Utnytte en Kranio vindu for å visualisere Midt Cerebral arterie under Endotelin-1 Induced Middle Cerebral arterieokklusjon

Summary

Denne artikkelen beskriver en metode for å visualisere rotte cerebrale arterier gjennom et cranial vinduet ved hjelp temporal craniectomy for å vise proksimale deler av midten cerebral arterie (

Abstract

Opprettelse av et kraniale vinduet er en metode som gjør det mulig direkte visualisering av konstruksjoner på kortikale overflaten av hjernen ^1-3. Denne teknikken kan utføres i mange steder overliggende rotte cerebrum, men er mest lett utføres ved å skape et craniectomy over lett tilgjengelige frontal eller parietalbena. Oftest har vi brukt denne teknikk i kombinasjon med endothelin-1 middels cerebral arterieokklusjon modell av hjerneinfarkt å kvantifisere endringene i midtre cerebralarterie kardiameteren som oppstår med injeksjon av endotelin-1 inn i hjernen parenchyma tilstøtende til den proksimale MCA ^{4, 5.} For å visualisere den proksimale delen av MCA under endotelin -1 indusert MCAO, bruker vi en teknikk for å lage et kraniale vindu gjennom temporal bein på lateral aspekt av rotte skull (figur 1). Cerebrale arterier kan visualiseres enten med dura intakt eller med dura innrisset og retracted. Oftest, la vi dura intakt under visualisering siden endotelin-1 induserte MCAO innebærer levering av vasoconstricting peptid inn i hjernen parenchyma. Dette omgår behovet for å incise dura rett over visualiserte fartøy for levering av legemidler. Denne protokollen vil beskrive hvordan du oppretter en cranial vinduet for å visualisere cerebrale arterier i en trinnvis måte, samt hvordan du kan unngå mange av de potensielle fallgruvene knyttet til denne metoden.

Protocol

Denne protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité (IACUC) ved University of Florida, og er i samsvar med "Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr" (åttende utgave, National Academy of Sciences, 2011).

Materialer

1. Dyr: Åtte uker gamle, hann, Sprague Dawley rotter (Charles River Farms, Wilmington, MA, USA) som veier 250-300 g ved tidspunktet for kirurgi.
2. Anestesi
   1. Innånding anestesi system (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA)
   2. Isofluran bedøvelse (Baxter Farmasi, Deerfield, IL, USA)
3. Stereotaksiske system (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA)
   1. Små dyr stereotaksiske system
   2. Non-ruptur øret barer for rotter
   3. Gassanestesi hodet holder for rotter
4. Temperaturregulering
   1. BAT-12 mikrosonde termometer (WorldPrecision Instruments, Inc., Sarasota, Florida, USA)
   2. T / PUMP, TP600 varmeteppe (Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA)
5. Kirurgiske instrumenter
   1. Metzenbaum saks, iris tang, klypen retractors, 10 pl sprøyte med 26 gauge skrå nål, Bovie cautery kit (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, Florida, USA)
   2. Micromotor drill (Stoelting, Wood Dale, IL, USA)
   3. 0,8 mm rund drill bur (Roboz Surgical Instrument Co, Inc., Gaithersburg, MD, USA)
   4. STORZ Bonn suturing tang (Bausch & Lomb, Inc., Rochester, NY, USA)
6. Kirurgiske forsyninger
   1. 3,0 nylon sutur (Oasis, Mettawa, IL, USA)
   2. Bomullspinner, Puralube øyesalve (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA)
   3. Kirurgiske poeng og strimler (Medtronic Xomed, Inc., Jacksonville, Florida, USA)
   4. Elektriske hårklippere (Oster, Providence, RI, USA)
   Kjemikalier
   1. Endotelin-1 (American Peptide, Sunnyvale, CA, USA)
   2. Klorheksidin 2% (Agrilabs, St. Joseph, Missouri, USA)
7. Visualisering Utstyr
   1. Kirurgisk mikroskop (Seiler Instrument og produksjon, St. Louis, MO, USA)
   2. Sony Handycam HDR-SR12 (Sony, Minato, Tokyo, Japan)
   3. Fiberoptisk lys (TechniQuip Corp, Livermore, CA, USA)
8. Måling av fartøy diameter
   1. VLC media player (Paris, Frankrike)
   2. Bilde J-programvaren (ImageJ 1.42q programvare, US National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA)

1. Pre-kirurgiske Steps

1. Før operasjonen, er rotter plassert under en 12:12 lys / mørke syklus med fri tilgang til vann og gnager chow.
2. Anestesi indusert med 4% isofluran i 100% O ₂ gassblanding i induksjonsovn kammer.
3. Kråke n av hodet er barbert med elektriske hårklippere.
4. Rotten plasseres i en utsatt stilling på en absorberende pute som ligger på en temperatur-kontrollert betjeningsflate (termisk teppe) og hodet er plassert i stereotaktisk anordningen starter med plassering av gassen bedøvelse ansiktsmaske.
5. Deretter blir øret barer satt inn og strammet.
6. Under prosedyren anestesi opprettholdes med 2% isofluran i 100% O ₂ gassblanding.
7. Oftalmisk smøremiddel salve påføres på begge øyne, og øyelokkene er lukket for å hindre øye uttørring under den kirurgiske prosedyren.
8. En rektal temperaturprobe settes for å opprettholde en konstant dyr kjernetemperatur 37 ± 0,5 ° C.
9. Med hodet av den bedøvet rotte holdt fast i stereotaksiske enheten kirurgiske området er renset med vekslende klorheksidin og saltvann tre ganger.

2. Pre-cranial Window Forberedelse

ontent "> Før skape en cranial vindu skal rotten være forberedt på eventuelle eksperimenter ved implantasjon av annen nødvendig maskinvare og bør få nødvendig kirurgisk inngrep. For denne protokollen, har vi tidligere implantert en guide kanyle for endotelin-1 (ET- 1) indusert MCAO som vist i en følgesvenn publikasjon med tittelen "Endotelin-1 Induced Middle Cerebral arterieokklusjon Modell for iskemisk slag med laser Doppler Flowmetry Veiledning i Rat".

3. Etableringen av Cranial Window

Etter plassering av en guide kanyle eller utstyr som er nødvendig for eksperimentering, en cranial vinduet skapt til direkte visualisere proksimale deler av den midtre cerebralarterie i et slag prosedyre.

1. Først er saks brukes til å incise huden overliggende den temporalis muskelen begynner medialt og arbeider sidespor.
2. Temporalis muskelen er bisected ved hjelp electrocautery og deretter trukket med 3,0 nylon sutur til visua Lize squamous delen av tinningbenet.
3. En ca 3-4 mm kvadrat er trukket på squamous delen av tinningbenet kaudal til bane og overlegen til bunnen av zygomatic prosessen som det reflekteres fra tinningbenet.
4. Bor benyttes til gradvis skjære den skisserte stykke bein fri tinningbenet. Forsiktighet bør utvises for å unngå å bruke for mye press til boret, siden det er mulig å skade dura eller hjernebarken.
5. Hyppige skyllinger med sterilt saltvann er utført for å forbedre visualisering av operasjonsområdet og hindre overoppheting av skallen.
6. Starter på en løs hjørne, er stykket av temoporal bein forsiktig fjernet ved hjelp av fine rotte-toothed tang samtidig som at du ikke river noen skip knyttet til dura.
7. Dura er igjen intakt og rusk blir skylt bort med sterilt saltvann.

4. Opptak av Cerebral Artery Innsnevring

telt "> For å demonstrere hvordan du tar bilder i sanntid, en rotte som er under ET-1 induserte MCAO brukes til denne protokollen.

1. Før påføring av vasoaktive forbindelser bør en baseline video bli registrert for minst 1 min. For ET-1-fremkalt MCAO, er grunnlinjen innspilling gjort når nålen har blitt senket inn i hjernen parenchyma men før ET-1 injeksjon.
2. Sprøyten pumpen startes for injeksjon og registrert i 1 time eller inntil det ønskede endepunkt. Nålen er igjen på plass under videoopptak for å hindre forstyrrelser av fokalplanet.
3. Rotta skal være dypt bedøvet og avlives i henhold til godkjent protokoll følger denne prosedyren.

5. Bildeanalyse

Kardiameteren kan bestemmes for en hvilken som helst del av den visualisert MCA. Som et eksempel, vil vi bruke en gren av MCA å måle fartøyets diameter ved tidspunkter før og etter ET-1 injeksjon. Still rammer fra videoen er tatt opp ved 1 minutts intervaller med VLC media player (VideoLAN).

1. VLC player er installert og åpnet.
2. Ved å velge verktøy og deretter preferanser, er innstillingen endres til "Alle" under "Vis innstillinger".
3. Den "video menyen" er utvidet i venstre side bar og "utgangsmoduler" er utvidet. "Scene filtre" er valgt for å få opp scenen videofilter menyen.
4. "Scene" er skrevet inn i boksen for filnavnprefiks.
5. En katalog baneprefiks er definert. Det er der stillbilder lagres.
6. Et opptak ratio er valgt basert på ønsket hastighet på stillbilde-fangst. Hvis en video ble tatt til fange på 29 bilder per sekund, og deretter "1749" (29 bilder / sek x 60 sek / min) skal skrives inn i boksen for å lagre en fortsatt ramme inn hvert eneste ett min. Alle endringer blir da lagret.
7. Ønsket video blir deretter åpnet i VLC player for å automatisk lagre stillbilder gang hvert 1 min.
8. Kardiameteren blir så målt ved hjelp av dissebilder. Først, er ImageJ programvare (NIH) åpnet.
9. Da stillbilder som du vil måle åpnes i ImageJ.
10. Ved å velge "analysere"-menyen, "satt målinger" er åpnet og alle boksene er krysset av.
11. Deretter er den lineære verktøyet valgt.
12. Hurtigtasten "Ctrl +" brukes til å zoome inn etter behov og en linje er plassert vinkelrett på skipet banen for å måle fartøy diameter.
13. Endelig er skipet lengde oppnås ved å velge "analysere"-menyen og deretter "mål" (ctrl + M) for å få fartøyet lengde.
14. Denne prosessen gjentas minst tre ganger, og gjennomsnitt for hver målte fartøy målt i hvert stillbilde.
15. Kardiameteren ved hvert tidspunkt er normalisert til grunnlinjen kardiameteren slik at sammenligninger kan gjøres ved hjelp av flere rotter. For å gjøre dette, bruker du formelen nåværende diameter / baseline diameter x 100% for å beregne% baseline diameter på hvert fartøy.

Representative Results

Stillbilder tatt fra opptaket viser at endringen i hjernearterie diameter etter ET-1 injeksjon kan lett verdsatt ved hjelp av denne kraniale vinduet teknikken (figur 2). Innen minutter av ET-1-injeksjon, vil fartøyet begynne å constrict. Etterhvert skipene vil være vanskelig å visualisere og hjernevevet blir blek. Etter ca 20 min effekten av ET-1 vil avta og fartøyene vil begynne å utvide seg, gradvis tilbake til baseline diameter etter ca 45 min. I tillegg til de mer åpenbare vasokonstriksjon som oppstår, blir kortikale overflaten blekere etter ET-1 administrasjon. Det er mulig å beregne den absolutte endringen i kardiameteren med kalibrert mikroskop retikkelen hvis ønskelig. For sammenligning mellom flere rotter beregner vi den relative endringen i beholderveggen diameter som oppstår under en prosedyre. Disse målingene er utført ved hjelp ImageJ programvare (NIH). Så en graf som representerer relAtive endringer i kardiameteren over tid kan deretter konstruert (figur 3).

Figur 1. Diagram av plasseringen av temporale craniectomy. Dette diagrammet viser den skjelett anatomi av rotte skallen med fremre orientert til venstre. Temporalis muskelen har sin opprinnelse langs lateral skallen ryggen. Denne muskelen må være løsrevet fra denne ryggen og bisected for å visualisere squamous delen av timelige bein. En ca 3-4 mm craniectomy kan utføres på dette sted bare posteriort for bane og overlegen til bunnen av zygomatic prosessen som det reflekteres fra tinningbenet. Den store pilen angitt sted å utføre craniectomy. De tre små piler indikerer MCA og dets grener. Alle arterieri denne plasseringen vil være grener av MCA og arterier kan skilles fra venene ved både deres ikke-kroket utseende og følsomhet for vasoaktive forbindelser.

Figur 2. Cranial vinduet før ET-1 injeksjon etter ET-1 injeksjon, og etter transfusjonen. Fra venstre er et representativt bilde av MCA grener som sett gjennom et kraniale vinduet vist. Arteriene kan identifiseres ved morfologi deres. Den relativt rett MCA går inn i feltet nederst til venstre og har en stor gren poeng i dette bildet. Andre fartøy i disse bildene er cerebral årer som kan identifiseres ved deres dypere tone og kronglete utseende. Under okklusjon arterier vil raskt constrict og vevet blir blek. Sakte, vil arterien strekke og gå tilbake til baseline diameter.

Figur 3. Representant kardiameteren over tid for en enkelt rotte. Prosent baseline diameter kan beregnes over tid ved hjelp av den enkle formelen, gjeldende diameter / baseline diameter x 100%. Dette kan gjøres med en hvilken som helst vasoaktive forbindelse.

Discussion

Oppsummert er dette kraniale vinduet forberedelse teknikk svært allsidig ettersom det kan endres for å møte behovene til mange eksperimenter med mindre modifikasjoner ^{4, 5.} For eksempel har vi lykkes overvåket cerebral blodstrøm i konkrete MCA grener som bruker laser doppler flowmetry å fokusere direkte på en cerebral arterie visualisert gjennom en cranial vindu (Mekka AP 2009 og 2011). I tillegg kan et lignende preparat med dura radert brukes med topisk administrering av vasoaktive forbindelser å skape en in vivo vaskulær reaktivitet bath ^3. Flere faktorer bør tas i betraktning når du forbereder en cranial vindu for å redusere feilraten for denne teknikken. Mange av disse faktorene er knyttet til å skaffe god visualisering av cerebrale arterier. Først må det utvises når du oppretter craniectomy slik at dura eller blodårer overliggende det ikke blir forstyrret med borekronen. Dette gjøres bestved hyppig vask med sterilt saltvann for å fjerne rusk og kjøle skallen. Sekund, bør benet fragment løftes forsiktig når det fjernes. Hvis fragmentet ikke trekker bort lett, da borkronen må brukes til å kutte bort mer ben. Endelig kan små mengder av blod eller CSF lett endre utseendet av den kraniale vinduet under denne prosedyren. Den craniectomy utført gir en åpning i skallen som er større enn det som kreves for visualisering. Derfor er det enkelt å plassere flere absorberende svamper i den avhengige delen av operasjonsstedet for å hindre at væske akkumuleres. Disse svamper kan endres etter behov hvis omsorg er ikke pleide å hindre vinduet med kirurgisk verktøy.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inhalation anesthesia system	VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA	901806
Isoflurane anesthetic	Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL, USA	1001936060
Small animal stereotaxic system	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	900
Non-rupture ear bars, rat	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	957
Rat gas anesthesia head holder	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	1929
BAT-12 microprobe thermometer	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	BAT-12
T/PUMP, Thermal blanket	Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA	T/PUMP, TP600
Metzenbaum Scissors	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	501254
Iris forceps	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	15915
Bulldog clamp retractors	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	14119-G
10 μl syringe 26-gaugue	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	SGE010RNS
Bovie, high temperature cautery kit	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	500392
Rat tooth forceps 0.12	Stotz	E1811
Micromotor drill	Stoelting, Wood Dale, IL, USA	51449
0.8 mm round drill bur	Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA	RS-6280C-1
STORZ Bonn suturing forceps	Bausch and Lomb, Inc., Rochester, NY, USA
Nylon Suture, size 3.0	Oasis, Mettawa, IL, USA	MV-663
Cotton swabs	Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA	22-029-488
Puralube eye ointment	Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA	NC0138063
Electric hair clippers	Oster, Providence, RI, USA	78005-301
ET-1 diluted to 80 μM concentration in PBS	American Peptide, Sunnyvale, CA, USA	88-1-10A
Chlorhexidine, 2%	Agrilabs, St. Joseph, MO, USA	1040, Rev. 6-06, NAC No.: 10580322
Surgical microscope	Seiler Instrument and Manufacturing, St. Louis, MO, USA	Evolution xR6
Sony Handycam	Sony, Minato, Tokyo, Japan	HDR-SR12
Fiber optic illuminator	TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA	FO1–150
VLC media Player	(Paris, France)
Image J software	U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA