Summary
Dit artikel beschrijft een werkwijze voor het visualiseren van rat cerebrale slagaders door een craniaal venster met tijdelijke craniectomie om proximale delen van de middelste cerebrale slagader weergeven (
Abstract
Creëren van een craniale venster is een methode die directe visualisatie van structuren kan op de corticale oppervlakte van de hersenen 1-3. Deze techniek kan worden uitgevoerd op vele plaatsen bovenop de rat hersenen, maar wordt het gemakkelijk uitgevoerd door een craniectomie de gemakkelijk toegankelijke frontale of pariëtale botten. Meestal hebben we deze techniek in combinatie met het endotheline-1 midden cerebrale slagader occlusie model van herseninfarcten de veranderingen in midden cerebrale slagader vaatdiameter dat met injectie van endotheline-1 optreden in het hersenparenchym naast de proximale MCA kwantificeren 4, 5. Om het proximale deel van de MCA in endotheline geïnduceerde -1 mCaO visualiseren gebruiken we een techniek om een craniaal venster creëren door het slaapbeen het laterale aspect van de rat schedel (figuur 1). Cerebrale slagaders kan worden gevisualiseerd, hetzij met de dura intact of met de dura ingesneden en RETRActed. Meestal laten we de dura intact tijdens visualisatie sinds endotheline-1 geïnduceerde mCaO omvat de levering van de vaatvernauwende peptide in de hersenen parenchym. Dit omzeilt de noodzaak om direct insnijden de dura over de gevisualiseerde schepen voor drug delivery. Dit protocol wordt beschreven hoe u een craniale venster om cerebrale slagaders te visualiseren in een stapsgewijze manier, en hoe veel van de mogelijke valkuilen met betrekking tot deze methode te vermijden creëren.
Protocol
Dit protocol werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Universiteit van Florida en is in overeenstemming met de "Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren" (achtste editie, National Academy of Sciences, 2011).
Materieel
- Dieren: Acht weken oude, mannelijke Sprague Dawley ratten (Charles River Farms, Wilmington, MA, USA) met een gewicht van 250-300 g op het tijdstip van de operatie.
- Anesthesie
- Inhalatie-anesthesie systeem (VetEquip Inc, Pleasanton, CA, USA)
- Isofluraan anesthesie (Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL, USA)
- Stereotaxische systeem (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA)
- Klein dier stereotaxische systeem
- Niet-breuk oor bars voor ratten
- Gas anesthesie hoofd houder voor ratten
- Temperatuurregeling
- BAT-12 microprobe thermometer (WorldPrecision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA)
- T / PUMP, TP600 Thermische deken (Gaymar Industries, Inc, Orchard Park, NY, USA)
- Chirurgische instrumenten
- Metzenbaum schaar, pincet iris, bulldog klem oprolmechanismen, 10 pl spuit met 26 gauge afgeschuinde naald, Bovie cauterisatie kit (World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA)
- Micromotor boor (Stoelting, Wood Dale, IL, USA)
- 0,8 mm ronde boor boor (Roboz Chirurgisch Instrument Co, Inc, Gaithersburg, MD, USA)
- STORZ Bonn Hechten tang (Bausch en Lomb, Inc, Rochester, NY, USA)
- Chirurgische Supplies
- 3,0 nylon hechtdraad (Oasis, Mettawa, IL, USA)
- Wattenstaafjes, Puralube oogzalf (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA)
- Chirurgische punten en strips (Medtronic Xomed, Inc, Jacksonville, FL, USA)
- Elektrische tondeuses (Oster, Providence, RI, USA)
- Endotheline-1 (American Peptide, Sunnyvale, CA, USA)
- Chloorhexidine 2% (Agrilabs, St. Joseph, MO, USA)
- Visualisatie Equipment
- Chirurgische microscoop (Seiler Instrument and Manufacturing, St. Louis, MO, USA)
- Sony Handycam HDR-SR12 (Sony, Minato, Tokyo, Japan)
- Fiber Optic verlichting (TechniQuip Corp, Livermore, CA, USA)
- Meting van vaatdiameter
- VLC media player (Parijs, Frankrijk)
- Afbeelding J-software (ImageJ 1.42q software, US National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA)
1. Pre-operatieve stappen
- Voor de ingreep worden de ratten gehuisvest onder een 12:12 licht / donker-cyclus met vrije toegang tot water en knaagdieren chow.
- Anesthesie wordt geïnduceerd met 4% isofluraan in 100% O2 gasmengsel in een inductiekamer.
- De kraai n van het hoofd wordt geschoren met elektrische tondeuses.
- De rat wordt geplaatst in een liggende positie op een absorberend kussen die op een temperatuurgeregelde contactvlak (thermische deken) en de kop wordt in de stereotactische inrichting beginnen met het plaatsen van het gas verdoving gezichtsmasker.
- Vervolgens worden de balken oor geplaatst en vastgezet.
- Tijdens de procedure anesthesie wordt gehandhaafd met 2% isofluraan in 100% O2 gasmengsel.
- Oftalmische smeermiddel zalf in beide ogen en de oogleden gesloten oog uitdroging te voorkomen tijdens de chirurgische procedure.
- Een rectale temperatuur sonde wordt een constante dier kerntemperatuur van 37 ± 0,5 ° C. handhaven
- Met het hoofd van de verdoofde rat stevig in de stereotaxische inrichting het operatiegebied gereinigd met afwisselend chloorhexidine en zout driemaal.
2. Pre-craniale venster Voorbereiding
NHOUD "> Voor de aanmaak van een craniaal venster moet de rat worden bereid voor experimenten door implantatie van andere benodigde hardware en dienen elke vereiste chirurgische procedures. In dit protocol hebben we eerder geïmplanteerd een geleidingscanule voor endotheline-1 (ET- 1) geïnduceerde mCaO, zoals aangegeven in een metgezel publicatie getiteld "Endotheline-1 geïnduceerde midden cerebrale slagader occlusie Model voor ischemische beroerte met Laser Doppler flowmetrie Begeleiding in Rat."3. Oprichting van de craniale venster
Na plaatsing van een geleidingscanule of materiaal voor experimenten, is een craniaal venster dat direct proximale delen van de middelste cerebrale slagader visualiseren tijdens een slag procedure.
- Eerst worden schaar gebruikt om de huid die de temporalis spier vanaf mediaal en lateraal werkende insnijden.
- De temporalis spier doorsneden met elektrocauterisatie en teruggetrokken met 3,0 nylon hechtdraad tot visua Lize de squameuze deel van het slaapbeen.
- Een ongeveer 3-4 mm vierkant getekend op squameuze gedeelte van het slaapbeen caudaal van de baan en boven de basis van de zygomatic proces als het weerkaatsen van het slaapbeen.
- Een boor wordt gebruikt om geleidelijk snijd de geschetste stukje bot vrij van het slaapbeen. Men dient ervoor te voorkomen dat er teveel druk op de boor, aangezien het mogelijk is om de dura of cerebrale cortex beschadigen.
- Frequent spoelingen met steriele zoutoplossing uitgevoerd om visualisatie van het chirurgische gebied te verbeteren en oververhitting van de schedel voorkomen.
- Vanaf een losse hoek, wordt het stuk temoporal bot voorzichtig verwijderd met behulp van fijne rat-getande tang terwijl ervoor te zorgen dat er geen schepen in verband met de dura scheuren.
- De dura is intact gelaten en vuil wordt weggespoeld met steriele zoutoplossing.
4. Opname van Cerebral Artery Vernauwing
tent "> Om te laten zien hoe u beelden in real-time, een rat die ondergaat ET-1-geïnduceerde mCaO vast te leggen wordt gebruikt voor dit protocol.- Voor het aanbrengen van vasoactieve stoffen dient een uitgangswaarde video opgenomen gedurende tenminste 1 min. Voor ET-1 geïnduceerde mCaO, wordt de basislijn opname nadat de naald is neergelaten in het hersenparenchym maar vóór de ET-1 injectie.
- De spuitpomp gestart voor injectie en opgenomen gedurende 1 uur of totdat het gewenste eindpunt. De naald blijft op zijn plaats tijdens de video-opname om verstoringen van het brandvlak te voorkomen.
- De rat moet diep verdoofd en euthanized worden volgens een goedgekeurde protocol volgen van deze procedure.
5. Beeldanalyse
Vaatdiameter kan worden bepaald voor een deel van de gevisualiseerde MCA. Als voorbeeld zullen we een tak van de MCA te vaatdiameter meten op tijdstippen vóór en na ET-1 injectie. Still frames uit de video worden vastgelegd met 1 min intervallen met behulp van VLC media player (VideoLAN).
- VLC player is geïnstalleerd en geopend.
- Door het selecteren van gereedschappen en dan voorkeuren, wordt de instelling gewijzigd in "All" onder "Toon-instellingen."
- Het "Video" wordt uitgebreid in de linker zijbalk en "output modules" wordt dan uitgebreid. "Scene filters" wordt geselecteerd om het tafereel videofilter menu.
- "Scene" wordt getypt in het veld voor de bestandsnaam voorvoegsel.
- Een directory pad voorvoegsel is gedefinieerd. Dit is waar nog steeds frames worden opgeslagen.
- Een opname verhouding geselecteerd gebaseerd op de gewenste snelheid van nog vast te leggen. Als een video werd gevangen op 29 frames per seconde, dan "1749" (29 beelden / sec x 60 sec / min) moet worden opgenomen in de doos te redden men nog steeds om de 1 min het frame. Alle wijzigingen worden dan opgeslagen.
- De gewenste video wordt dan geopend in VLC player om automatisch nog redden frames eens in de 1 min.
- Vaatdiameter wordt gemeten met behulp van dezebeelden. Eerst wordt ImageJ software (NIH) geopend.
- Dan is de stilstaande beelden die u gaat meten worden geopend in ImageJ.
- Door het selecteren van de "analyse" menu, "set metingen" wordt dan geopend en alle dozen zijn uitgeschakeld.
- Vervolgens wordt de rechte lijn gereedschap geselecteerd.
- De sneltoets "Ctrl +" wordt gebruikt om in te zoomen als dat nodig is en een lijn loodrecht op het schip pad naar vat diameter te meten.
- Tot slot wordt de scheepslengte verkregen door het selecteren van de "analyse" menu en vervolgens "maatregel" (Ctrl + M) om de scheepslengte te verkrijgen.
- Dit proces wordt herhaald ten minste driemaal en gemiddeld voor elke gemeten vaartuig gemeten in elk stilstaand beeld.
- Vaatdiameter op elk tijdstip wordt genormaliseerd naar de basislijn vaatdiameter zodat er vergelijkingen kunnen worden gemaakt met meerdere ratten. Om dit te doen, gebruikt u de formule huidige diameter / baseline diameter x 100% van de% basislijn diameter van elk vaartuig te berekenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stilstaande beelden uit de vastgelegde video blijkt dat de verandering in diameter cerebrale slagader na ET-1 injectie kan gemakkelijk worden begrepen met deze craniale venstertechniek (Figuur 2). Binnen enkele minuten van ET-1 injectie zal het schip gaan vernauwen. Uiteindelijk zal de schepen zal moeilijk zijn om te visualiseren en het hersenweefsel zal worden bleek. Na ongeveer 20 min de effecten van ET-1 zal afnemen en de vaten begint te verwijden, geleidelijk weer basislijn diameter na ongeveer 45 minuten. Naast de duidelijker vasoconstrictie die optreedt, de corticale oppervlak wordt bleker ET-1 na toediening. Het is mogelijk om de absolute verandering in vaatdiameter berekenen met een gekalibreerde microscoop reticule indien gewenst. Voor vergelijking van meerdere ratten berekenen we de relatieve verandering in vaatdiameter die optreedt tijdens een procedure. Deze metingen worden uitgevoerd met behulp ImageJ software (NIH). Dan een grafiek die de reltieve veranderingen in vaatdiameter tijd kan dan worden geconstrueerd (figuur 3).
Figuur 1. Diagram van de locatie van tijdelijke craniectomie. Dit diagram toont de het skelet van de rat schedel met anterior gericht naar links. De temporalis spier heeft zijn oorsprong langs de laterale schedel nok. Deze spier moet worden losgemaakt van deze rand en doorsneden om de squameuze gedeelte van het slaapbeen visualiseren. Een ongeveer 3-4 mm craniectomie worden uitgevoerd op deze locatie juist achter de baan en boven de basis van de zygomatic proces als het weerkaatsen van het slaapbeen. De grote pijl aangegeven de locatie aan de craniectomie uit te voeren. De 3 kleine pijlen geven de MCA en haar filialen. Alle slagadersOp deze plaats zal takken van de MCA en slagaders kan worden onderscheiden van aderen door zowel hun niet-kronkelige uiterlijk en gevoeligheid voor vasoactieve stoffen.
Figuur 2. Craniale venster voordat ET-1 injectie, na ET-1 injectie, en na reperfusie. Vanaf de linkerkant, is een representatief beeld van MCA takken als gezien door een craniale venster getoond. Slagaders kunnen worden geïdentificeerd door hun morfologie. De relatief rechte MCA komt het veld aan de linker en heeft een belangrijke tak punt in dit beeld. Andere schepen in deze foto's zijn cerebrale aderen die kunnen worden geïdentificeerd door hun diepere toon en kronkelige uiterlijk. Tijdens occlusie slagaders zal snel samentrekken en het weefsel zal worden bleek. Langzaam zal de slagader uitzetten en terug te keren naar de basislijn diameter.
Figuur 3. Representatieve vaatdiameter tijd voor een rat. Percent basislijn diameter kan worden berekend over de tijd met de eenvoudige formule huidige diameter / baseline diameter x 100%. Dit kan gedaan worden met elke vasoactieve stof.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kortom, dit craniale venster preparaat techniek is zeer veelzijdig en kan worden aangepast aan de behoeften van vele experimenten met kleine aanpassingen aan 4, 5. Zo hebben we met succes gevolgd cerebrale bloedstroom in specifieke branches MCA met laser doppler flowmetrie direct richten op een cerebrale slagader gevisualiseerd door een craniaal venster (Mecca AP 2009 en 2011). Bovendien kan een soortgelijke bereiding met de dura ingesneden worden met topische toediening van vasoactieve verbindingen maken in vivo een vasculaire reactiviteit bad 3. Verschillende factoren moet rekening worden gehouden bij het bereiden van een craniaal venster om het feit te verlagen voor deze techniek. Veel van deze factoren zijn gerelateerd aan het verkrijgen van goede visualisatie van cerebrale arteriën. In de eerste plaats moet erop worden gelet bij het maken van de craniectomie, zodat de duur of de bloedvaten bovenop het niet worden verstoord met de boor. Dit wordt het beste bereiktdoor frequente wasbeurten met een steriele zoutoplossing om puin te ruimen en af te koelen van de schedel. Ten tweede moet het botfragment voorzichtig worden opgeheven bij het verwijderen. Als het fragment niet gemakkelijk weg te trekken, vervolgens de boor moet worden gebruikt om meer weggesneden bot. Tenslotte kunnen kleine hoeveelheden bloed of CSF gemakkelijk veranderen het uiterlijk van de craniale venster tijdens deze procedure. De uitgevoerde craniectomie geeft een opening in de schedel die groter is dan nodig voor visualisatie. Daarom is het gemakkelijk om verschillende absorberende sponzen plaatsen in het afhankelijke deel van de operatieplaats te voorkomen dat vloeistof ophoopt. Deze sponzen kan indien nodig worden vervangen als zorg wordt niet gebruikt om het venster verhinderen met chirurgische instrumenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de American Heart Association Greater Zuidoost Affiliate (09GRNT2060421), de American Medical Association, en van de Universiteit van Florida klinisch en translationeel Science Institute. Adam Mekka is een NIH / NINDS, NRSA predoctorale collega (F30 NS-060335). Robert Regenhardt ontvangen predoctorale beurs steun van de Universiteit van Florida Multidisciplinaire Training Program in Hypertensie (T32 HL-083810).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inhalation anesthesia system | VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA | 901806 | |
| Isoflurane anesthetic | Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL, USA | 1001936060 | |
| Small animal stereotaxic system | David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA | 900 | |
| Non-rupture ear bars, rat | David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA | 957 | |
| Rat gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA | 1929 | |
| BAT-12 microprobe thermometer | World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA | BAT-12 | |
| T/PUMP, Thermal blanket | Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA | T/PUMP, TP600 | |
| Metzenbaum Scissors | World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA | 501254 | |
| Iris forceps | World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA | 15915 | |
| Bulldog clamp retractors | World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA | 14119-G | |
| 10 μl syringe 26-gaugue | World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA | SGE010RNS | |
| Bovie, high temperature cautery kit | World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA | 500392 | |
| Rat tooth forceps 0.12 | Stotz | E1811 | |
| Micromotor drill | Stoelting, Wood Dale, IL, USA | 51449 | |
| 0.8 mm round drill bur | Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA | RS-6280C-1 | |
| STORZ Bonn suturing forceps | Bausch and Lomb, Inc., Rochester, NY, USA | ||
| Nylon Suture, size 3.0 | Oasis, Mettawa, IL, USA | MV-663 | |
| Cotton swabs | Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA | 22-029-488 | |
| Puralube eye ointment | Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA | NC0138063 | |
| Electric hair clippers | Oster, Providence, RI, USA | 78005-301 | |
| ET-1 diluted to 80 μM concentration in PBS | American Peptide, Sunnyvale, CA, USA | 88-1-10A | |
| Chlorhexidine, 2% | Agrilabs, St. Joseph, MO, USA | 1040, Rev. 6-06, NAC No.: 10580322 | |
| Surgical microscope | Seiler Instrument and Manufacturing, St. Louis, MO, USA | Evolution xR6 | |
| Sony Handycam | Sony, Minato, Tokyo, Japan | HDR-SR12 | |
| Fiber optic illuminator | TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA | FO1–150 | |
| VLC media Player | (Paris, France) | ||
| Image J software | U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA |
References
- Levasseur, J. E., Wei, E. P., Raper, A. J., Kontos, A. A., Patterson, J. L. Detailed description of a cranial window technique for acute and chronic experiments. Stroke. 6, 308-317 (1975).
- Baumbach, G. L., Dobrin, P. B., Hart, M. N., Heistad, D. D. Mechanics of cerebral arterioles in hypertensive rats. Circ. Res. 62, 56-64 (1988).
- Regrigny, O., et al. Effects of melatonin on rat pial arteriolar diameter in vivo. Br. J. Pharmacol. 127, 1666-1670 (1999).
- Mecca, A. P., O'Connor, T. E., Katovich, M. J., Sumners, C. Candesartan pretreatment is cerebroprotective in a rat model of endothelin-1-induced middle cerebral artery occlusion. Exp. Physiol. 94, 937-946 (2009).
- Mecca, A. P., et al. Cerebroprotection by angiotensin-(1-7) in endothelin-1-induced ischaemic stroke. Exp. Physiol. 96, 1084-1096 (2011).
