجسيمي. يمكن التلاعب في الأسمنت قبل التجفيف باستخدام قطعة من القطن.
  5. تأكد من أن الأسمنت هو الدكتور كاملذ وقنية ومستقرة قبل إزالة حامل قنية. فمن الأهمية بمكان أن قنية لا تتحرك قبل الحقن ET-1.
  6. في تجربتنا، ونموذج ET-1 السكتة الدماغية لديه ما يقرب من 20٪ معدل وفيات بسبب العملية الجراحية. من المهم للمقارنة بين معدلات وفيات مجموعات العلاج، وكذلك التجارب خطة بحيث يتم استخدام أحجام العينات كافية بالنسبة لنهايات عصبية والنسيجية.
  7. المبادئ التوجيهية للمحاكمات قبل السريرية لعلاج السكتة الدماغية الحادة يوصي الدماغي رصد تدفق الدم ورصد الفسيولوجية للضغط الدم، درجة الحرارة، والجلوكوز، والغازات في الدم للحد من التقلبات خلال التجارب 17. LDF هو طريقة التي يمكن استخدامها لمراقبة الوقت الحقيقي من تدفق الدم في مناطق تشريحية مختلفة للتحقق من عتبة محددة سلفا للحد من تدفق في تحقق.
  8. تأكد من تنظيف حقنة إبرة الحقن ومع الإيثانول والمالحة بين الحقن، وقبل الإيثانولالتخزين. وهذا الإجراء يعطي الانسحاب متسقة وحقن فقاعات الهواء ET-1without أو انسداد أثناء التشغيل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من أمريكا انضم جمعية القلب جنوب شرق الكبرى (09GRNT2060421)، الجمعية الطبية الأمريكية، ومن جامعة العلوم السريرية ومعهد فلوريدا بالحركة. آدم مكة هو زميل NRSA NIH / NINDS، predoctoral (NS-F30 060335). تلقى روبرت Regenhardt predoctoral الدعم زمالة من جامعة فلوريدا برنامج التدريب المتعدد التخصصات في ارتفاع ضغط الدم (HL-T32 083810).

Materials

  1. Animals: Eight-week-old, male, Sprague Dawley rats (Charles River Farms, Wilmington, MA, USA) weighing 250-300 g at the time of surgery.
  2. Anesthesia:
    1. Inhalation anesthesia system (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA)
    2. Isoflurane anesthetic (Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL, USA)
  3. Stereotaxic system (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA):
    1. Small animal stereotaxic system
    2. Non-rupture ear bars for rats
    3. Gas anesthesia head holder for rats
  4. Temperature regulation:
    1. BAT-12 microprobe thermometer (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA)
    2. T/PUMP, TP600 Thermal blanket (Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA)
  5. Surgical instruments
    1. Scalpel handle and #11 blade, iris forceps, Graefe forceps, bulldog clamp retractors, screwdriver, 10 μl syringe with 26 gauge beveled needle (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA)
    2. Micromotor drill and stereotaxic holder, Quintessential Stereotaxic Injector (St–lting, Wood Dale, IL, USA)
    3. 1.0 mm round drill bur, 1.0 mm inverted cone drill bur (Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA)
  6. Surgical Supplies
    1. Mounting screws 0-80 X 3/32 with 2.4 mm shaft length, 21-gauge guide cannula [4mm long below the pedestal] and cannula dummy (Plastics one, Roanoke, VA, USA)
    2. Jet denture acrylic and liquid (Lang Dental Manufacturing Co., Inc., Wheeling, IL, USA)
    3. 3.0 nylon suture (Oasis, Mettawa, IL, USA)
    4. Cotton swabs, Puralube eye ointment (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA)
    5. Electric hair clippers (Oster, Providence, RI, USA)
  7. Chemicals:
    1. Endothelin-1 (American Peptide, Sunnyvale, CA, USA)
    2. Chlorhexidine 2% (Agrilabs, St. Joseph, MO, USA)
    3. Buprenorphine HCl (Hospira Inc., Lake Forest, IL, USA)
  8. Visualization Equipment
    1. Surgical microscope (Seiler Instrument and Manufacturing; St. Louis, MO, USA)
    2. Fiber Optic illuminator (TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA)
  9. Laser Doppler flowmetry system (ADInstruments, Inc., Colorado Springs, CO, USA)
    1. Standard Pencil Probe
    2. Probe holder
    3. Blood FlowMeter
    4. Powerlab 4/30 with LabChart 7
  10. Measurement of infarct volume:
    1. Rat brain matrix (Zivic-Miller Lab., Inc., Allison Park, PA, USA)
    2. 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) diluted to 0.05% in PBS
    3. Flatbed scanner (Epson Perfection V30, Epson America, Inc., Long Beach, CA, USA)
    4. Image J software (ImageJ 1.42q software, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stroke--1989. Recommendations on stroke prevention, diagnosis, and therapy. Report of the WHO Task Force on Stroke and other Cerebrovascular Disorders. Stroke. 20, 1407-1431 (1989).
  2. Lloyd-Jones, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 119, 480-486 (2009).
  3. Mohr, J. P., Gautier, J. C., Hier, D., Stein, R. W. Stroke: pathophysiology, diagnosis, and management. Barnett, H. J. M., Stein, B. M., Mohr, J. P., Yatsu, F. M. , Churchill Livingstone. New York. 377-450 (1986).
  4. Robinson, M. J., Macrae, I. M., Todd, M., Reid, J. L., McCulloch, J. Reduction of local cerebral blood flow to pathological levels by endothelin-1 applied to the middle cerebral artery in the rat. Neurosci. Lett. 118, 269-272 (1990).
  5. Sharkey, J., Ritchie, I. M., Kelly, P. A. Perivascular microapplication of endothelin-1: a new model of focal cerebral ischaemia in the rat. J. Cereb. Blood Flow Metab. 13, 865-871 (1993).
  6. O'Neill, M. J., Clemens, J. A. Rodent models of focal cerebral ischemia. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 9 (Unit 9), (2001).
  7. Mecca, A. P., O'Connor, T. E., Katovich, M. J., Sumners, C. Candesartan pretreatment is cerebroprotective in a rat model of endothelin-1-induced middle cerebral artery occlusion. Exp. Physiol. 94, 937-946 (2009).
  8. Braeuninger, S., Kleinschnitz, C. Rodent models of focal cerebral ischemia: procedural pitfalls and translational problems. Exp. Transl. Stroke Med. 1, 8 (2009).
  9. Tomsick, T. A. Intravenous thrombolysis for acute ischemic stroke. J. Vasc. Interv. Radiol. 15, 67-76 (2004).
  10. Olsen, T. S., Lassen, N. A. A dynamic concept of middle cerebral artery occlusion and cerebral infarction in the acute state based on interpreting severe hyperemia as a sign of embolic migration. Stroke. 15, 458-468 (1984).
  11. Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586 (2011).
  12. Gonzalez, C. L., Kolb, B. A comparison of different models of stroke on behaviour and brain morphology. Eur. J. Neurosci. 18, 1950-1962 (2003).
  13. Ansari, S., Azari, H., McConnell, D. J., Afzal, A., Mocco, J. Intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke with laser doppler flowmetry guidance in mice. J. Vis. Exp. (51), e2879 (2011).
  14. Sharkey, J., Butcher, S. P. Characterisation of an experimental model of stroke produced by intracerebral microinjection of endothelin-1 adjacent to the rat middle cerebral artery. J. Neurosci. Methods. 60, 125-131 (1995).
  15. Macrae, I. M., Robinson, M. J., Graham, D. I., Reid, J. L., McCulloch, J. Endothelin-1-induced reductions in cerebral blood flow: dose dependency, time course, and neuropathological consequences. J. Cereb. Blood Flow Metab. 13, 276-284 (1993).
  16. Mecca, A. P., et al. Cerebroprotection by angiotensin-(1-7) in endothelin-1-induced ischaemic stroke. Exp. Physiol. 96 (1-7), 1084-1096 (2011).
  17. Fisher, M., et al. Update of the stroke therapy academic industry roundtable preclinical recommendations. Stroke. 40, 2244-2250 (2009).

Tags

الطب، العدد 72، علم الأعصاب، بيولوجيا الأعصاب، الهندسة الطبية الحيوية، الجراحة، التشريح، علم وظائف الأعضاء، وأمراض الجهاز العصبي والسكتة الدماغية الإقفارية، Endothelin 1-، الدماغية والمخ الشريان، والسكتة الدماغية وانسداد، ليزر، doppley، flowmetry، الجرذ، نموذج حيواني
Endothelin-1 المستحثة انسداد الشريان الدماغي الأوسط نموذج للالسكتة الدماغية مع التوجيه بالليزر Flowmetry دوبلر في الجرذ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ansari, S., Azari, H., Caldwell, K.… More

Ansari, S., Azari, H., Caldwell, K. J., Regenhardt, R. W., Hedna, V. S., Waters, M. F., Hoh, B. L., Mecca, A. P. Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Rat. J. Vis. Exp. (72), e50014, doi:10.3791/50014 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter