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Endotelina-1 Induzida Médio modelo de oclusão da artéria cerebral para AVC isquêmico com Laser Orientação Fluxometria Doppler em ratos

Published: February 16, 2013 doi: 10.3791/50014
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 4, 4, 1, 3
1Department of Neurosurgery, University of Florida, 2Department of Anatomical Sciences, Shiraz University of Medical Sciences, Shiraz, Iran, 3Department of Physiology and Functional Genomics, University of Florida, 4Department of Neurology, University of Florida

Summary

Vários modelos animais de isquemia cerebral foi desenvolvido para simular a condição humana de acidente vascular cerebral. Este protocolo descreve a endotelina-1 (ET-1) induzida por oclusão da artéria cerebral média do modelo (MCAO) para acidente vascular cerebral isquêmico em ratos. Além disso, considerações importantes, vantagens e inconvenientes deste modelo são discutidos.

Abstract

AVC é a causa número um de deficiência e terceira principal causa de morte no mundo, com um custo estimado de US $ 70 bilhões em Estados Unidos, em 2009 1, 2. Vários modelos de isquemia cerebral têm sido desenvolvidos para mimetizar a condição humana de acidente vascular cerebral. Tem sido sugerido que até 80% de todo o resultado de danos isquémicos pancadas na artéria cerebral média (MCA) de área de 3. No início dos anos 1990, a endotelina-1 (ET-1) 4 foi utilizado para induzir isquemia, aplicando-a directamente adjacente à superfície da MCA após craniotomia. Mais tarde, este modelo foi modificado 5 utilizando uma injecção estereotáxica de ET-1 ao lado da MCA para produzir isquemia cerebral focal. As principais vantagens deste modelo incluem a capacidade de realizar o procedimento de forma rápida, a capacidade para controlar a constrição da artéria através da alteração da dose de ET-1 emitido, não há necessidade de manipular os vasos extracranianos que fornecem sangue ao cérebro, bem como reperfusi gradualem taxas que mais de perto imita a reperfusão em humanos 5-7. Por outro lado, o modelo ET-1 tem desvantagens que incluem a necessidade de uma craniotomia, bem como maior variabilidade no volume de curso 8. Esta variabilidade pode ser reduzida com a utilização de dopplerfluxometria a laser (LDF) para verificar se a isquemia cerebral durante a infusão de ET-1. Fatores que afetam a variabilidade AVC incluem precisão de infusão e lote do ET-1 utilizado 6. Outra consideração importante é que, apesar de reperfusão é uma ocorrência comum em acidente vascular cerebral humano, a duração da oclusão por ET-1 induzida por MCAO pode não imitam de perto a do acidente vascular cerebral humano onde muitos pacientes têm reperfusão parcial ao longo de um período de horas a dias após a oclusão 9, 10. Este protocolo irá descrever em detalhes a ET-1 induzida modelo OACM para AVC isquêmico em ratos. Será também chamar a atenção para as considerações especiais e inconvenientes potenciais durante todo o procedimento.

Protocol

Este protocolo foi aprovado pelo Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC) da Universidade da Flórida e está em conformidade com o "Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório" (oitava edição, a National Academy of Sciences, 2011).

Materiais

  1. Animais: Oito semanas de idade, macho, Sprague Dawley (Farms Charles River, Wilmington, MA, EUA) pesando 250-300 g no momento da cirurgia.
  2. Anestesia
    1. Sistema de anestesia por inalação (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, EUA)
    2. Anestésico isoflurano (Baxter Farmacêutica, em Deerfield, Illinois, EUA)
  3. Estereotáxico sistema (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, EUA)
    1. Sistema estereotáxico de pequenos animais
    2. Não-ruptura de ouvido barras para ratos
    3. Gás titular cabeça anestesia para ratos
  4. Regulação da temperatura
    1. BAT-12 termômetro microssonda (Precision Mundial Instruments, Inc., Sarasota, Flórida, EUA)
    2. T / BOMBA, TP600 manta térmica (Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, EUA)
  5. Instrumentos cirúrgicos
    1. Cabo de bisturi e lâmina n º 11, íris fórceps, fórceps Graefe, afastadores braçadeira bulldog, chave de fenda, 10 seringas ul com agulha de calibre 26 chanfrado (Instrumentos de Precisão World, Inc., Sarasota, Flórida, EUA)
    2. Micromotor e broca titular estereotáxica, Quintessential Estereotáxica Injector (Stoelting, Wood Dale, IL, EUA)
    3. 1,0 milímetros broca de perfuração redonda, 1,0 mm cone invertido de perfuração da broca (Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, EUA)
  6. Material cirúrgico
    1. Parafusos de montagem 0-80 X 3/32 com 2,4 comprimento do eixo mm, 21 de calibre da cânula guia [4 milímetros longa abaixo do pedestal] e manequim cânula (Plásticos, uma Roanoke, VA, EUA)
    2. Jet acrílico dentadura e líquido (Lang Dental Manufacturing Co., Inc., Wheeling, IL, EUA)
    3. 3,0 nylon sutura (Oasis, Mettawa, IL, EUA)
    4. Cotonetes, pomada Puralube (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, EUA)
    5. Elétrica de cortar cabelo (Oster, Providence, RI, EUA)
  7. Produtos químicos
    1. A endotelina-1 (American Peptide, Sunnyvale, CA, EUA)
    2. Clorexidina 2% (Agrilabs, St. Joseph, MO, EUA)
    3. Buprenorfina HCl (Hospira Inc., Lake Forest, Illinois, EUA)
  8. Equipamento de visualização
    1. Microscópio cirúrgico (Seiler Instrumento e Manufatura; St. Louis, MO, EUA)
    2. Iluminador de fibra óptica (TechniQuip Corp, Livermore, CA, EUA)
  9. Laser Doppler fluxometria sistema (ADInstruments, Inc., Colorado Springs, CO, EUA)
    1. StSonda Lápis andard
    2. Suporte da sonda
    3. Fluxômetro sangue
    4. Powerlab 4/30 com 7 LabChart
  10. Medição do volume de enfarte
    1. De cérebro de rato matriz (Zivic-Miller Lab., Inc., Allison Park, PA, EUA)
    2. 2,3,5-cloreto de trifeniltetrazólio (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, EUA), diluída a 0,05% em PBS
    3. Scanner de mesa (Epson Perfection V30, Epson America, Inc., Long Beach, CA, EUA)
    4. Image J software (ImageJ 1.42q software, EUA National Institutes of Health, Bethesda, MA, EUA)

1. Pré-cirúrgicos Passos

  1. Antes da cirurgia, os ratos são alojados sob um ciclo de luz / escuridão 12:12, com livre acesso à água e à ração de roedores.
  2. A anestesia é induzida com 4% de isoflurano em 100% de mistura de gás O2, em uma câmara de indução até que o rato já não retiradas para aperto da pata traseira.
  3. Atécnica séptico deve ser mantida durante este processo, incluindo a utilização de luvas estéreis, instrumentos cirúrgicos estéreis, e uma cortina cirúrgica estéril 11.
  4. A coroa da cabeça é raspada com cortar cabelo elétrica.
  5. O rato é colocado na posição de decúbito ventral com uma almofada absorvente que encontra-se sobre uma superfície de funcionamento com temperatura controlada (manta térmica).
  6. A cabeça é colocada no aparelho estereotáxico de partida com a colocação da máscara de gás anestésico.
  7. Em seguida, as barras de orelha são inseridos e apertados.
  8. Durante o procedimento de anestesia é mantida com isoflurano a 2% em 100% de mistura de gás de O 2.
  9. Unguento oftálmico lubrificante é aplicado a ambos os olhos, e as pálpebras estão fechadas para evitar a dessecação do olho durante o procedimento cirúrgico.
  10. Uma sonda de temperatura rectal é inserido para manter uma temperatura constante de animais núcleo de 37 ± 0,5 ° C.
  11. Com a cabeça firmemente mantido no estereotáxicodispositivo, a área cirúrgica é lavada com alternância de clorexidina a 2% e solução salina, três vezes.

2. Passos cirúrgicos

  1. Utilizando um bisturi, de uma incisão na linha média é feita sobre a pele que recobre o calvarium dos aspectos mais caudais dos olhos (násio) para entre as orelhas (linha nucal superior).
  2. A pele é então retraída lateralmente com 3 pinças bulldog.
  3. O tecido conectivo é removida do crânio com cotonetes de algodão seco, de modo que as estruturas múltiplas pode ser vista claramente. Estes incluem bregma, a sutura coronária, e a crista do crânio lateral direito. Cotonetes de algodão são usadas para remover o sangue do campo cirúrgico.
  4. Usando o microscópio cirúrgico, bregma está localizado, e os manipuladores estereotáxicas são ajustados até que a broca broca 1,0 milímetros rodada é zerada em bregma.
  5. A broca de perfuração é, então, movido para 1,6 mm anterior e 5,2 mm lateral à bregma.
  6. Um buraco broca que penetra no crânio é perfurado para cannula colocação (Figura 1). Excesso de detritos e sangue são continuamente eliminados com cotonetes.

Neste ponto, uma cânula de guia pode ser inserida (passo 7) ou uma injecção de ET-1 directo através do orifício de broca pode ser realizada (avançar directamente para o passo 16).

  1. Em seguida, os furos de broca de 3 parafusos de fixação são perfurados através de espessura parcial do crânio utilizando um cone invertido 1,0 milímetros de perfuração da broca (Figura 1). Um buraco é perfurado em cada osso frontal de cerca de 1-2 mm anterior ao da sutura coronária com 1-2 mm lateral à sutura sagital. Um buraco é perfurado no osso parietal de cerca de 2-3 mm posterior à sutura coronal e 2-3 mm lateral da sutura sagital ipsilateral ao orifício guia da broca cânula. Três 0-80 x 3/32 parafusos são colocados nestes buracos broca e fornecerá suporte para o cimento que na cânula. Os parafusos devem apenas ser avançado 2 ou 3 voltas de modo a não danificar a dura-máter. A cânula guia é colocada no suporte da cânula estereotáxico e bregma está localizado.
  2. Os manipuladores estereotáxicas são ajustados até que a cânula guia foi zerada em bregma. A cânula é movida para o furo de broca localizado 1,6 milímetros anterior e 5,2 mm lateral à bregma.
  3. Finalmente, a cânula guia foi baixada para dentro do furo de broca com a posição de ponta final de 4,5 mm ventral a bregma.
  4. Laser Doppler colocação da sonda de fluxo (opcional)
    1. A fim de controlar o fluxo de sangue cerebral utilizando LDF, um suporte da sonda pode ser colocada em posição antes da fixação da cânula guia com cimento dental.
    2. A base de suporte da sonda é aparado rente ao pedestal com exceção de guia em forma de cunha pequena.
    3. O suporte da sonda é então colocada posterior à cânula guia e apenas medial ao rebordo lateral do crânio com a guia orientado medialmente (Figura 1).
    4. O titular da sonda e guide cânula estão afixadas em conjunto com cimento dental.
  5. Cimento dentário é então utilizado para fixar a cânula no lugar. O cimento está em contacto com os três parafusos e rodeia toda a base da cânula.
  6. O cimento deve ser completamente seca antes da remoção do suporte da cânula. Isto demora cerca de 5 min.

Depois destes passos, a incisão cirúrgica pode ser fechada e que o boneco cânula pode ser aparafusado na cânula guia. Alternativamente, a ET-1 induzida por MCAO pode ser realizada no rato, após um período de recuperação a partir da cirurgia de implante da cânula. Por este método, o passo 19 deve ser realizada em seguida e os passos 14-18 pode ser realizada em um momento posterior. Para realizar o implante da cânula guia e ET-1 a injecção durante a mesma cirurgia, passo 14 deve ser realizada em seguida.

  1. A seringa de infusão é carregado com ET-1 (diluído a 80 uM em PBS) e, em seguida, montado no injector estereotáxica.
  2. Omanipuladores estereotáxicas são ajustados até que a ponta da agulha é colocado em zero na borda da cânula guia.
  3. A ponta da agulha é abaixada através da cânula guia para uma posição de 17,2 milímetros ventral para o aro da cânula guia. Se uma cânula guia não é utilizada, a ponta da agulha é colocado a zero no bregma e abaixada através do orifício de broca de um milímetro posição ventral 8,7 a bregma.
  4. 3 ul de 80 mM ET1 é infundida a uma taxa de 1 ml por min.
  5. A seringa é deixada no lugar durante 3 minutos após a conclusão da perfusão e então lentamente removido.
  6. A incisão é fechada com sutura de nylon 3,0 e o manequim cânula é aparafusado na cânula.
  7. Uma dose de analgésico apropriado (isto é, a buprenorfina a 0,05-0,1 mg / kg) deve ser utilizado após a cirurgia, para minimizar a dor e desconforto durante o período de recuperação.
  8. O rato é removido do conjunto cirúrgico e colocadas numa área de recuperação quente, seco para evitar a hipotermia, com acesso livre, fácil de alimentos moles e água.

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Representative Results

1. Pós-Op avaliação neurológica

Depois de o animal recupera a consciência, uma grande variedade de ensaios pode ser utilizada para avaliar défices neurológicos incluindo o equilíbrio, a força de preensão, colocação da pata, assimetria postural e escada de escalada. A tarefa de semente de girassol é uma avaliação grosseira da função motora e sensorial que tem correlação significativa com infarto volume 7, 12. Durante essa tarefa, os ratos são cronometrados ao abrir e consumir 5 sementes de girassol. Os cinco sementes são colocadas num canto de um vazio, gaiola, seca plástico e o tempo gasto manipulando as sementes é registada. Além disso, o número de pedaços de casca na gaiola após todas as sementes foram abertas e consumida é gravado. Ratos com maior déficit neurológico terá mais tempo para abrir e consumir as sementes e vai quebrar as conchas em mais peças. Embora não faça parte formal desta tarefa, é fácil observar mau uso freqüente e soltando da semente de girassols por ratos após acidente vascular cerebral experimental. Isto inclui o uso de uma pata dianteira principalmente, ineficaz e morder do reservatório quando tentativas de abrir.

2. A coloração e a medição quantitativa do volume do enfarte cerebral

Após a oclusão e reperfusão da MCA para estabelecer a isquémia cerebral transitória, os animais são sacrificados e os seus cérebros são seccionadas coronalmente coradas com 2,3,5-trifeniltetrazólio cloreto (TTC), para avaliar o volume de enfarte (Figura 2), conforme discutido na nossa publicação anterior 7, 13.

Figura 1
Figura 1. Vista dorsal do crânio de ratos que descreve a colocação de hardware. Esta vista dorsal do crânio de ratos com orientação anterior à esquerda mostra a localização do bregma e lambda com respeito às suturas que podem ser visualizadas depois de limpar conjuntivotecido da superfície do crânio. O cume lateral do crânio, guia cânula, LDF suporte da sonda, e os parafusos de fixação também são mostrados no diagrama com relacionamentos relativos a marcas crânio de terra e uns dos outros.

Figura 2
Figura 2. TTC-coradas secções em série cerebrais coronais (2 mm) a partir de ratos submetidos a ET-1 induzida por MCAO. Um representante de um cérebro de rato após ET-1 induzida por MCAO é mostrado. Este cérebro foi removido e lavado em PBS arrefecido em gelo antes de ser seccionados coronalmente em 2 mm de espessura a partir apenas caudal para os bolbos olfactivos. As fatias foram então incubadas em 0,05% de TTC diluído em PBS a 37 ° C antes de ser extinta em PBS e em seguida fixadas em formalina brevemente. Tecidos manchados de vermelho após a exposição ao TTC representa a matéria cinzenta viável. A matéria cinzenta viável no hemisfério ipsilateral à injecção de ET-1 pode ser comparado com o m cinzaAtter do hemisfério contralateral para calcular a área do enfarte cerebral.

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Discussion

A ET-1 induzida OACM é um modelo estabelecido de acidente vascular cerebral isquêmico experimental que é regularmente utilizado em várias linhagens de ratos. Muitas variáveis, tais como a estirpe de ratos, a idade do animal, temperatura corporal, método de anestesia, e experiência do operador pode levar a aumento da variabilidade nos volumes de infarto ao usar este modelo de 5, 14. No entanto, vários investigadores têm mostrado que as vantagens deste modelo incluem a abordagem relativamente não invasiva, de dose-resposta do fluxo de sangue cerebral para a ET-1, e a capacidade de evitar por completo a anestesia por infusão de ET-1 em ratos conscientes, 14, 15. É de notar que há muitas diferenças em idade estirpe de rato e utilizado em toda a literatura, e não é de surpreender que diferentes coordenadas estereotáxicas são relatados de acordo com estas variáveis. As coordenadas utilizado no nosso protocolo são optimizados para 8 semanas de idade, ratos machos Sprague Dawley. Qualquer desvio desta estirpe, sexo ou idade provavelmente vai exigir intracerebral injetaríons de corante seguido de necropsia para identificar as coordenadas válidos para este procedimento. Além disso, a redução induzida por ET-1 no fluxo de sangue cerebral é dependente da dose. O uso da dose neste método provoca um enfarte de aproximadamente 30-40% da matéria cinzenta do hemisfério ipsilateral à injecção com um erro padrão da média de cerca de 4-5% no prazo de um experimento 7, 16. Visualização directa de porções proximais do MCA revela um diâmetro luminal que vai para 0% da linha de base dentro de 3 min e retorna à linha de base em cerca de 30 min 7. Usando LDF, o fluxo máximo foi demonstrado diminuir para cerca de 10% do fluxo basal em 5-7 minutos, com retorno gradual para 60% da linha de base após 1 h de monitorização que foi interrompido 16.

Outros detalhes técnicos específicos que a menção mandado estão listados abaixo:

  1. Corretamente localizar e zerar o equipamento estereotáxico no bregma (sob a orientação microscópica) é crucial para inducium golpe ng sucesso. As coordenadas estereotáxicas para a infusão de ET-1 deve ser verificada para o equipamento específico e estirpe experimental de rato antes da experimentação. É provável que qualquer lesão vai ocorrer se a infusão não está dentro de 0,5 mm da MCA 6.
  2. Tome cuidado para não causar danos ao cérebro quando a perfuração do buraco broca inicial para a cânula guia. Recomenda-se que a velocidade de perfuração lenta ser utilizado para iniciar o furo da broca e de novo para a extremidade, de modo a minimizar a possibilidade de penetrar no cérebro.
  3. Ao fazer furos broca para os parafusos de montagem, utilize a broca de perfuração cone invertido para criar um furo de broca, que só em parte penetra no crânio. Apenas perfurar fundo o suficiente para que os parafusos são estáveis.
  4. Ao cimentar a cânula no lugar não deixe de manter o cimento claro da pele, bem como o braço estereotáxico. O cimento pode ser manipulado antes da secagem com um cotonete.
  5. Certifique-se de que o cimento é completamente dry e a cânula é estável antes da remoção do suporte da cânula. É crítico que não mover a cânula antes da injecção de ET-1.
  6. Na nossa experiência, no modelo ET-1 tem um acidente vascular cerebral taxa de mortalidade de aproximadamente 20%, devido ao procedimento cirúrgico. É importante para comparar as taxas de mortalidade entre os grupos de tratamento, e também as experiências do plano de modo que os tamanhos das amostras suficientes são utilizados para terminais neurológicos e histológica.
  7. Diretrizes para testes pré-clínicos de terapia AVC agudo recomendam o monitoramento do fluxo sangüíneo cerebral e monitorização fisiológica da pressão arterial, temperatura, glicose e gases sanguíneos para reduzir a variabilidade durante as experiências 17. LDF é um método que pode ser utilizado para acompanhamento em tempo real do fluxo sanguíneo em várias regiões anatómicas para verificar um limiar predeterminado para a redução do fluxo foi alcançado.
  8. Certifique-se de limpar a seringa e agulha de infusão com etanol e soro fisiológico entre as injeções, e etanol antesarmazenamento. Este procedimento dará retirada consistente e injeção de bolhas de ET-1without ar ou bloqueios durante a operação.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado por doações do American Heart Association Maior filial Sudeste (09GRNT2060421), a Associação Médica Americana, e da Universidade da Flórida Clínica e Translacional Science Institute. Adam Meca é um NIH / NINDS, companheiro NRSA predoctoral (F30 NS-060335). Robert Regenhardt recebeu apoio comunhão predoctoral da Universidade da Flórida Programa de Formação Multidisciplinar em Hipertensão (T32 HL-083810).

Materials

  1. Animals: Eight-week-old, male, Sprague Dawley rats (Charles River Farms, Wilmington, MA, USA) weighing 250-300 g at the time of surgery.
  2. Anesthesia:
    1. Inhalation anesthesia system (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA)
    2. Isoflurane anesthetic (Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL, USA)
  3. Stereotaxic system (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA):
    1. Small animal stereotaxic system
    2. Non-rupture ear bars for rats
    3. Gas anesthesia head holder for rats
  4. Temperature regulation:
    1. BAT-12 microprobe thermometer (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA)
    2. T/PUMP, TP600 Thermal blanket (Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA)
  5. Surgical instruments
    1. Scalpel handle and #11 blade, iris forceps, Graefe forceps, bulldog clamp retractors, screwdriver, 10 μl syringe with 26 gauge beveled needle (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA)
    2. Micromotor drill and stereotaxic holder, Quintessential Stereotaxic Injector (St–lting, Wood Dale, IL, USA)
    3. 1.0 mm round drill bur, 1.0 mm inverted cone drill bur (Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA)
  6. Surgical Supplies
    1. Mounting screws 0-80 X 3/32 with 2.4 mm shaft length, 21-gauge guide cannula [4mm long below the pedestal] and cannula dummy (Plastics one, Roanoke, VA, USA)
    2. Jet denture acrylic and liquid (Lang Dental Manufacturing Co., Inc., Wheeling, IL, USA)
    3. 3.0 nylon suture (Oasis, Mettawa, IL, USA)
    4. Cotton swabs, Puralube eye ointment (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA)
    5. Electric hair clippers (Oster, Providence, RI, USA)
  7. Chemicals:
    1. Endothelin-1 (American Peptide, Sunnyvale, CA, USA)
    2. Chlorhexidine 2% (Agrilabs, St. Joseph, MO, USA)
    3. Buprenorphine HCl (Hospira Inc., Lake Forest, IL, USA)
  8. Visualization Equipment
    1. Surgical microscope (Seiler Instrument and Manufacturing; St. Louis, MO, USA)
    2. Fiber Optic illuminator (TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA)
  9. Laser Doppler flowmetry system (ADInstruments, Inc., Colorado Springs, CO, USA)
    1. Standard Pencil Probe
    2. Probe holder
    3. Blood FlowMeter
    4. Powerlab 4/30 with LabChart 7
  10. Measurement of infarct volume:
    1. Rat brain matrix (Zivic-Miller Lab., Inc., Allison Park, PA, USA)
    2. 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) diluted to 0.05% in PBS
    3. Flatbed scanner (Epson Perfection V30, Epson America, Inc., Long Beach, CA, USA)
    4. Image J software (ImageJ 1.42q software, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Ansari, S., Azari, H., Caldwell, K.… More

Ansari, S., Azari, H., Caldwell, K. J., Regenhardt, R. W., Hedna, V. S., Waters, M. F., Hoh, B. L., Mecca, A. P. Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Rat. J. Vis. Exp. (72), e50014, doi:10.3791/50014 (2013).

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