Summary
脳虚血の動物モデルは、ストロークの人間の状態をシミュレートするために開発されてきた。このプロトコルは、ラットの虚血性脳卒中のエンドセリン-1（ET-1）誘発中大脳動脈閉塞（MCAO）モデルについて説明します。加えて、重要な考慮事項、利点、およびこのモデルの欠点が議論されている。
Abstract
脳卒中は、2009年1、2に米国で推定700億ドルの原価計算、障害、世界中で死亡原因の第3位の数が原因の一つです。脳虚血のいくつかのモデルは、ストロークの人間の条件を模倣するために開発されてきた。それは、中大脳動脈（MCA）領域3における虚血性損傷からすべてのストロークの結果の80％にあることを示唆されている。 1990年代初頭に、エンドセリン-1（ET-1）4は開頭後にMCAの表面に直接隣接してそれを適用することにより、虚血を誘発するために使用されていました。その後、このモデルは局所脳虚血を生成するMCAにET-1を隣接の定位注入を使用して5に行われました。このモデルの主な利点は、迅速に手続きを実行する能力、ET-1の投与量を変更することによって、動脈の狭窄を制御する能力配信、脳に血液を供給するだけでなく、徐々にreperfusi頭蓋外の血管を操作する必要はありませんを含む率にすることは、より密接に5月7日 、ヒトでの再灌流を模倣しています。一方、ET-1のモデルは、開頭手術の必要性だけでなく、行程容積8の高い変動性を含むデメリットがあります。この変動は、ET-1の注入の間脳虚血を確認するためにレーザードップラーフローメトリー（LDF）の使用を低減することができる。ストローク変動に影響を与える要因としては、輸液の精度を含め、ET-1のバッチは6を使用していました 。もう一つの重要な考慮事項は、再灌流は、人間の脳梗塞における一般的な発生は、ET-1誘導MCAOが密接に多くの患者が閉塞9以下の数時間から数日の期間にわたって部分的な再灌流を持ってどこに人間の脳梗塞のことを模倣していてもよいために閉塞の持続時間ですが、ということです10。このプロトコルは、具体的にラットの虚血性脳卒中のためのET-1誘発MCAOモデルについて説明します。また、作業中は、特別な考慮事項と潜在的な欠点に注意を喚起します。
Protocol
このプロトコルは、インスティテューショナルアニマルケアによって承認され、使用フロリダ大学の委員会（動物実験委員会）及び "実験動物の管理と使用に関する指針"（第8版、全米科学アカデミー、2011）に準拠していました。
材料
- 動物：8週齢、雄、手術時に250〜300グラムの重量を量るのSprague Dawleyラット（Charles River農場、ウィルミントン、MA、USA）。
- 麻酔
- 吸入麻酔システム（VetEquip社、プレザントン、カリフォルニア州、米国）
- イソフルラン麻酔（バクスター薬学、ディアフィールド、イリノイ州、アメリカ）
- 定位システム（デヴィッド·インスツルメンツKopfは、タハンガ、CA、USA）を
- 小動物の定位システム
- ラットの非破裂耳バー
- ラット用ガス麻酔ヘッドホルダー
- 温度調節
- BAT-12マイクロプローブ温度計（世界プレシジョンインスツルメンツ社、サラソタ、フロリダ州、米国）
- T /ポンプ、TP600サーマルブランケット（Gaymarインダストリーズ社、Orchard Park、ニューヨーク、アメリカ）
- 手術器具
- スカルペルハンドルと＃11ブレード、虹彩ピンセット、鉗子グレーフェ、スクリュードライバーブルドッグクランプリトラクター、26ゲージ針ベベル（ワールド·精密機器株式会社、サラソタ、フロリダ州、米国）と10μLシリンジ
- マイクロモータ、ドリルと定位ホルダー、典型的なマニピュレーターインジェクター（Stoelting、ウッドデール、イリノイ、米国）
- 1.0ミリメートルラウンドドリルいが、1.0ミリメートル倒立円錐ドリルいが（Roboz手術器具株式会社、ゲーサーズバーグ、メリーランド州、米国）
- 外科用品
- 2.4 mmのシャフトの長さと取り付けネジ0から80×3/32、21ゲージのガイドカニューレ[長い台座下4ミリメートル]とカニューレダミー（プラスチック1、ロアノークVA、USA）
- ジェット義歯アクリルと液体（ラング歯科製造株式会社、ホイーリング、イリノイ州、アメリカ）
- 3.0ナイロン縫合糸（オアシス、メタワ、イリノイ、米国）
- 綿棒、Puralube眼軟膏（フィッシャー·サイエンティフィック、ピッツバーグ、PA、USA）
- 電気バリカン（オスター、プロビデンス、ロードアイランド州、米国）
- 化学品
- エンドセリン-1（アメリカンペプチド、サニーベール、カリフォルニア州、米国）
- クロルヘキシジン2％（Agrilabs、セントジョセフ、ミズーリ州、米国）
- ブプレノルフィン塩酸（ホスピーラ社、レイクフォレスト、イリノイ州、アメリカ）
- 可視化装置
- 手術用顕微鏡（ザイラー音源と製造、セントルイス、ミズーリ州、米国）
- 光ファイバ照明装置（TechniQuip社、リヴァーモア、カリフォルニア州、米国）
- レーザードップラー血流計システム（ADInstruments社、コロラドスプリングズ、コロラド州、米国）
- セントandardペンシルプローブ
- プローブホルダ
- 血流計
- LabChart 7とPowerLabの4月30日
- 梗塞体積の測定
- ラット脳マトリックス（Zivic·ミラーラボ社、アリソンPark、ペンシルバニア、米国）
- 2,3,5 - トリフェニルテトラゾリウムクロライド（シグマアルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州、米国）は、PBSに0.05％に希釈
- フラットベッドスキャナ（エプソンパーフェクV30、エプソン·アメリカ社は、ロングビーチ、CA、USA）を
- 画像Jソフトウェア（ImageJの1.42qソフトウェア、米国国立衛生研究所、ベセスダ、MA、USA）
1。手術前のステップ
- 手術に先立ち、ラットを水とげっ歯類への無料アクセスを12：12明/暗サイクルで飼育されています。
- 麻酔は後部足のピンチに引き出しもはやラットまで誘導室では100％O 2ガスの混合物の4％イソフルランで誘導される。
- A浄化槽技術は滅菌手袋、滅菌手術器具、滅菌外科用ドレープ11の使用を含めて、この手順の間に維持されるべきである。
- 頭頂部は電動バリカンで剃毛されています。
- ラットは、温度制御された操作面（サーマルブランケット）の上に横たわって吸収パッド上で発生しやすい位置に配置されます。
- ヘッドはガス麻酔フェイスマスクの配置で始まる定位装置に配置されます。
- 次に、耳の棒を挿入して締められている。
- プロシージャ麻酔中に100％O 2ガス混合物中のイソフルラン2％で維持されます。
- 潤滑剤の眼軟膏は、両眼に適用され、まぶたが外科手術中に目の乾燥を防ぐために閉鎖されています。
- プローブは、37の定数動物のコア温度を維持するために挿入され直腸温度±0.5℃
- 定位にしっかりと保持ヘッド付きデバイスは、外科領域には2％クロルヘキシジンと生理食塩水3回を交互に清めです。
2。手術の手順
- メスを使用して、正中切開は耳（上項線）の間に、目の最も尾側の側面（[後]）から頭蓋を覆う皮膚の上に作られています。
- 皮膚を3ブルドッグクランプで横方向に後退させられる。
- 結合組織は、複数の構造がはっきりと見ることができるように、乾いた綿棒を使って頭蓋骨から削除されます。これらはブレグマ、冠状縫合、右横頭蓋骨の尾根があります。綿棒は、術野から血液を除去するために使用されています。
- 手術用顕微鏡を使用して、ブレグマが配置されており、1.0ミリメートルラウンドドリルいががブレグマでゼロにされるまで定位マニピュレータが調整されます。
- ドリルいが、その後1.6ミリメートル前部とブレグマ横5.2ミリメートルに移動されます。
- 頭蓋骨を貫通いが穴が穿設されているためキャンULA配置します（ 図1）。過剰破片や血液が絶えず綿棒を使用してクリアされます。
この時点で、ガイドカニューレを挿入することができます（ステップ7）またはいが孔を介して直接、ET-1の注射は（ステップ16に直接進んでください）を行うことができる。
- 3取り付けネジの隣の、いが穴が1.0ミリメートル倒立円錐ドリルいが（ 図1）を用いて 、頭蓋骨の部分的な厚さを貫通穿設されている。一つ穴が冠状縫合、矢状縫合に横1〜2ミリメートルの前方1〜2ミリメートル程度それぞれ前頭骨に掘削されています。一つ穴が冠状縫合の後方2〜3ミリメートルとガイドカニューレいが穴と同側の矢状縫合に横2〜3ミリメートル程度頭頂骨に掘削されています。三0から80×3/32取り付けねじはこれらいが穴に配置され、カニューレ内に保持セメントのサポートを提供します。ネジのみよう硬膜を損傷しないように2つまたは3つのターンを進めなければならない。 ガイドカニューレが配置されている定位カニューレホルダーとブレグマに配置されます。
- ガイドカニューレをブレグマでゼロにされるまで定位マニピュレータが調整されます。カニューレは、1.6ミリメートル前部とブレグマ横5.2ミリメートルの場所に位置しいが穴に移動されます。
- 最後に、ガイドカニューレをブレグマ腹4.5ミリメートルの最終先端位置とのいが穴に下げられる。
- レーザードップラーフロープローブ配置（オプション）
- LDFを用いた脳血流を監視するために、プローブホルダは、歯科用セメント、ガイドカニューレを固定する前に所定の位置に配置することができます。
- プローブホルダベースは小さな楔形のタブを除いて台座と同一平面にトリミングされています。
- プローブホルダは、その後、ガイドカニューレの後方と内側指向タブ（ 図1）を使用して横方向の頭蓋骨の尾根にちょうど内側に配置されます。
- プローブホルダとg用ガイドカニューレは歯科用セメントを用いて一緒に貼付されています。
- 歯科用セメントは、その後、所定の位置にカニューレを固定するために使用されています。セメントはすべての3つのネジで接触しており、カニューレの全塩基を取り囲んでいる。
- セメントは前カニューレホルダーの除去に完全に乾燥させてください。これは、約5分かかります。
これらのステップの後、外科的切開を閉じることができ、カニューレダミーは、ガイドカニューレにねじ込むこともできます。代わりに、ET-1誘発MCAOは、カニューレ移植手術からの回復期間の後ラットで行うことができます。この方法の場合は、ステップ19は次に実行されるべきであり、ステップ14から18は、後で実行することができます。ガイドカニューレの注入を実行し、同じ手術中のET-1を注入するには、ステップ14を次の実行する必要があります。
- 点滴注射は、ET-1（PBS中80μMのに希釈）でロードした後定位インジェクターに装着されています。
- ザ針の先端がガイドカニューレの縁にゼロにされるまで定位マニピュレータが調整されます。
- 針の先端がガイドカニューレのリムに腹17.2ミリメートルの位置にガイドカニューレを介して下降する。ガイドカニューレを使用しない場合は、針の先端はブレグマでゼロ調整とブレグマ腹位置8.7ミリメートルにいが孔を通して下降させる。
- 80μMのET13μlの分あたり1μlの速度で注入されています。
- 注入が完了し、その後徐々に除去された後に注射器を3分間そのままにしています。
- 切開は3.0ナイロン縫合糸で閉じており、カニューレダミーカニューレにねじ込まれている。
- 適切な鎮痛剤の用量（0.05 mg / kgですなわちブプレノルフィン）は回復期間中に痛みや不快感を最小限に抑えるために手術後に使用する必要があります。
- ラットは手術室から取り除かれ、柔らかい食物および水を自由に、簡単にアクセスして、低体温症を防ぐために暖かく、乾燥したリカバリ領域に配置されます。
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Representative Results
1。術後神経学的評価
動物が意識を取り戻した後、テストの多種多様なバランス、握力、足置き、姿勢の非対称性と登山階段を含む神経障害を評価するために使用することができます。ヒマワリ種子タスクは、モータと梗塞容積7、12と有意な相関を持っている感覚機能の総評価である。開いて5ヒマワリの種を消費しながら、このタスクでは、ラットは時間が計測されます。 5種子は空の、乾燥した、プラスチック製のケージの片隅に置かれ、種子を操作過ごした時間が記録される。また、すべての種子が開かれ、消費された後にケージ内殻片の数が記録されます。大きい神経障害ラットでは、種子を開き、消費に時間がかかるようになり、より個に殻を破るでしょう。このタスクの正式な一部ではありませんが、それはヒマワリの種の誤った取り扱いや落下頻繁に観察することが容易である実験的脳梗塞後のラットによるS。これは主に、1前足の使用を含んでおり、開こうとすると時のシェルのかむ効果がない。
2。染色および脳梗塞体積の定量的測定
一過性脳虚血を確立するために、MCAの閉塞再灌流後、動物を安楽死であり、その区分された歯冠の脳は私たちの前の出版物で説明したように、梗塞体積（ 図2）を評価するために2,3,5 -トリフェニルテトラゾリウムクロライド（TTC）で染色される7、13。
図1。ハードウェアの配置を描いたラットの頭蓋骨の背面図は左前方に指向したラットの頭蓋骨のこの背ビューは結合をクリアした後に可視化することができる縫合に関してブレグマとラムダの位置を示しています頭蓋骨表面から組織。横頭蓋骨尾根、ガイドカニューレ、LDFプローブホルダ、およびアンカーネジはまた頭蓋骨土地マーク、互いに相対的に関係を持つの図に示されている。
図2。ラットのTTC染色されたシリアル冠状脳切片（2 mm）は、ET-1誘発MCAOに供した ET-1誘発MCAO後のラット脳からの代表が示されている。この脳は、嗅球にちょうど尾出発厚さ2mmのセクションで冠状切片にされる前に、氷冷PBSで除去し、洗浄した。スライスはその後TTCが°Cの前にPBS中で急冷し、次いでホルマリンで簡単に固定されているように、37℃でPBSで希釈した0.05パーセントでインキュベートした。 TTCへの暴露後の組織染色した赤は、実行可能な灰白質を表しています。 ET-1の注射と同側半球での生存能力のある灰白質は灰色メートルと比較することができます脳梗塞の面積を計算する対側半球のatter。
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Discussion
ET-1誘発MCAOは、定期的に複数のラット系統で使用されている実験的虚血性脳卒中の確立されたモデルです。このモデル5、14を使用するときにこのようなラット系統、動物の年齢、体温、麻酔方法、およびオペレータの専門知識など、多くの変数が、梗塞体積の増加変動につながることができます。しかし、いくつかの研究者は、このモデルの利点は、比較的非侵襲的なアプローチは、ET-1に脳血流の用量反応、および意識のあるラット14、15のET-1の注入によって完全に麻酔を回避する能力を含んでいることが示されている。それは、文学を通して使用ラット系統および年齢で多くの違いがあることは注目すべきであり、それは別の定位座標は、これらの変数に応じて報告されていることは驚くべきことではない。我々のプロトコルで使用される座標は、8週齢の雄性Sprague Dawleyラットに最適化されています。この株、性別、年齢から逸脱する可能性が脳内に注入が必要になります色素のイオンは、この手順の有効座標を識別するために剖検を行った。また、脳血流のET-1誘発減少が用量に依存しています。この方法では、用量の使用は実験7、16内の約4-5％の平均値の標準誤差の注射と同側半球の灰白質の約30〜40％の梗塞を引き起こします。 MCAの近位部分の直接可視化には 約30分7でのベースラインから3分以内にベースラインとリターンの0％になる血管径を明らかにする。 LDFを用いて、最大流量は16を中止したモニタリング1時間後にベースラインの60％に徐々に復帰して5から7分で、ベースラインの流量の約10％に減少することが示された。
言及を保証する他の特定の技術的な詳細は以下のとおりです。
- 正しくブレグマ（微視的な指導の下）で定位機器を設置し、ゼロにすることは非常に重要ですinducingの成功したストローク。 ET-1の注入のための定位座標は、実験開始までに具体的な実験設備及びラット系統のために検証する必要があります。これは、注入がMCA 6の0.5mm以内でない場合は、何も病変が発生しないと思われます。
- ガイドカニューレの初期いが穴をあけるときは、脳への損傷を引き起こすことがないように注意してください。それは遅い掘削速度が脳に浸透する可能性を最小にするように終わりに向かってとげの穴と再びを開始するために使用することをお勧めします。
- 取り付けネジのバール穴をあけるときは、部分的にしか頭蓋骨を貫通バール穴を作成するために逆円錐ドリルバールを使用しています。だけで十分な深さのネジが安定しているようにドリルダウンします。
- 代わりにカニューレを固めるときには皮膚だけでなく、定位固定アームのセメントははっきりさせておくようにしてください。セメントは、綿棒を使って乾燥する前に操作することができます。
- セメントが完全にDRであることを確認してくださいyおよびカニューレは、カニューレホルダーを除去する前に安定しています。それは、カニューレがET-1注入する前に移動しないことが重要です。
- 我々の経験では、ET-1のストロークモデルは、外科手術により約20％の死亡率を持っています。それは十分なサンプルサイズは、神経学的および組織学的エンドポイント用に使用されるように治療群とも計画の実験の間に死亡率を比較することが重要である。
- 急性期脳梗塞治療のための前臨床試験のためのガイドラインは、実験17の間のばらつきを低減するために血圧、体温、血糖、血液ガスの脳血流量の監視と生理学的モニタリングをお勧めします。 LDFは達成されている流れの減少のために所定のしきい値を確認するために、様々な解剖学的領域の血流をリアルタイムで監視するために使用することができる方法です。
- 注射の間にエタノールと食塩水を注入注射器と針をきれいにしておいてください、と前にエタノールストレージ。この手順では、操作中のET-1without気泡や閉塞の一貫撤退と注射を与える。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、アメリカ心臓協会グレーター東南アジアアフィリエイト（09GRNT2060421）、米国医師会からとフロリダ臨床およびトランスレーショナル科学研究所の大学からの補助金によって支えられている。アダムメッカは、NIH / NINDS、NRSA博士号を取得する前の仲間（F30 NS-060335）です。ロバートRegenhardtは高血圧でフロリダ大学学際的なトレーニング·プログラム（T32 HL-083810）から博士号を取得する前のフェローシップの支援を受けた。
Materials
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