אנדותלין-1 דגם מושרה מזרח מוחות עורקים ספיגים לשבץ איסכמי עם הדרכת Flowmetry ליזר דופלר בעכברוש

Summary

כמה מודלים של בעלי חיים של איסכמיה המוחית פותחו כדי לדמות את המצב האנושי של שבץ. פרוטוקול זה מתאר אנדותלין 1-(ET-1) עורק המוח האמצעי, המודל המושרה החסימה (MCAO) עבור שבץ איסכמי בחולדות. בנוסף, שיקולים חשובים, יתרונות וחסרונות של מודל זה הם דנו.

Abstract

שבץ מוחי הוא סיבת מספר אחת לאובדן כושר העבודה וגורם שלישי למוות בעולם, הבעלות של 70 מליארד דולרים מוערכים בארצות הברית ב2009 ^{1, 2.} מספר דגמים של איסכמיה המוחית פותחו כדי לחקות את המצב האנושי של שבץ. היה מי שהציע כי עד 80% מכל מקרי שבץ התוצאה מניזק איסכמי באזור ³ עורק המוח האמצעי (MCA). בתחילת 1990, אנדותלין-1 (ET-1) ⁴ היה בשימוש כדי לגרום לאיסכמיה על ידי יישומו ישירות בסמוך אל פני השטח של MCA לאחר פתיחת גולגולת. מאוחר יותר, מודל זה שונה ⁵ בעזרת הזרקת stereotaxic של ET-1 סמוך לMCA לייצר איסכמיה מוחית מוקדים. היתרונות העיקריים של מודל זה כוללים את היכולת לבצע את ההליך במהירות, היכולת לשלוט בהתכווצות עורק על ידי שינוי המינון של ET-1 נמסר, אין צורך לתפעל את כלי extracranial המספקים דם למוח, כמו גם reperfusi ההדרגתיעל שיעורים שיותר מקרוב מחק reperfusion בבני האדם ^5-7. מצד השני, הדגם ET-1 יש חסרונות הכוללים את הצורך בפתיחת גולגולת, כמו גם השתנות גבוהה יותר בנפח הפעימה ^8. השתנות זו, ניתן להפחית בשימוש בליזר דופלר flowmetry (LDF) כדי לוודא איסכמיה מוחית במהלך עירוי ET-1. גורמים המשפיעים על השתנות שבץ כוללים דיוק של עירוי ויצווה של ET-1 המשמש ^6. שיקול חשוב נוסף הוא שלמרות reperfusion הוא תופעה שכיחה בשבץ מוחי אנושי, את משך הזמן של חסימה לET-1 המושרה MCAO לא יכול מקרוב לחקות את זה של שבץ מוחי האנושי שבו מטופלים רבים יש reperfusion חלקי על פני תקופה של שעות עד ימים לאחר ^{9 ספיגים, 10.} פרוטוקול זה יתאר בפירוט ET-1 מודל MCAO המושרה לשבץ איסכמי בחולדות. זה יהיה גם למשוך תשומת לב לשיקולים מיוחדים וחסרונות פוטנציאליים לאורך כל ההליך.

Protocol

פרוטוקול זה אושר על ידי בעלי החיים והטיפול המוסדי ועדת שימוש (IACUC) באוניברסיטת פלורידה ועומד ב" מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה "(8 מהדורה, האקדמיה הלאומית למדעים, 2011).

חומרים

1. בעלי חיים:, זכר, ספראג Dawley חולדות שמונה בן שבועות (River חוות צ'ארלס, Wilmington, מסצ'וסטס, ארה"ב) שוקלים 250-300 ג'בעת הניתוח.
2. הרדמה
   1. מערכת הרדמת משאיפת (VetEquip Inc, Pleasanton, קליפורניה, ארה"ב)
   2. הרדמת isoflurane (רוקחות בקסטר, Deerfield, IL, ארצות הברית)
3. Stereotaxic המערכת (דוד קופף מכשירים, Tujunga, קליפורניה, ארה"ב)
   1. מערכת stereotaxic חיה קטנה
   2. ברים ללא קרע אוזן לחולדות
   3. בעל ראש הרדמת גז לחולדות
4. ויסות טמפרטורה
   1. BAT-12 מדחום microprobe (עולם Precision מכשירים, Inc, סרסוטה, פלורידה, ארה"ב)
   2. T / משאבה, TP600 שמיכת תרמית (Gaymar תעשיות, Inc, אורצ'רד הפרק, ניו יורק, ארה"ב)
5. מכשירי ניתוח
   1. ידית אזמל ו# 11 להב, אירוס מלקחיים, גרף מלקחיים, מפשק בולדוג קלאמפ, מברג, 10 מזרק עם מחט μl משופעת מד 26 (מכשירי Precision העולם, Inc, סרסוטה, פלורידה, ארה"ב)
   2. תרגיל micromotor ובעל stereotaxic, משוכלל Stereotaxic Injector (Stoelting, עץ דייל, אילינוי, ארה"ב)
   3. סיבוב ספחת 1.0 מ"מ תרגיל, 1.0 מ"מ קונוס הפוכה תרגיל הספחת (Roboz כירורגי Instrument ושות, Inc, גייתרסבורג, מרילנד, ארה"ב)
6. ציוד כירורגי
   1. הרכבת ברגים 0-80 X 3/32 עם 2.4 מ"מ אורך מוט, מדריך לצינורית 21-מד [4 מ"מ ארוך מתחת להדום] ודמה צינורית (פלסטיקה 1, Roanoke, VA, ארצות הברית)
   2. אקריליק ג'ט תותבת ונוזלית (לאנג שיני הייצור ושות, בע"מ, Wheeling, IL, ארצות הברית)
   3. 3.0 ניילון תפר (אואזיס, Mettawa, אילינוי, ארה"ב)
   4. ספוגיות כותנה, משחת העין Puralube (הפישר סיינטיפיק, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב)
   5. קוצץ שיער חשמלי (אוסטר, פרובידנס, רוד איילנד, ארה"ב)
7. כימיקלים
   1. אנדותלין-1 (האמריקאי פפטיד, סאניווייל, קליפורניה, ארה"ב)
   2. כלורהקסידין 2% (Agrilabs, סנט ג'וזף, מיזורי, ארה"ב)
   3. העצירות HCl (Hospira בע"מ, בלייק פורסט, אילינוי, ארה"ב)
8. ציוד הדמיה
   1. מיקרוסקופ הניתוחי (כלי סיילר וייצור; סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)
   2. פנס סיבים אופטי (TechniQuip קורפ, ליברמור, קליפורניה, ארה"ב)
9. ליזר דופלר flowmetry מערכת (ADInstruments, Inc, קולורדו ספרינגס, קולורדו, ארה"ב)
   1. סנטProbe העיפרון andard
   2. בעל Probe
   3. Flowmeter דם
   4. Powerlab 4/30 עם 7 LabChart
10. מדידה של נפח אוטם
    1. עכברוש מוח המטריצה ​​(Zivic-מילר מעבדה., Inc, אליסון פרק, פנסילבניה, ארה"ב)
    2. כלוריד 2,3,5-triphenyltetrazolium (סיגמא אולדריץ ושות, סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב) דולל ל 0.05% ב PBS
    3. סורק (Epson Perfection V30, אפסון אמריקה, Inc, לונג ביץ', קליפורניה, ארה"ב)
    4. תמונת J תוכנה (ImageJ 1.42q תוכנה, מכוני בריאות הלאומי של ארה"ב, Bethesda, מסצ'וסטס, ארה"ב)

1. צעדים טרום ניתוחיים

1. לפני הניתוח, החולדות הם שוכנו במחזור 12:12 אור / חושך עם גישה חופשיה למים והמכרסם צ'או.
2. הרדמה מושרה עם 4% isoflurane ב% תערובת 100 O ₂ גז בתא אינדוקציה עד החולדה כבר לא נסיגות לקמצוץ כפה אחורית.
3. טכניקה ספיגה צריכה להישמר במהלך הליך זה כולל שימוש בכפפות סטריליות, מכשירי ניתוח סטרילי, ווילון כירורגי סטרילי ^11.
4. הכתר של ראשו מגולח עם קוצץ שיער חשמלי.
5. העכברוש שם בתנוחת השכיבה על משטח סופג שוכב על משטח הפעלת טמפרטורה מבוקרת (שמיכת תרמית).
6. הראש ממוקם במנגנון stereotactic מתחיל עם מיקום של מסיכת הרדמת הגז.
7. בשלב בא, בארי האוזן מוכנסים והתהדקו.
8. במהלך הרדמת ההליך נשמר עם 2% isoflurane ב% תערובת גז 100 O _2.
9. משחת עיני חומר סיכה מוחלת על שתי העיניים והעפעפיים סגורים כדי למנוע התייבשות עין במהלך ההליך הכירורגי.
10. בדיקה רקטלית טמפרטורה מוכנסת לשמור על טמפרטורת ליבת חיה קבועה של 37 ± 0.5 מעלות צלזיוס
11. עם הראש בחוזקה בstereotaxicמכשיר, אזור הניתוח מתנקה עם לסירוגין כלורהקסידין 2% ושלוש פעמים מלוחות.

2. צעדי כירורגים

1. באמצעות אזמל, חתך קו אמצע נעשה על העור שמעל calvarium מהיבטי הזנב ביותר של העיניים (nasion) לבין האוזניים (קו עורפי מעולה).
2. לאחר מכן חזר בו העור רוחבי עם 3 מלחציים בולדוג.
3. רקמת חיבור היא להסיר את הגולגולת בעזרת ספוגיות כותנה יבשות, כך שניתן לראות מבנים רבים באופן ברור. אלה כוללים גבחת, תפר העטרה, ורכס גולגולת לרוחב הנכון. ספוגיות כותנה משמשות להסרת דם משדה הניתוח.
4. שימוש במיקרוסקופ הניתוחי, גבחת ממוקמת, והמניפולטורים stereotaxic מותאמים עד ספחת תרגיל סיבוב המ"מ 1.0 מתאפסת בגבחת.
5. אז ספחת התרגיל עבר ל1.6 מ"מ קדמי ו -5.2 מ"מ לרוחב לגבחת.
6. חור ספחת שחודר את הגולגולת נקדח לcannאולא המיקום (איור 1). פסולת ודם עודף נמחקים ללא הרף באמצעות צמר גפן.

בשלב זה, מדריך צינורית יכולה להיות מוכנסת (צעד 7) או הזרקת ET-1 ישירה דרך חור הספחת ניתן לבצע (להמשיך ישירות לשלב 16).

7. חורים בשלב בא, ספחת ל3 ברגי הרכבה הם קדחו בעובי חלקי של הגולגולת באמצעות 1.0 מ"מ קונוס תרגיל ספחת הפוכה (איור 1). חור אחד קדח בכל עצם חזיתית על 1-2 מ"מ קדמי לתפר העטרה ורוחב 1-2 מ"מ לתפר sagittal. חור אחד קדח בעצמות הקודקודית על 2-3 מ"מ אחורי לתפר העטרה ורוחב 2-3 מ"מ לתפר ipsilateral לחור מדריך צינורית ספחת sagittal. שלושה 0-80 x 3/32 ברגי הרכבה ממוקמים בספחת החורים האלה ויספקו תמיכה למלט מחזיק בצינורית. את הברגים צריכים להיות רק כך מתקדמים 2 או 3 סיבובים לא לפגוע עניין הדורה. מדריך הצינורית ממוקמת בבעל צינורית stereotaxic וגבחת ממוקמת.
8. המניפולטורים stereotaxic מותאמים עד מדריך הצינורית מתאפסת בגבחת. הצינורית היא עברה לחור הספחת ממוקם 1.6 מ"מ קדמי ו -5.2 מ"מ לרוחב לגבחת.
9. לבסוף, מדריך הצינורית שמוחדרת אל חור הספחת עם עמדת הקצה הסופית של 4.5 מ"מ גחון לגבחת.
10. מיקום הליזר דופלר זרימת חללית (אופציונלי)
    1. כדי לעקוב אחר זרימת דם במוח באמצעות LDF, בעל חללית ניתן להציב לתוך עמדה לפני הדבקת צינורית המדריך במלט שיניים.
    2. בעל בסיס חללית גזוז סומק עם דום פרט לכרטיסייה בצורת טריז קטנה.
    3. אז בעל החללית ממוקם אחורי למדריך הצינורית ופשוט המדיאלי לרכס הגולגולת הרוחבית עם אורינטצית כרטיסיית מדיאלית (איור 1).
    4. בעל החללית וגרמהuide צינורית הם מודבקים יחדיו באמצעות מלט שיניים.
11. אז מלט שיניים משמש כדי לאבטח את הצינורית במקום. המלט נמצא בקשר עם כל השלושה הברגים ומקיף את כל הבסיס של הצינורית.
12. המלט צריך להיות יבש לחלוטין לפני הסרתו של בעל הצינורית. זה לוקח בערך 5 דקות.

לאחר פעולות אלה, החתך הניתוחי יכול להיות סגור ודמה הצינורית יכול להיות מוברג לתוך צינורית המדריך. לחלופין, ET-1 המושרה MCAO יכול להתבצע על העכברוש לאחר תקופה של התאוששות מניתוח השתלת הצינורית. לשיטה זו, שלב 19 יש לבצע לצד וניתן לבצע את פעולות 14-18 במועד מאוחר יותר. כדי לבצע השתלת צינורית מדריך והזרקת ET-1 במהלך אותו הניתוח, שלב 14 יש לבצע הבא.

14. מזרק העירוי טעון עם ET-1 (בדילול עד 80 מיקרומטר בPBS) ולאחר מכן עלה בstereotaxic המזרק.
15. המניפולטורים stereotaxic מותאמים עד קצה המחט מתאפס בשולי המדריך קנולה.
16. קצה המחט הוא הוריד דרך צינורית המדריך לעמדה של 17.2 מ"מ גחון לשפת המדריך קנולה. אם מדריך צינורית אינה בשימוש, קצה המחט מתאפס בגבחת והוריד דרך חור הספחת ל8.7 מ"מ עמדת גחון לגבחת.
17. 3 μl של 80 מיקרומטר ET1 הוא החדיר בשיעור של 1 לכל μl דקות.
18. המזרק שנותר במקום במשך 3 דקות לאחר העירוי הוא מלא ולאחר מכן הוציא באיטיות.
19. החתך נסגר עם תפר 3.0 ניילון ודמה הצינורית הוא מוברג בצינורית.
20. מינון של משככי כאבים המתאימים (כלומר עצירות ב0.05-0.1 מ"ג / ק"ג) יש להשתמש לאחר הניתוח כדי למזער את כאב ואי נוחות בתקופת ההתאוששות.
21. העכברוש יוסר מחדרי הניתוח והוצב באזור התאוששות חם ויבש כדי למנוע היפותרמיה, עם גישה חופשיה, קלה למזון ומים רכים.

Representative Results

1. הערכת נוירולוגית שלאחר הניתוח

אחרי בעלי החיים חוזרים להכרה, מגוון רחב של בדיקות ניתן להשתמש כדי להעריך את גירעונות נוירולוגיות, כוללים איזון, כוח האחיזה, צבת כפה, יציבה וסימטרית מדרגות לטפס. משימת זרעי החמניות היא הערכה גסה של מנוע ותפקוד חושי שיש קשר מובהק עם נפח האוטם ^{7, 12.} במהלך משימה זו, חולדות הם זמן תוך פתיחה ולצרוך 5 גרעיני חמניות. החמישה הזרעים ממוקמים בפינה אחת של כלוב ריק, יבש, פלסטיק ובילה הזמן לתמרן את זרעיו נרשם. בנוסף, מספר חתיכות קליפה בכלוב לאחר שכל הזרעים כבר נפתחו ונצרכו מוקלט. חולדות עם חסר נוירולוגים גדולים יותר תיקחנה זמן רבים יותר כדי לפתוח ולצרוך את הזרעים ותשבורנה את הפגזים לחלקים נוספים. למרות שאינו חלק רשמי של משימה זו, קל להתבונן טיפול כושל תכוף ושחרור של זרעי החמניותs על ידי חולדות לאחר שבץ ניסיוני. זה כולל בעיקר שימוש בכפו אחד, ולא יעילה נושכת של הפגז בעת הניסיונות לפתיחה.

2. מכתים ומדידת כמותית של נפח אוטם מוחי

לאחר חסימה וreperfusion של MCA להקים איסכמיה מוחית חולפת, חיות מורדמות ומוחות coronally המחולקים מוכתמים בכלוריד 2,3,5-triphenyltetrazolium (TTC) כדי להעריך את נפח האוטם (איור 2) כאמור בפרסומים הקודמים שלנו ^{7, 13.}

איור 1. נוף הגבי של גולגולת החולדה מתאר מיקום חומרה. נוף הגבה זה של גולגולת החולדה עם אורינטציה קדמית מהשמאל מציג את המיקום של גבחת ומבדה ביחס לתפרים שיכולים להיות דמיינו לאחר חיבור סליקהרקמה ממשטח הגולגולת. רכס הגולגולת הרוחבית, מדריך לצינורית, בעל חללית LDF, וברגי עיגון הם גם מוצגים בתרשים עם יחסים יחסית לקרקע סימני גולגולת וכל אחד אחר.

איור 2. סעיפי TTC מוכתמים סידוריים עטרת מוח (2 מ"מ) מעכברוש נתון לET-1 המושרה MCAO. מוח נציג מעכברוש לאחר ET-1 המושרה MCAO מוצג. מוח זה הוסר ונשטף בקרח הקר PBS לפני שנותח בcoronally 2 חלקים עבים מ"מ מתחילים בדיוק זנב לנורות חוש הריח. את הפרוסות אז הודגרו ב0.05% בדילול TTC ב PBS על 37 מעלות צלזיוס לפני שיכבה ב PBS ולאחר מכן תקן בקצרה בפורמלין. רקמה מוכתמת באדום, לאחר חשיפה לחומר אפור TTC מייצגת קיימא. החומר האפור הקיימא בחץ כדור ipsilateral לET-1 הזרקה ניתן להשוות מ 'האפורatter של ההמיספרה הנגדית לחישוב השטח של האוטם המוחי.

Discussion

ET-1 המושרה MCAO הוא מודל ותיק של שבץ איסכמי ניסיוני המשמש באופן קבוע בזני חולדות מרובות. משתנים רבים, כגון מתח חולדה, גיל חיה, טמפרטורת גוף, שיטת הרדמה, ומומחיות מפעיל יכולים להוביל לשונות גדלו בכרכי אוטם בעת שימוש במודל זה ^{5, 14.} עם זאת, מספר חוקרים הראו כי יתרונות של מודל זה כוללים גישה יחסית לא פולשנית, תגובה במינון של זרימת דם במוח לET-1, והיכולת להימנע מהרדמה לחלוטין על ידי עירוי של ET-1 בחולדות מודעות ^{14, 15.} ראוי לציין כי קיימים הבדלים רבים בזן עכברים וגיל שימוש בכל רחבי הספרות ואין זה מפתיע שקואורדינטות stereotaxic שונות דיווחו בהתאם למשתנים אלו. מרכז שימוש בפרוטוקול שלנו מותאמים ל8 חולדות שבוע ישנות גברי ספרג Dawley. כל סטייה מהזן הזה, המין, הגיל או כפי הנראה תדרוש intracerebral להזריקיון של צבע ואחריו נתיחה לאחר מוות כדי לזהות קואורדינטות תקפות להליך זה. בנוסף, הפחתת ET-1 מושרה בזרימת דם במוח היא תלויה במינון. השימוש בשיטה זו המנה גורם לאוטם של כ 30-40% של החומר האפור באונת ipsilateral להזרקה עם שגיאת התקן של הממוצע של כ 4-5% בניסוי ^{7, 16.} הדמיה ישירה של חלקים הפרוקסימלי של MCA מגלה קוטר luminal שהולך ל0% מתחילת המחקר תוך 3 דקות וחוזר לנקודת התחלה בכ 30 דקות ^7. שימוש LDF, זרימה מקסימלי הראתה ירידה של כ 10% מתזרים בסיסי בדקות 5-7 עם חזרה הדרגתית ל60% מתחילת המחקר, לאחר 1 שעה שהניטור הופסק ^16.

פרטים טכניים ספציפיים אחרים שאזכור הצו מפורט להלן:

1. כראוי איתור ומתאפס ציוד stereotaxic בגבחת (תחת הדרכתו המיקרוסקופית) הוא חיוני לinducing שבץ מוצלח. קואורדינטות stereotaxic לעירוי ET-1 צריכות להיות מאומתות לציוד הספציפי הניסיוני ומתח חולדה לפני הניסויים. סביר להניח שאף נגע יתרחש אם העירוי הוא לא בתוך 0.5 מ"מ של ⁶ MCA.
2. יש להיזהר שלא לגרום לניזק למוח כאשר קידוח חור הספחת הראשונית למדריך קנולה. מומלצת שמהירות איטית קידוח לשמש להפעלת חור הספחת ושוב לקראת הסוף, כדי למזער את הסיכוי לחדירה למוח.
3. כאשר קידוח חורי ספחת לברגי ההרכבה, השתמש בספחת תרגיל החרוט ההפוכה כדי ליצור חור ספחת שרק באופן חלקי חודר את הגולגולת. רק לקדוח עמוק מספיק כך שהברגים הם יציבים.
4. כשמלט הצינורית במקום להיות בטוח כדי לשמור על הבטון הברור של העור, כמו גם זרוע stereotaxic. המלט ניתן להשפיע לפני הייבוש באמצעות קיסם אוזניים.
5. הקפד המלט לחלוטין dry והצינורית יציב לפני הסרתו של בעל הצינורית. זה קריטי, כי הצינורית לא זזה לפני הזרקת ET-1.
6. מניסיוננו, מודל שבץ ET-1 יש כ 20% שיעור תמותה עקב ההליך כירורגי. חשוב להשוות את שיעורי תמותה בין קבוצות טיפול וגם ניסויי תכנית כך שגודל המדגם מספיק משמשים עבור נקודתי קצה נוירולוגיות והיסטולוגית.
7. הנחיות לניסויים פרה לטיפול שבץ חריף ממליצות ניטור זרימת דם מוחי וניטור פיסיולוגי של לחץ דם, טמפרטורה, גלוקוז, וגזים בדם כדי להפחית את השונות במהלך ניסויים ^17. LDF הוא שיטה שיכול לשמש לניטור בזמן אמת של זרימת דם באזורים אנטומיים שונים כדי לאמת את סף שנקבע מראש לירידה בזרימה הושגה.
8. הקפד לנקות את המזרק ומחט העירוי עם אתנול ומלוח בין זריקות, ואתנול לפניאחסון. הליך זה ייתן נסיגה והזרקה של בועות ET-1without אוויר או חסימות במהלך פעולה עקבית.

Materials

Animals: Eight-week-old, male, Sprague Dawley rats (Charles River Farms, Wilmington, MA, USA) weighing 250-300 g at the time of surgery. Anesthesia: Inhalation anesthesia system (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA) Isoflurane anesthetic (Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL, USA) Stereotaxic system (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA): Small animal stereotaxic system Non-rupture ear bars for rats Gas anesthesia head holder for rats Temperature regulation: BAT-12 microprobe thermometer (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA) T/PUMP, TP600 Thermal blanket (Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA) Surgical instruments Scalpel handle and #11 blade, iris forceps, Graefe forceps, bulldog clamp retractors, screwdriver, 10 μl syringe with 26 gauge beveled needle (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA) Micromotor drill and stereotaxic holder, Quintessential Stereotaxic Injector (St–lting, Wood Dale, IL, USA) 1.0 mm round drill bur, 1.0 mm inverted cone drill bur (Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA) Surgical Supplies Mounting screws 0-80 X 3/32 with 2.4 mm shaft length, 21-gauge guide cannula [4mm long below the pedestal] and cannula dummy (Plastics one, Roanoke, VA, USA) Jet denture acrylic and liquid (Lang Dental Manufacturing Co., Inc., Wheeling, IL, USA) 3.0 nylon suture (Oasis, Mettawa, IL, USA) Cotton swabs, Puralube eye ointment (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA) Electric hair clippers (Oster, Providence, RI, USA) Chemicals: Endothelin-1 (American Peptide, Sunnyvale, CA, USA) Chlorhexidine 2% (Agrilabs, St. Joseph, MO, USA) Buprenorphine HCl (Hospira Inc., Lake Forest, IL, USA) Visualization Equipment Surgical microscope (Seiler Instrument and Manufacturing; St. Louis, MO, USA) Fiber Optic illuminator (TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA) Laser Doppler flowmetry system (ADInstruments, Inc., Colorado Springs, CO, USA) Standard Pencil Probe Probe holder Blood FlowMeter Powerlab 4/30 with LabChart 7 Measurement of infarct volume: Rat brain matrix (Zivic-Miller Lab., Inc., Allison Park, PA, USA) 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) diluted to 0.05% in PBS Flatbed scanner (Epson Perfection V30, Epson America, Inc., Long Beach, CA, USA) Image J software (ImageJ 1.42q software, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA)