L'utilisation d'une fenêtre crânien à la Visualisez l'artère cérébrale moyenne pendant l'endothéline-1 induite par l'occlusion Artère cérébrale moyenne

Summary

Cet article décrit une méthode pour visualiser les artères cérébrales de rats à travers une fenêtre crânienne à l'aide craniectomie temporelle afin de voir les parties proximales de l'artère cérébrale moyenne (

Abstract

Création d'une fenêtre crânienne est une méthode qui permet la visualisation directe des structures sur la surface corticale du cerveau ^1-3. Cette technique peut être réalisée dans de nombreux endroits qui recouvrent le cerveau du rat, mais est plus facilement réalisée par la création d'une craniectomie sur les os facilement accessibles frontale ou pariétale. Le plus souvent, nous avons utilisé cette technique en combinaison avec le modèle de l'endothéline-1 occlusion de l'artère cérébrale d'accident vasculaire cérébral ischémique à quantifier les changements de milieu diamètre de l'artère cérébrale navire qui se produisent avec l'injection de l'endothéline-1 dans le parenchyme cérébral adjacent au proximale MCA ^{4, 5.} Afin de visualiser la partie proximale de la MCA au cours de l'endothéline -1 MCAO induite, nous utilisons une technique pour créer une fenêtre crânienne à travers l'os temporal sur la face latérale du crâne de rat (figure 1). Artères cérébrales peuvent être visualisés soit avec la dure-mère intacte ou avec la mère et incisé retrala Direction exécutive. Le plus souvent, nous laissons intacte la durée pendant la visualisation depuis l'endothéline-1 induite par MCAO implique la livraison du peptide vasoconstricteur dans le parenchyme cérébral. Cela évite la nécessité d'inciser la dure-mère directement sur les vaisseaux visualisés pour l'administration de médicaments. Ce protocole décrit comment créer une fenêtre crânienne de visualiser les artères cérébrales d'une manière progressive, ainsi que la façon d'éviter de nombreux pièges potentiels liés à cette méthode.

Protocol

Ce protocole a été approuvé par le soin des animaux et du Comité institutionnel d'utilisation (IACUC) à l'Université de Floride et est en conformité avec le «Guide pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire" (huitième édition, National Academy of Sciences, 2011).

Matériels

1. Animaux: Huit semaines d'âge, de sexe masculin, Sprague Dawley (Charles River Farms, Wilmington, MA, USA) pesant 250-300 g au moment de la chirurgie.
2. Anesthésie
   1. Système d'anesthésie par inhalation (VetEquip Inc, Pleasanton, CA, USA)
   2. L'isoflurane anesthésie (Pharmacie Baxter, Deerfield, IL, USA)
3. Stéréotaxique système (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA)
   1. Petit système stéréotaxique animaux
   2. Non-rupture des barres d'oreilles pour les rats
   3. Support de la tête anesthésie gazeuse pour les rats
4. Régulation de la température
   1. BAT-12 Thermomètre microsonde (WorldPrecision Instruments, Inc, Sarasota, Floride, Etats-Unis)
   2. T / PUMP, TP600 couverture thermique (Gaymar Industries, Inc, Orchard Park, État de New York, Etats-Unis)
5. Les instruments chirurgicaux
   1. Ciseaux Metzenbaum, pince à iris, les rétracteurs de serrage bulldog, une seringue de 10 ul avec 26 aiguille de la jauge biseauté, Bovie cautérisation kit (World Precision Instruments, Inc, Sarasota, Floride, Etats-Unis)
   2. Micromoteur forage (Stoelting, Wood Dale, IL, USA)
   3. 0,8 mm ronde foret fraise (Roboz Surgical Instrument Co., Inc, Gaithersburg, MD, USA)
   4. STORZ Bonn suture Pinces (Bausch and Lomb, Inc, Rochester, NY, USA)
6. Fournitures chirurgicales
   1. 3,0 nylon suture (Oasis, Mettawa, IL, USA)
   2. Des cotons-tiges, pommade ophtalmique Puralube (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA)
   3. Les points chirurgicaux et bandes (Medtronic Xomed, Inc, Jacksonville, FL, USA)
   4. Tondeuses à cheveux électriques (Oster, Providence, RI, USA)
   Produits chimiques
   1. L'endothéline-1 (American Peptide, Sunnyvale, CA, USA)
   2. Chlorhexidine à 2% (Agrilabs, St. Joseph, MO, USA)
7. Équipements de visualisation
   1. Microscope chirurgical (Seiler Instrument et fabrication; St. Louis, MO, USA)
   2. Sony Handycam HDR-SR12 (Sony, Minato, Tokyo, Japon)
   3. Fibre optique d'éclairage (Techniquip Corp, Livermore, CA, USA)
8. Mesure de diamètre du vaisseau
   1. VLC media player (Paris, France)
   2. Image J logiciels (ImageJ 1.42q logiciel, US National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA)

1. Pré-chirurgicaux étapes

1. Avant la chirurgie, les rats sont logés sous un 12:12 lumière / obscurité cycle avec libre accès à l'eau et rongeur.
2. L'anesthésie est induite avec 4% d'isoflurane dans 100% d'O ₂ en mélange de gaz d'une chambre d'induction.
3. Le corbeau n de la tête est rasée avec une tondeuse à cheveux électriques.
4. Le rat est placé dans une position couchée sur un coussin absorbant allongé sur une surface de commande à régulation de température (couverture thermique) et la tête est placée dans l'appareil de stéréotaxie en commençant par le placement de la face d'un masque à gaz anesthésique.
5. Ensuite, les barres d'oreilles sont insérés et serrés.
6. Au cours de la procédure d'anesthésie est maintenue avec 2% d'isoflurane dans 100% d'O mélange de gaz _2.
7. Pommade ophtalmique lubrifiante est appliquée aux deux yeux et les paupières sont fermées pour empêcher le dessèchement des yeux pendant l'intervention chirurgicale.
8. Une sonde de température rectale est insérée pour maintenir une température constante pour animaux noyau de 37 ± 0,5 ° C.
9. A la tête du rat anesthésié maintenu fermement dans l'appareil stéréotaxique la zone chirurgicale est nettoyée avec une alternance de chlorhexidine et de sérum physiologique à trois reprises.

2. Préparation fenêtre pré-crânienne

ontenu "> Avant de créer une fenêtre crânienne, le rat doit être préparé pour toutes les expériences de l'implantation d'autre matériel nécessaire et doit recevoir toutes les procédures nécessaires chirurgicales. Par ce protocole, nous avons déjà implanté une canule guide pour l'endothéline-1 (ET- 1) induite par MCAO comme indiqué dans une publication intitulée "L'endothéline-1 induite Moyen Modèle occlusion de l'artère cérébrale pour AVC ischémique avec guidage laser Doppler chez le rat."

3. Création de la fenêtre crânienne

Après mise en place d'une canule de guidage ou de l'équipement nécessaire pour l'expérimentation, une fenêtre crânienne est créé pour visualiser directement portions proximale de l'artère cérébrale moyenne au cours d'une procédure d'accident vasculaire cérébral.

1. Tout d'abord, les ciseaux sont utilisés pour inciser la peau recouvrant le muscle temporal à partir médialement et latéralement de travail.
2. Le muscle temporal est coupé en deux en utilisant l'électrocoagulation et ensuite rétracté en utilisant 3,0 suture en nylon pour visua liser la partie squameuse de l'os temporal.
3. Un carré d'environ 3-4 mm est dessiné sur la partie squameuse de l'os temporal caudale de l'orbite et supérieur à la base de l'apophyse zygomatique, car il reflète hors de l'os temporal.
4. Un forage est utilisé pour réduire progressivement la pièce ébauchée de l'os sans l'os temporal. Des précautions doivent être prises pour éviter d'appliquer trop de pression sur la perceuse, car il est possible d'endommager la mère ou le cortex cérébral.
5. Rinçages fréquents avec du sérum physiologique stérile sont réalisés pour améliorer la visualisation du champ opératoire et éviter une surchauffe du crâne.
6. A partir d'un coin de meuble, le morceau d'os temoporal est soigneusement enlevé à l'aide de fines pinces à dents de rat tout en veillant à ne pas déchirer les vaisseaux associés à la dure-mère.
7. La durée est laissée intacte et les débris sont éliminés par rinçage utilisant une solution saline stérile.

4. Enregistrement de constriction Artère cérébrale

tente "> Pour montrer comment capturer des images en temps réel, un rat qui fait l'objet d'ET-1 induite par MCAO est utilisé pour ce protocole.

1. Avant l'application de composés vasoactifs, une vidéo de base doivent être enregistrées pendant au moins 1 min. Pour l'ET-1 induite par MCAO, l'enregistrement de base est effectué une fois que l'aiguille a été descendu dans le parenchyme cérébral, mais avant l'injection d'ET-1.
2. La pompe à seringue pour injection est démarrée et enregistrée pendant 1 heure ou jusqu'à ce que le point limite désiré. L'aiguille est laissée en place pendant l'enregistrement vidéo afin d'éviter des perturbations sur le plan focal.
3. Le rat doit être profondément anesthésié et euthanasiés selon un protocole approuvé à la suite de cette procédure.

5. Analyse d'images

Diamètre du vaisseau peut être déterminé pour chaque partie de la visualisé MCA. A titre d'exemple, nous allons utiliser une branche de la MCA pour mesurer le diamètre des vaisseaux au temps des points avant et après l'injection d'ET-1. Still images de la vidéo sont enregistrées à intervalles de 1 min en utilisant VLC media player (VideoLAN).

1. VLC player est installé et ouvert.
2. En choisissant des outils et des préférences puis, le réglage est changé sur "Tout" sous "Afficher les paramètres."
3. Le menu "vidéo" est détendu dans la barre latérale gauche et "modules de sortie" est ensuite détendu. «Filtres Scene" est sélectionné pour faire apparaître le menu vidéo scène filtre.
4. "Scène" est tapé dans la zone de préfixe du nom.
5. Un préfixe chemin de répertoire est défini. C'est là que des images fixes sont enregistrées.
6. Un rapport d'enregistrement est sélectionné sur la base de la vitesse désirée de capture d'image fixe. Si une vidéo a été capturée à 29 images par seconde, puis "1749" (29 images / sec x 60 s / min) doit être inscrit dans la case pour enregistrer une image fixe toutes les 1 minutes. Toutes les modifications sont alors enregistrées.
7. La vidéo souhaitée est alors ouvert dans le lecteur VLC pour enregistrer automatiquement des images fixes une fois toutes les 1 minutes.
8. Diamètre du vaisseau est ensuite mesurée à l'aide de cesimages. Tout d'abord, le logiciel ImageJ (NIH) est ouvert.
9. Ensuite, les images fixes que vous mesurerez sont ouverts dans ImageJ.
10. En sélectionnant l'option "analyser" menu ", définir des mesures" est alors ouverte et toutes les cases ne sont pas cochées.
11. Ensuite, l'outil de ligne droite est sélectionnée.
12. Le raccourci clavier "Ctrl +" est utilisé pour zoomer en fonction des besoins et une ligne est placée perpendiculairement à la trajectoire navire pour mesurer le diamètre des vaisseaux.
13. Enfin, la longueur du navire est obtenue en sélectionnant l'option "analyser" menu, puis "mesure" (ctrl + M) pour obtenir la longueur du navire.
14. Cette opération est répétée au moins trois fois et la moyenne pour chaque récipient de mesure mesurée dans chaque image fixe.
15. Diamètre du vaisseau à chaque point dans le temps est normalisé au diamètre du vaisseau de référence de sorte que les comparaisons peuvent être faites sur des rats multiples. Pour ce faire, utilisez la formule actuelle diamètre / base de diamètre x 100% pour calculer le diamètre de base% de chaque navire.

Representative Results

Les images fixes prises à partir de l'émission vidéo capturée que le changement de diamètre de l'artère cérébrale après injection d'ET-1 peut être facilement apprécié en utilisant cette technique fenêtre crânienne (Figure 2). Quelques minutes après l'injection d'ET-1, le navire commence à serrer. Finalement, les navires seront difficiles à visualiser et le tissu cérébral devient pâle. Après environ 20 minutes, les effets de l'ET-1 diminuera et les navires commencent à se dilater et remontera progressivement au diamètre initial après environ 45 min. En plus de la vasoconstriction plus évidente qui se produit, la surface corticale devient plus pâle après l'administration d'ET-1. Il est possible de calculer la variation absolue de diamètre du vaisseau avec un réticule calibré microscope si désiré. Pour une comparaison entre plusieurs rats, nous calculons la variation relative du diamètre des vaisseaux qui se produit au cours d'une procédure. Ces mesures sont effectuées à l'aide du logiciel ImageJ (NIH). Puis un graphique représentant la relchangements dans Ative diamètre du vaisseau au fil du temps peut alors être construit (figure 3).

Figure 1. Schéma de l'emplacement de craniectomie temporelle. Ce diagramme décrit l'anatomie du squelette du crâne de rat avec orientée avant à gauche. Le muscle temporal a son origine le long de la crête du crâne latéral. Ce muscle doit être détaché de cette crête et traversée afin de visualiser la partie squameuse de l'os temporal. Une craniectomie environ 3-4 mm peut être effectuée à cet endroit juste en arrière de l'orbite et supérieur à la base de l'apophyse zygomatique, car il reflète hors de l'os temporal. La grande flèche indique l'emplacement pour effectuer la craniectomie. Les 3 petites flèches indiquent le MCA et de ses branches. Tous les artèresà cet emplacement sera branches de la MCA et des artères peut être distingué de veines à la fois par leur aspect non tortueux et de la sensibilité à des composés vasoactifs.

Figure 2. Fenêtre crânienne avant l'injection d'ET-1, ET-1 après l'injection, et après la reperfusion. Partir de la gauche, une image représentative des branches MCA vue à travers une fenêtre crânienne est montré. Les artères peuvent être identifiés par leur morphologie. Le MCA relativement simple entre dans le champ en bas à gauche et a un point de ramification majeur dans cette image. D'autres navires dans ces photos sont des veines cérébrales qui peuvent être identifiés par leur son plus profond et l'aspect tortueux. Pendant artères occlusion va rapidement se contractent et le tissu devient pâle. Lentement, l'artère se dilate et revenir au diamètre de référence.

Figure 3. Diamètre du vaisseau Représentant au fil du temps pour un diamètre de base rat. Pourcentage unique peut être calculé au cours du temps en utilisant la formule simple, actuelle diamètre / base de diamètre x 100%. Cela peut être fait avec n'importe quel composé vasoactif.

Discussion

En résumé, cette technique de la fenêtre crânienne préparation est très polyvalent car il peut être modifié pour répondre aux besoins de nombreuses expériences avec des modifications mineures ^{4, 5.} Par exemple, nous avons réussi à surveiller le débit sanguin cérébral dans les branches MCA spécifiques en utilisant la vélocimétrie laser se concentrer directement sur une artère cérébrale visualisée à travers une fenêtre crânienne (la Mecque AP 2009 et 2011). En outre, une préparation similaire à la dure-mère incisée peut être utilisé avec une administration topique de composés vasoactifs pour créer un bain de la réactivité vasculaire in vivo ^3. Plusieurs facteurs doivent être pris en considération lors de la préparation d'une fenêtre crânienne afin de diminuer le taux d'échec de cette technique. Plusieurs de ces facteurs sont liés à l'obtention bonne visualisation des artères cérébrales. Tout d'abord, il faut prendre soin lors de la création de la craniectomie sorte que les vaisseaux-mère ou par le sang qu'il recouvrant ne soient pas perturbés par le foret. Le mieux est d'par des lavages fréquents avec une solution saline stérile pour enlever les débris et refroidir le crâne. Deuxièmement, le fragment d'os doit être levé doucement quand elle est enlevée. Si le fragment ne se séparent pas facilement, puis le foret doit être utilisé pour couper plus d'os. Enfin, de petites quantités de sang ou le LCR peut facilement modifier l'apparence de la fenêtre crânienne au cours de cette procédure. La craniectomie effectué fournit une ouverture dans le crâne qui est plus grande que nécessaire pour la visualisation. Par conséquent, il est facile de placer plusieurs éponges absorbantes dans la partie dépendante du site chirurgical pour empêcher le fluide de s'accumuler. Ces éponges peuvent être modifiés au besoin si les soins sont utilisées à ne pas obstruer la fenêtre avec des outils chirurgicaux.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inhalation anesthesia system	VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA	901806
Isoflurane anesthetic	Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL, USA	1001936060
Small animal stereotaxic system	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	900
Non-rupture ear bars, rat	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	957
Rat gas anesthesia head holder	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	1929
BAT-12 microprobe thermometer	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	BAT-12
T/PUMP, Thermal blanket	Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA	T/PUMP, TP600
Metzenbaum Scissors	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	501254
Iris forceps	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	15915
Bulldog clamp retractors	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	14119-G
10 μl syringe 26-gaugue	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	SGE010RNS
Bovie, high temperature cautery kit	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	500392
Rat tooth forceps 0.12	Stotz	E1811
Micromotor drill	Stoelting, Wood Dale, IL, USA	51449
0.8 mm round drill bur	Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA	RS-6280C-1
STORZ Bonn suturing forceps	Bausch and Lomb, Inc., Rochester, NY, USA
Nylon Suture, size 3.0	Oasis, Mettawa, IL, USA	MV-663
Cotton swabs	Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA	22-029-488
Puralube eye ointment	Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA	NC0138063
Electric hair clippers	Oster, Providence, RI, USA	78005-301
ET-1 diluted to 80 μM concentration in PBS	American Peptide, Sunnyvale, CA, USA	88-1-10A
Chlorhexidine, 2%	Agrilabs, St. Joseph, MO, USA	1040, Rev. 6-06, NAC No.: 10580322
Surgical microscope	Seiler Instrument and Manufacturing, St. Louis, MO, USA	Evolution xR6
Sony Handycam	Sony, Minato, Tokyo, Japan	HDR-SR12
Fiber optic illuminator	TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA	FO1–150
VLC media Player	(Paris, France)
Image J software	U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA