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Endothelin-1 प्रेरित मध्य चूहा में लेजर डॉपलर flowmetry मार्गदर्शन के साथ ischemic स्ट्रोक के लिए मस्तिष्क धमनी रोड़ा मॉडल

Published: February 16, 2013 doi: 10.3791/50014
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 4, 4, 1, 3
1Department of Neurosurgery, University of Florida, 2Department of Anatomical Sciences, Shiraz University of Medical Sciences, Shiraz, Iran, 3Department of Physiology and Functional Genomics, University of Florida, 4Department of Neurology, University of Florida

Summary

मस्तिष्क ischemia के कई पशु मॉडल स्ट्रोक का मानव हालत अनुकरण करने के लिए विकसित किया गया है. इस प्रोटोकॉल endothelin 1 (एट-1) प्रेरित मध्य मस्तिष्क चूहों में ischemic स्ट्रोक के लिए धमनी रोड़ा मॉडल (MCAO) का वर्णन करता है. इसके अलावा, महत्वपूर्ण विचार के फायदे हैं, और इस मॉडल की कमियों पर चर्चा कर रहे हैं.

Abstract

स्ट्रोक विकलांगता और दुनिया में मृत्यु का तीसरा प्रमुख कारण के नंबर एक कारण है, 2009 1, 2 में संयुक्त राज्य अमेरिका में एक अनुमान के अनुसार 70 अरब डॉलर की लागत. मस्तिष्क ischemia के कई मॉडलों स्ट्रोक का मानव हालत की नकल करने के लिए विकसित किया गया है. ऐसा लगता है कि सुझाव दिया गया है मध्य मस्तिष्क धमनी (एमसीए) 3 क्षेत्र में इस्कीमिक नुकसान से सभी स्ट्रोक के परिणाम के 80%. 1990 के दशक के शुरू में, endothelin 1 (ईटी 1) 4 के लिए इसे लागू करने सीधे craniotomy बाद एमसीए की सतह के निकट ischemia प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. बाद में, इस मॉडल एमसीए ET-1 आसन्न stereotaxic इंजेक्शन का उपयोग करने के लिए फोकल मस्तिष्क ischemia उत्पादन से 5 में संशोधित किया गया था. इस मॉडल का मुख्य लाभ प्रक्रिया जल्दी से प्रदर्शन करने की क्षमता, एट-1 की खुराक बदलकर धमनी कसना को नियंत्रित करने की क्षमता वितरित करने के लिए मस्तिष्क को रक्त की आपूर्ति के रूप में के रूप में अच्छी तरह से क्रमिक reperfusi extracranial वाहिकाओं में हेरफेर करने की आवश्यकता नहींदरों पर है कि और अधिक बारीकी से 5-7 मनुष्यों में reperfusion mimics. दूसरी ओर, एट-1 मॉडल नुकसान है कि एक craniotomy के लिए की जरूरत है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से स्ट्रोक 8 मात्रा में उच्च परिवर्तनशीलता है. इस परिवर्तनशीलता एट 1-जलसेक दौरान मस्तिष्क ischemia को सत्यापित करने के लिए लेजर डॉपलर flowmetry (एलडीएफ) के उपयोग के साथ कम किया जा सकता है. स्ट्रोक परिवर्तनशीलता को प्रभावित करने वाले कारक है कि सत और एट-1 के बैच के सटीक 6 का इस्तेमाल किया है. एक अन्य महत्वपूर्ण विचार है कि हालांकि reperfusion मानव स्ट्रोक में एक सामान्य घटना है, एट - एक प्रेरित MCAO के लिए रोड़ा की अवधि निकट कि मानव स्ट्रोक की जहां कई रोगियों को नौ रोड़ा के बाद के दिनों के लिए घंटे की अवधि से अधिक आंशिक reperfusion की नकल न करें हो सकता है, 10. इस प्रोटोकॉल विस्तार एट 1 चूहों में ischemic स्ट्रोक के लिए प्रेरित MCAO मॉडल में वर्णन करेंगे. यह भी प्रक्रिया के दौरान विशेष विचार और संभावित कमियों को ध्यान आकर्षित करेगा.

Protocol

इस प्रोटोकॉल संस्थागत पशु की देखभाल और फ्लोरिडा के विश्वविद्यालय में उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया था और के अनुपालन में है "देखभाल के लिए गाइड और प्रयोगशाला पशु का प्रयोग" (8 संस्करण, नेशनल एकेडमी ऑफ साइंसेज, 2011).

सामग्री

  1. पशु: आठ सप्ताह पुराने, पुरुष, Sprague Dawley चूहों (चार्ल्स नदी फार्म, Wilmington, MA, संयुक्त राज्य अमेरिका) सर्जरी के समय में 250-300 ग्राम वजन.
  2. संज्ञाहरण
    1. अभिश्वसन संज्ञाहरण प्रणाली (VetEquip इंक, Pleasanton, CA, संयुक्त राज्य अमरीका)
    2. Isoflurane चतनाशून्य करनेवाली औषधि (बैक्सटर फार्माक्युटिक्स, Deerfield, आईएल, संयुक्त राज्य अमरीका)
  3. Stereotaxic प्रणाली (डेविड Kopf उपकरण, Tujunga, सीए, संयुक्त राज्य अमेरिका)
    1. छोटे जानवर stereotaxic प्रणाली
    2. चूहों के लिए गैर टूटना कान सलाखों
    3. चूहों के लिए गैस संज्ञाहरण सिर धारक
  4. तापमान विनियमन
    1. बैट 12 microprobe थर्मामीटर (विश्व परिशुद्धता उपकरण, इंक, Sarasota, FL, संयुक्त राज्य अमरीका)
    2. टी / पम्प, TP600 थर्मल (कंबल Gaymar इंडस्ट्रीज इंक,, पार्क बागवानी, NY, संयुक्त राज्य अमरीका)
  5. सर्जिकल उपकरणों
    1. स्केल्पल हैंडल और # 11 ब्लेड, आईरिस संदंश, Graefe संदंश, बुलडॉग क्लैंप retractors, पेचकश, 26 गेज beveled सुई (विश्व परिशुद्धता उपकरण, इंक, Sarasota, FL, संयुक्त राज्य अमरीका) के साथ 10 μl सिरिंज
    2. Micromotor ड्रिल और stereotaxic धारक, Quintessential Stereotaxic इंजेक्टर (Stoelting, लकड़ी डेल, आईएल, संयुक्त राज्य अमरीका)
    3. 1.0 मिमी दौर ड्रिल बर, 1.0 मिमी औंधा शंकु ड्रिल बर (Roboz सर्जिकल उपकरण कं इंक,, Gaithersburg, एमडी, संयुक्त राज्य अमरीका)
  6. शल्य चिकित्सा की आपूर्ति
    1. 2.4 मिमी शाफ्ट लंबाई, 21-गेज गाइड प्रवेशनी [कुरसी के नीचे लंबे समय 4mm] और प्रवेशनी डमी (एक प्लास्टिक, Roanoke शिकंजा 0-80 एक्स 3/32 के साथ बढ़ते, VA, संयुक्त राज्य अमेरिका)
    2. जेट कृत्रिम दांतों की पंक्ति ऐक्रेलिक और तरल (लैंग चिकित्सकीय विनिर्माण कंपनी इंक,, Wheeling, आईएल, संयुक्त राज्य अमरीका)
    3. 3.0 नायलॉन सीवन (ओएसिस, Mettawa, आईएल, संयुक्त राज्य अमरीका)
    4. कपास swabs, Puralube आँख मरहम (फिशर साइंटिफिक, Pittsburg, फिलीस्तीनी अथॉरिटी, संयुक्त राज्य अमेरिका)
    5. इलेक्ट्रिक बाल कतरनी (Oster, प्रोविडेंस, आरआई, संयुक्त राज्य अमरीका)
  7. रसायन
    1. Endothelin 1 (अमेरिकन पेप्टाइड, Sunnyvale, सीए, संयुक्त राज्य अमेरिका)
    2. 2% (Agrilabs, सेंट जोसेफ, एमओ, यूएसए) chlorhexidine
    3. Buprenorphine एचसीएल (Hospira इंक, झील वन, आईएल, संयुक्त राज्य अमेरिका)
  8. विज़ुअलाइज़ेशन उपकरण
    1. सर्जिकल माइक्रोस्कोप (Seiler साधन और विनिर्माण, सेंट लुइस, MO, संयुक्त राज्य अमरीका)
    2. फाइबर ऑप्टिक प्रकाशक (TechniQuip कार्पोरेशन, लिवरमोर, सीए, संयुक्त राज्य अमेरिका)
  9. लेजर डॉपलर flowmetry प्रणाली (ADInstruments, इंक, कोलोराडो स्प्रिंग्स, सीओ, संयुक्त राज्य अमेरिका)
    1. सेंटandard पेंसिल जांच
    2. जांच धारक
    3. रक्त flowmeter
    4. 30 4/7 LabChart साथ Powerlab
  10. रोधगलितांश मात्रा के मापन
    1. चूहा मस्तिष्क मैट्रिक्स (Zivic मिलर लैब इंक, एलीसन पार्क, PA, संयुक्त राज्य अमेरिका)
    2. 2,3,5 triphenyltetrazolium क्लोराइड (सिग्मा Aldrich कं, सेंट लुइस, MO, संयुक्त राज्य अमेरिका) पीबीएस में 0.05% पतला
    3. Flatbed स्कैनर (Epson पूर्णता V30, Epson अमेरिका इंक, लांग बीच, सीए, संयुक्त राज्य अमेरिका)
    4. छवि जम्मू सॉफ्टवेयर (ImageJ 1.42q सॉफ्टवेयर, अमेरिका के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, बेथेस्डा, एमए, संयुक्त राज्य अमरीका)

1. पूर्व शल्य कदम

  1. सर्जरी से पहले, चूहों पानी और कृंतक चाउ के लिए स्वतंत्र पहुँच के साथ 12:12 / प्रकाश अंधेरे चक्र के तहत रखे जाते हैं.
  2. संज्ञाहरण 4% चूहे तक 100% ओ 2 एक प्रेरण कक्ष में गैस का मिश्रण में नहीं रह isoflurane पीछे पंजा चुटकी निकासी के साथ प्रेरित है.
  3. एकसेप्टिक तकनीक बाँझ दस्ताने, बाँझ सर्जिकल उपकरणों, और एक बाँझ शल्य कपड़ा 11 के उपयोग सहित इस प्रक्रिया के दौरान बनाए रखा जाना चाहिए.
  4. बिजली बाल कतरनी के साथ सिर का ताज मुंडा है.
  5. चूहे एक शोषक ऑपरेटिंग तापमान नियंत्रित सतह (थर्मल कंबल) पर झूठ बोल पैड पर प्रवण स्थिति में रखा गया है.
  6. सिर stereotactic गैस चतनाशून्य करनेवाली औषधि चेहरा मुखौटा की नियुक्ति के साथ शुरू तंत्र में रखा गया है.
  7. अगला, कान सलाखों डाला और कड़ी कर दी गई है.
  8. प्रक्रिया संज्ञाहरण के दौरान 2 100% हे 2 गैस मिश्रण में isoflurane% के साथ बनाए रखा है.
  9. स्नेहक नेत्र मरहम दोनों आंखों के लिए लागू किया जाता है, और पलकें शल्य प्रक्रिया के दौरान आंख desiccation को रोकने के लिए बंद हो जाती हैं.
  10. एक गुदा तापमान जांच के लिए 37 ± 0.5 ° सी. के एक निरंतर पशु कोर तापमान बनाए रखने के लिए डाला जाता है
  11. Stereotaxic में मजबूती से आयोजित सिर के साथउपकरण, शल्य चिकित्सा के क्षेत्र में 2% chlorhexidine और खारा तीन बार बारी के साथ शुद्ध है.

2. सर्जिकल कदम

  1. एक स्केलपेल का उपयोग करना, एक midline चीरा आँखों के सबसे लांगुलिय पहलुओं (nasion) कान (बेहतर गुद्दी लाइन) के बीच से calvarium overlying त्वचा पर किया जाता है.
  2. त्वचा तो 3 एक प्रकार का कुत्त clamps के साथ laterally मुकर गया.
  3. संयोजी ऊतक सूखी कपास swabs का उपयोग करने के लिए इतना है कि कई संरचनाओं को स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है खोपड़ी से निकाल दिया जाता है. ये शीर्षस्थान, राज्याभिषेक, सिवनी, और सही पार्श्व खोपड़ी रिज शामिल हैं. कपास swabs के लिए शल्य चिकित्सा के क्षेत्र से खून निकालने के लिए किया जाता है.
  4. शल्य सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग, शीर्षस्थान स्थित है, और जब तक 1.0 मिमी दौर ड्रिल बर शीर्षस्थान पर चुना है stereotaxic manipulators समायोजित कर रहे हैं.
  5. ड्रिल बर तो पूर्वकाल 1.6 मिमी और 5.2 मिमी शीर्षस्थान पार्श्व के लिए ले जाया जाता है.
  6. एक बर छेद है कि खोपड़ी प्रवेश cann के लिए drilled हैula प्लेसमेंट (1 चित्रा). अतिरिक्त मलबे और रक्त लगातार कपास swabs का उपयोग करने को मंजूरी दे दी है.

इस बिंदु पर, एक गाइड प्रवेशनी (7 कदम) डाला जा सकता है या बर छेद के माध्यम से एक प्रत्यक्ष इंजेक्शन ET-1 (सीधे आगे बढ़ने के लिए 16 कदम) किया जा सकता है.

  1. अगले 3 बढ़ते शिकंजा के लिए, बर छेद drilled खोपड़ी के आंशिक मोटाई के माध्यम से एक 1.0 मिमी औंधा शंकु ड्रिल बर (चित्रा 1) का उपयोग कर रहे हैं. एक छेद प्रत्येक ललाटास्थि में 1-2 मिमी राज्याभिषेक सिवनी और 1-2 मिमी बाण के समान सीवन के लिए पार्श्व पूर्वकाल के बारे में drilled है. पार्श्विका हड्डी में 2-3 मिमी राज्याभिषेक सिवनी और 2-3 मिमी बाण के समान सीवन गाइड प्रवेशनी बर छेद ipsilateral पार्श्व पीछे के बारे में एक छेद drilled है. तीन 0-80 x 32 3 / बढ़ते शिकंजा इन बर छेद में रखा जाता है और प्रवेशनी में पकड़े सीमेंट के लिए समर्थन प्रदान करेगा. शिकंजा केवल उन्नत 2 या 3 बदल जाता है तो होना चाहिए के रूप में नुकसान नहीं ड्यूरा बात. गाइड प्रवेशनी stereotaxic प्रवेशनी धारक में रखा जाता है और शीर्षस्थान स्थित है.
  2. stereotaxic manipulators समायोजित कर रहे हैं जब तक गाइड प्रवेशनी शीर्षस्थान पर चुना है. प्रवेशनी बर पूर्वकाल 1.6 मिमी और 5.2 मिमी शीर्षस्थान पार्श्व स्थित छेद करने के लिए ले जाया जाता है.
  3. अंत में, गाइड प्रवेशनी 4.5 मिमी शीर्षस्थान के लिए उदर की अंतिम टिप की स्थिति के साथ बर छेद में उतारा है.
  4. लेजर डॉपलर प्रवाह जांच प्लेसमेंट (वैकल्पिक)
    1. एलडीएफ का उपयोग करते हुए आदेश में मस्तिष्क में रक्त प्रवाह की निगरानी करने के लिए, एक जांच धारक की स्थिति में रखा जा सकता है पूर्व दंत सीमेंट के साथ गाइड प्रवेशनी affixing.
    2. जांच धारक आधार कुरसी के साथ छोटे पच्चर के आकार टैब के लिए छोड़कर फ्लश छंटनी की है.
    3. जांच धारक तो गाइड प्रवेशनी के पीछे है और सिर्फ मध्यवर्ती उन्मुख टैब (1 चित्रा) के साथ पार्श्व खोपड़ी रिज औसत दर्जे का रखा गया है.
    4. जांच धारक और छuide प्रवेशनी दंत सीमेंट का प्रयोग एक साथ चिपका रहे हैं.
  5. चिकित्सकीय सीमेंट तो जगह में cannula सुरक्षित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. सीमेंट सभी तीन शिकंजा के साथ संपर्क में है और प्रवेशनी की पूरी आधार चारों ओर है.
  6. सीमेंट प्रवेशनी धारक को हटाने से पहले पूरी तरह से सूखा होना चाहिए. इस बारे में 5 मिनट लगते हैं.

इन चरणों के बाद, शल्य चीरा और बंद किया जा सकता है प्रवेशनी डमी गाइड प्रवेशनी में दबाव डाला जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, एट 1 प्रेरित MCAO प्रवेशनी आरोपण सर्जरी से वसूली की अवधि के बाद चूहे पर किया जा सकता है. इस विधि के लिए 19 कदम अगले प्रदर्शन किया जाना चाहिए और 14-18 कदम एक बाद में समय पर किया जा सकता है. गाइड प्रवेशनी आरोपण और एट-1 इंजेक्शन ही सर्जरी के दौरान प्रदर्शन करने के लिए 14 कदम अगले किया जाना चाहिए.

  1. जलसेक सिरिंज एट-1 के साथ भरी हुई है (पीबीएस में 80 सुक्ष्ममापी को पतला) और फिर stereotaxic सुई लगानेवाला में घुड़सवार.
  2. stereotaxic manipulators समायोजित कर रहे हैं जब तक सुई टिप गाइड प्रवेशनी के रिम में चुना है.
  3. सुई टिप गाइड प्रवेशनी के माध्यम से 17.2 मिमी गाइड प्रवेशनी के रिम के लिए उदर की एक स्थिति के लिए कम है. यदि एक गाइड प्रवेशनी नहीं किया है, सुई टिप शीर्षस्थान में चुना है और बर छेद के माध्यम से एक स्थिति 8.7 मिमी शीर्षस्थान के लिए उदर कम.
  4. 80 सुक्ष्ममापी ET1 3 μl प्रति मिनट 1 μl की एक दर पर संचार होता है.
  5. सिरिंज जगह में 3 मिनट के लिए छोड़ दिया है, के बाद जलसेक पूर्ण और फिर धीरे धीरे हटा दिया है.
  6. चीरा 3.0 नायलॉन सिवनी और प्रवेशनी डमी प्रवेशनी में खराब कर दिया है के साथ बंद कर दिया है.
  7. उपयुक्त एनाल्जेसिक की एक खुराक (मिलीग्राम 0.05-.1 / किलो पर यानी buprenorphine) सर्जरी के बाद इस्तेमाल किया जाना चाहिए वसूली की अवधि के दौरान दर्द और परेशानी को कम करने के लिए.
  8. चूहे शल्य सूट से निकाल दिया जाता है और एक गर्म, शुष्क वसूली क्षेत्र में रखा हाइपोथर्मिया मुक्त, नरम भोजन और पानी के लिए आसान पहुँच के साथ रोकने के.

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Representative Results

1. बाद सेशन स्नायविक मूल्यांकन

बाद पशु होश नहीं आ जाता है, परीक्षण की एक विस्तृत विविधता संतुलन, ताकत पकड़, पंजा रखने, postural विषमता और चढ़ाई सीढ़ी सहित न्यूरोलॉजिकल घाटा का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सूरजमुखी के बीज का कार्य के मोटर और संवेदी समारोह में कहा कि रोधगलितांश मात्रा 7, 12 के साथ महत्वपूर्ण संबंध है के सकल मूल्यांकन है. इस कार्य के दौरान, चूहों समय खोलने और 5 सूरजमुखी के बीज उपभोक्ता समय पर कर रहे हैं. पाँच बीज एक खाली है, सूखी, प्लास्टिक पिंजरे के एक कोने में रखा जाता है और बीज जोड़ तोड़ समय बिताया दर्ज की गई है. इसके अलावा, पिंजरे में खोल के टुकड़े की संख्या सभी बीज के बाद खोला गया है और खपत दर्ज की गई है. अधिक से अधिक स्नायविक घाटे के साथ चूहे अब लेने के लिए खुला है और बीज की खपत और अधिक टुकड़ों में गोले टूट जाएगा. हालांकि इस कार्य का औपचारिक हिस्सा नहीं है, यह आसान है के लिए लगातार mishandling और सूरजमुखी के बीज के गिर (नियम आदि का) पालन करनाप्रयोगात्मक स्ट्रोक के बाद चूहों द्वारा. यह मुख्य रूप से एक forepaw, और अप्रभावी करने के लिए खोलने के प्रयास के दौरान खोल के काटने का उपयोग भी शामिल है.

2. धुंधला और मस्तिष्क रोधगलितांश मात्रा की मात्रात्मक माप

रोड़ा और एमसीए की reperfusion क्षणिक मस्तिष्क ischemia स्थापित करने के बाद, पशुओं euthanized हैं और उनके coronally sectioned दिमाग 2,3,5 triphenyltetrazolium क्लोराइड (टीटीसी) के साथ दाग रहे हैं रोधगलितांश (2 चित्रा) की मात्रा के रूप में हमारे पिछले प्रकाशनों में चर्चा का मूल्यांकन 7, 13.

चित्रा 1
चित्रा 1. चूहा खोपड़ी के पृष्ठीय दृश्य हार्डवेयर प्लेसमेंट चित्रण बाईं पूर्वकाल उन्मुख के साथ चूहे खोपड़ी के इस पृष्ठीय दृश्य sutures कि कल्पना की जा सकती संबंध साथ पर्वबिन्दु और लैम्ब्डा संयोजी समाशोधन के बाद स्थान से पता चलता हैखोपड़ी की सतह से ऊतक. पार्श्व खोपड़ी रिज, गाइड प्रवेशनी, एलडीएफ जांच धारक, और प्रस्तोता शिकंजा भी खोपड़ी भूमि के निशान और एक दूसरे के रिश्तेदार रिश्तों के साथ चित्र पर दिखाए जाते हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2. टीटीसी दाग धारावाहिक चूहे से राज्याभिषेक मस्तिष्क वर्गों (2 मिमी) ET-1 प्रेरित MCAO अधीन ET-1 प्रेरित MCAO एक चूहे के बाद से एक प्रतिनिधि मस्तिष्क दिखाया गया है. यह मस्तिष्क को हटा दिया गया था और बर्फ के ठंडे पीबीएस में rinsed पहले coronally sectioned 2 मिमी मोटी सिर्फ घ्राण बल्ब लांगुलिय शुरू वर्गों में किया जा रहा है. स्लाइस तो 0.05% में incubated रहे थे 37 में पीबीएस में पतला टीटीसी ° C से पहले पीबीएस में quenched और फिर formalin में संक्षेप में तय है. ऊतक लाल दाग के बाद टीटीसी के लिए जोखिम व्यवहार्य ग्रे बात का प्रतिनिधित्व करता है. ET-1 इंजेक्शन ipsilateral गोलार्द्ध में व्यवहार्य ग्रे बात ग्रे मीटर के लिए तुलना की जा सकती हैcontralateral गोलार्द्ध के Atter मस्तिष्क रोधगलितांश के क्षेत्र की गणना करने के लिए.

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Discussion

ET-1 प्रेरित MCAO प्रयोगात्मक ischemic स्ट्रोक है कि नियमित रूप से कई चूहे उपभेदों में प्रयोग किया जाता है का एक स्थापित मॉडल है. चूहा तनाव, पशु उम्र, शरीर का तापमान, संज्ञाहरण विधि, और ऑपरेटर विशेषज्ञता के रूप में इस तरह के कई चर, रोधगलितांश मात्रा में वृद्धि की परिवर्तनशीलता नेतृत्व जब इस 5 मॉडल, 14 का उपयोग कर सकते हैं. हालांकि, कई जांचकर्ताओं को पता चला है कि इस मॉडल का लाभ अपेक्षाकृत गैर इनवेसिव दृष्टिकोण, एट-1 के लिए मस्तिष्क में रक्त के प्रवाह की खुराक प्रतिक्रिया, और संज्ञाहरण के प्रति जागरूक चूहों 14, 15 में ईटी-1 के अर्क से पूरी तरह से बचने की क्षमता शामिल है. यह उल्लेखनीय है कि साहित्य में इस्तेमाल किया चूहा तनाव और उम्र में कई मतभेद हैं और यह आश्चर्य की बात नहीं है कि अलग stereotaxic निर्देशांक इन चर पर निर्भर करता है रिपोर्ट कर रहे हैं. निर्देशांक हमारे प्रोटोकॉल में इस्तेमाल 8 सप्ताह पुराने पुरुष Sprague Dawley चूहों के लिए अनुकूलित कर रहे हैं. इस तनाव, लिंग, या उम्र से कोई विचलन की संभावना की आवश्यकता intracerebral इंजेक्षन जाएगाडाई के आयन necropsy द्वारा पीछा करने के लिए इस प्रक्रिया के लिए वैध निर्देशांक की पहचान कर सकते हैं. इसके अतिरिक्त, मस्तिष्क में रक्त के प्रवाह में कमी प्रेरित एट-1 खुराक निर्भर है. इस विधि में खुराक का उपयोग एक 7 प्रयोग, 16 के भीतर एक के बारे में 4-5% का मतलब की मानक त्रुटि के साथ इंजेक्शन के लिए ipsilateral गोलार्द्ध में ग्रे मामले की लगभग 30-40% की एक रोधगलन का कारण बनता है. एमसीए के समीपस्थ भाग के प्रत्यक्ष दृश्य एक luminal व्यास है कि 3 मिनट और लगभग 30 7 मिनट पर रिटर्न आधारभूत भीतर आधारभूत की 0% करने के लिए चला जाता है पता चलता है. एलडीएफ का उपयोग करना, अधिकतम प्रवाह 5-7 मिनट में 1 घंटा निगरानी जो 16 बंद किया गया था के बाद आधारभूत की 60% करने के लिए क्रमिक वापसी के साथ आधारभूत प्रवाह का लगभग 10% करने के लिए कम करने के लिए दिखाया गया था.

अन्य विशिष्ट तकनीकी जानकारी है कि वारंट उल्लेख नीचे सूचीबद्ध हैं:

  1. सही ढंग से पता लगाने और शीर्षस्थान पर stereotaxic उपकरण (सूक्ष्म मार्गदर्शन के तहत) zeroing induci के लिए महत्वपूर्ण हैएनजी एक सफल स्ट्रोक. जलसेक एट-1 के लिए stereotaxic निर्देशांक विशिष्ट प्रयोगात्मक उपकरण और चूहा तनाव प्रयोग करने से पहले के लिए सत्यापित किया जाना चाहिए. यह संभावना है कि कोई घाव है अगर जलसेक 6 एमसीए की 0.5 मिमी के भीतर नहीं है घटित होगा.
  2. देखभाल करने के लिए मस्तिष्क को नुकसान का कारण नहीं है जब गाइड प्रवेशनी के के लिए प्रारंभिक बर छेद ड्रिलिंग. यह सिफारिश की है कि एक धीमी गति ड्रिलिंग बर छेद शुरू और अंत की ओर फिर से इतनी के रूप में मस्तिष्क में प्रवेश की संभावना को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा.
  3. जब बढ़ते शिकंजा के लिए छेद ड्रिलिंग बर, उल्टे शंकु ड्रिल बर का उपयोग करने के लिए एक बर छेद है कि केवल आंशिक रूप खोपड़ी प्रवेश. केवल ड्रिल गहरी पर्याप्त इतना है कि शिकंजा स्थिर रहे हैं.
  4. जब जगह में cannula जोड़नेवाला त्वचा की स्पष्ट सीमेंट के रूप में के रूप में अच्छी तरह से stereotaxic हाथ रखने के लिए सुनिश्चित हो. सीमेंट एक कपास झाड़ू का उपयोग सुखाने के लिए पहले चालाकी से किया जा सकता है.
  5. सुनिश्चित रहो सीमेंट पूरी तरह से डॉ. हैy और प्रवेशनी स्थिर प्रवेशनी धारक को हटाने से पहले है. यह महत्वपूर्ण है कि प्रवेशनी एट एक इंजेक्शन के लिए पहले कदम नहीं है.
  6. हमारे अनुभव में, एट-1 स्ट्रोक मॉडल एक लगभग 20% शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया की वजह से मृत्यु दर है. यह महत्वपूर्ण है कि उपचार समूहों और भी योजना प्रयोगों के बीच मृत्यु दर की तुलना इतना है कि पर्याप्त नमूना आकार तंत्रिका विज्ञान और histological endpoints के लिए उपयोग किया जाता है.
  7. तीव्र स्ट्रोक के उपचार के लिए preclinical परीक्षण के लिए दिशानिर्देश मस्तिष्क में रक्त के प्रवाह की निगरानी और रक्तचाप के शारीरिक निगरानी, ​​तापमान, ग्लूकोज, और रक्त gasses की सिफारिश 17 प्रयोगों के दौरान परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए. एलडीएफ एक तरीका है कि विभिन्न संरचनात्मक क्षेत्रों में वास्तविक समय रक्त के प्रवाह की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रवाह में कमी के लिए एक पूर्व निर्धारित दहलीज सत्यापित हासिल किया गया है.
  8. इथेनॉल और इंजेक्शन के बीच नमक के साथ जलसेक सिरिंज और सुई को साफ करने के लिए यकीन है, और करने से पहले इथेनॉलभंडारण. यह प्रक्रिया लगातार वापसी और एट 1without हवा बुलबुले या आपरेशन के दौरान रुकावटों का इंजेक्शन दे देंगे.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन ग्रेटर दक्षिण पूर्व (09GRNT2060421) संबद्ध, अमेरिकन मेडिकल एसोसिएशन, और फ्लोरिडा नैदानिक ​​और translational विज्ञान संस्थान के विश्वविद्यालय से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. एडम मक्का / एनआईएच NINDS, एनआरएसए predoctoral साथी (F30 NS +०,६०,३३५) है. रॉबर्ट Regenhardt उच्च रक्तचाप में फ्लोरिडा इन दोनों क्षेत्रों ट्रेनिंग प्रोग्राम के विश्वविद्यालय (T32 HL 083,810) से predoctoral फेलोशिप समर्थन प्राप्त है.

Materials

  1. Animals: Eight-week-old, male, Sprague Dawley rats (Charles River Farms, Wilmington, MA, USA) weighing 250-300 g at the time of surgery.
  2. Anesthesia:
    1. Inhalation anesthesia system (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA)
    2. Isoflurane anesthetic (Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL, USA)
  3. Stereotaxic system (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA):
    1. Small animal stereotaxic system
    2. Non-rupture ear bars for rats
    3. Gas anesthesia head holder for rats
  4. Temperature regulation:
    1. BAT-12 microprobe thermometer (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA)
    2. T/PUMP, TP600 Thermal blanket (Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA)
  5. Surgical instruments
    1. Scalpel handle and #11 blade, iris forceps, Graefe forceps, bulldog clamp retractors, screwdriver, 10 μl syringe with 26 gauge beveled needle (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA)
    2. Micromotor drill and stereotaxic holder, Quintessential Stereotaxic Injector (St–lting, Wood Dale, IL, USA)
    3. 1.0 mm round drill bur, 1.0 mm inverted cone drill bur (Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA)
  6. Surgical Supplies
    1. Mounting screws 0-80 X 3/32 with 2.4 mm shaft length, 21-gauge guide cannula [4mm long below the pedestal] and cannula dummy (Plastics one, Roanoke, VA, USA)
    2. Jet denture acrylic and liquid (Lang Dental Manufacturing Co., Inc., Wheeling, IL, USA)
    3. 3.0 nylon suture (Oasis, Mettawa, IL, USA)
    4. Cotton swabs, Puralube eye ointment (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA)
    5. Electric hair clippers (Oster, Providence, RI, USA)
  7. Chemicals:
    1. Endothelin-1 (American Peptide, Sunnyvale, CA, USA)
    2. Chlorhexidine 2% (Agrilabs, St. Joseph, MO, USA)
    3. Buprenorphine HCl (Hospira Inc., Lake Forest, IL, USA)
  8. Visualization Equipment
    1. Surgical microscope (Seiler Instrument and Manufacturing; St. Louis, MO, USA)
    2. Fiber Optic illuminator (TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA)
  9. Laser Doppler flowmetry system (ADInstruments, Inc., Colorado Springs, CO, USA)
    1. Standard Pencil Probe
    2. Probe holder
    3. Blood FlowMeter
    4. Powerlab 4/30 with LabChart 7
  10. Measurement of infarct volume:
    1. Rat brain matrix (Zivic-Miller Lab., Inc., Allison Park, PA, USA)
    2. 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) diluted to 0.05% in PBS
    3. Flatbed scanner (Epson Perfection V30, Epson America, Inc., Long Beach, CA, USA)
    4. Image J software (ImageJ 1.42q software, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA)

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References

  1. Stroke--1989. Recommendations on stroke prevention, diagnosis, and therapy. Report of the WHO Task Force on Stroke and other Cerebrovascular Disorders. Stroke. 20, 1407-1431 (1989).
  2. Lloyd-Jones, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 119, 480-486 (2009).
  3. Mohr, J. P., Gautier, J. C., Hier, D., Stein, R. W. Stroke: pathophysiology, diagnosis, and management. Barnett, H. J. M., Stein, B. M., Mohr, J. P., Yatsu, F. M. , Churchill Livingstone. New York. 377-450 (1986).
  4. Robinson, M. J., Macrae, I. M., Todd, M., Reid, J. L., McCulloch, J. Reduction of local cerebral blood flow to pathological levels by endothelin-1 applied to the middle cerebral artery in the rat. Neurosci. Lett. 118, 269-272 (1990).
  5. Sharkey, J., Ritchie, I. M., Kelly, P. A. Perivascular microapplication of endothelin-1: a new model of focal cerebral ischaemia in the rat. J. Cereb. Blood Flow Metab. 13, 865-871 (1993).
  6. O'Neill, M. J., Clemens, J. A. Rodent models of focal cerebral ischemia. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 9 (Unit 9), (2001).
  7. Mecca, A. P., O'Connor, T. E., Katovich, M. J., Sumners, C. Candesartan pretreatment is cerebroprotective in a rat model of endothelin-1-induced middle cerebral artery occlusion. Exp. Physiol. 94, 937-946 (2009).
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  16. Mecca, A. P., et al. Cerebroprotection by angiotensin-(1-7) in endothelin-1-induced ischaemic stroke. Exp. Physiol. 96 (1-7), 1084-1096 (2011).
  17. Fisher, M., et al. Update of the stroke therapy academic industry roundtable preclinical recommendations. Stroke. 40, 2244-2250 (2009).

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Endothelin-1 प्रेरित मध्य चूहा में लेजर डॉपलर flowmetry मार्गदर्शन के साथ ischemic स्ट्रोक के लिए मस्तिष्क धमनी रोड़ा मॉडल
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Ansari, S., Azari, H., Caldwell, K.… More

Ansari, S., Azari, H., Caldwell, K. J., Regenhardt, R. W., Hedna, V. S., Waters, M. F., Hoh, B. L., Mecca, A. P. Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Rat. J. Vis. Exp. (72), e50014, doi:10.3791/50014 (2013).

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