Summary
В данной статье описывается метод визуализации головного мозга крыс артерии через черепную окно с помощью временных удаление фрагментов костей черепа, чтобы просмотреть проксимальной части средней мозговой артерии (
Abstract
Создание черепно окно является метод, который позволяет прямой визуализации структур на поверхности коры головного мозга 1-3. Эта техника может быть выполнена во многих местах покрывающих головной мозг крыс, но наиболее легко осуществляется путем создания удаление фрагментов костей черепа более легко доступными лобной или теменной кости. Чаще всего, мы использовали этот метод в сочетании с эндотелина-1 средней мозговой артерии модели ишемического инсульта для количественной оценки изменений в средней мозговой артерии диаметром судна, которые происходят с инъекции эндотелина-1 в паренхиме головного мозга, прилегающих к проксимальной MCA 4, 5. Для того, чтобы визуализировать проксимальную часть СМА во время эндотелина -1 индуцированных MCAO, мы используем технику, чтобы создать черепно окно, через височную кость на боковой аспект крысы черепа (рис. 1). Церебральных артерий могут быть визуализированы либо с твердой мозговой оболочкой нетронутыми или с оболочкой надрезанные и RetraИДКТК. Чаще всего, мы оставляем нетронутыми оболочки при визуализации, так как эндотелина-1 индуцированной MCAO включает в себя доставку сосудосуживающего пептида в паренхиму мозга. Это позволяет обойти необходимость надрезать оболочку непосредственно над визуализировать сосуды для доставки лекарств. Этот протокол описывает, как создать черепно окно для визуализации мозговых артерий в поэтапно, а также как избежать многих подводных камней, относящихся к этому методу.
Protocol
Этот протокол был одобрен Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUC) из Университета Флориды и в соответствии с "Руководство по уходу и использованию лабораторных животных» (восьмое издание, Национальной академии наук, 2011).
Материалы
- Животные: восемь-недельных, мужчина, Sprague Dawley крыс (Charles River Farms, Уилмингтон, Массачусетс, США) массой 250-300 г во время операции.
- Анестезия
- Вдыхание анестезии системе (VetEquip Inc, Pleasanton, CA, USA)
- Isoflurane анестетика (Бакстер Фармацевтика, Deerfield, IL, USA)
- Стереотаксическая система (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA)
- Малые системы стереотаксической животных
- Номера для разрыва ухо баров для крыс
- Газ анестезии голове держатель для крыс
- Регулирование температуры
- BAT-12 микрозонда термометр (WorldPrecision Instruments, Inc, Сарасота, штат Флорида, США)
- Т / НАСОС, TP600 тепловой одеяло (Гаймар Industries, Inc Orchard Park, Нью-Йорк, США)
- Хирургические инструменты
- Metzenbaum ножницы, щипцы ирис, втягивающих бульдог зажим, 10 мкл шприц с 26 калибровочных скошенной иглой, Bovie прижигания комплект (World Precision Instruments, Inc, Сарасота, штат Флорида, США)
- Микромотор сверла (Stoelting, Вуд-Дейл, Иллинойс, США)
- 0,8 мм круглого сверла бора (Roboz хирургических инструментов Co, Inc, Gaithersburg, MD, USA)
- STORZ Бонне наложения швов Пинцеты (Bausch & Lomb и, Inc, Rochester, NY, США)
- Хирургические принадлежности
- 3,0 нейлона шва (Oasis, Mettawa, IL, USA)
- Ватные тампоны, Puralube глазная мазь (Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания, США)
- Хирургическое точки и полоски (Medtronic Xomed, Inc Джексонвилле, штат Флорида, США)
- Электрические машинки для стрижки волос (Oster, Провиденс, Род-Айленд, США)
- Эндотелина-1 (Американский пептид, Саннивейл, Калифорния, США)
- Хлоргексидин 2% (Agrilabs, Сент-Джозеф, штат Миссури, США)
- Визуализация оборудование
- Хирургический микроскоп (Seiler инструмента и производства; Сент-Луис, Миссури, США)
- Sony Handycam HDR-SR12 (Sony, Минато, Токио, Япония)
- Волоконно-оптический осветитель (TechniQuip Corp, Ливермор, Калифорния, США)
- Измерение диаметра сосудов
- VLC Media Player (Париж, Франция)
- Изображение J программного обеспечения (ImageJ 1.42q программного обеспечения, американского Национального Института Здоровья, Bethesda, штат Массачусетс, США)
1. Предоперационная шаги
- До операции у крыс размещены под 12:12 цикле свет / темнота со свободным доступом к воде и грызунов.
- Анестезия индуцируется с 4% изофлурана в 100% O 2 газовой смеси в индукционной камере.
- Ворона п голова бритая, с электрической машинки для стрижки волос.
- Крыса находится в положении лежа на впитывающей прокладки лежал на контролируемой температурой рабочей поверхности (тепловое одеяло) и руководитель находится в стереотаксической аппарата, начиная с размещением лицо противогаз анестезии.
- Далее, ухо баров вставлены и затянуты.
- Во время процедуры анестезии сохраняется с 2% изофлурана в 100% O 2 газовой смеси.
- Офтальмология мазь смазка наносится на оба глаза, а веки закрыты, чтобы предотвратить высыхание глаза во время хирургической процедуры.
- Ректального датчика температуры вводится для поддержания постоянной температуры ядра животного 37 ± 0,5 ° C.
- С главой наркозом крысы прочно удерживается в стереотаксической устройств хирургической области очищается с переменным солевым раствором хлоргексидина и в три раза.
2. Предварительная подготовка черепно Window
ontent "> До создания черепно окна, крысы должны быть готовы к любым экспериментам имплантации другие необходимые аппаратные и должны получать все необходимые хирургические процедуры. Для этого протокола, мы уже имплантировали канюли для эндотелина-1 (ЕТ- 1) индуцированных MCAO, как показано на собеседника издания под названием "эндотелина-1 Индуцированные средней мозговой артерии модели развития ишемического инсульта с лазерной доплеровской флоуметрии руководство в Крысы".3. Создание черепно Window
После размещения канюли руководство или оборудования, необходимого для экспериментов, черепно окно создается непосредственно визуализировать проксимальные части средней мозговой артерии во время удара процедуры.
- Во-первых, ножницы используются для надрезать кожу вышележащих височной мышцы, начиная медиально и параллельно работали.
- Височной мышцы делится пополам использованием электрокоагуляции, а затем отказался от использования 3,0 нейлона шов для видеотехника тивной плоскоклеточный часть височной кости.
- Примерно 3-4 мм квадратных обращается на плоскоклеточный часть височной кости каудально по отношению к орбите и выше основания скулового отростка, как это отражается от височной кости.
- Сверло используется для постепенно сократить намеченные кусок кости свободной от височной кости. Следует проявлять осторожность, чтобы избежать применения слишком большого давления на сверло, так как можно повредить оболочку или кору головного мозга.
- Частые полоскания стерильным физиологическим раствором проводится для улучшения визуализации операционного поля и предотвращения перегрева черепа.
- Начало в свободном углу, кусок temoporal кости тщательно удалены с помощью тонкой крысы-зубчатые щипцы, а убедившись, чтобы не порвать любого суда, связанные с твердой мозговой оболочкой.
- Длительность остается неизменным и мусор смывается использованием стерильного физиологического раствора.
4. Запись головного мозга Сужение артерий
палатка "> Чтобы продемонстрировать, как захват изображений в реальном времени, крыса, которая проходит ET-1 индуцированной MCAO для этого используется протокол.- До применения вазоактивных соединений, базовый видео должно быть записано как минимум на 1 мин. Для ET-1 индуцированной MCAO, исходные записи производится один раз игла была снижена в паренхиме головного мозга, но до ET-1 инъекцию.
- Шприц насос для инъекций и записанные в течение 1 часа или до желаемой конечной точки. Игла остается на месте во время записи видео в целях предотвращения нарушений фокальной плоскости.
- Крыса должна быть глубоко анестезии и эвтаназии в соответствии с утвержденным протоколом после этой процедуры.
5. Анализ изображений
Диаметр емкости может быть определена для любой части визуализировать MCA. В качестве примера, мы будем использовать одну ветвь MCA для измерения диаметра сосуда в моменты времени до и после ET-1 инъекцию. StiLL кадры из видео захватили в 1 мин интервалом использованием VLC Media Player (VideoLAN).
- VLC Player установлен и открыт.
- При выборе инструментов, а затем предпочтений, установка изменится на "все" в разделе "Настройки Show".
- "Видео меню" расширяется в левой боковой панели и "вывода", затем расширяется. "Сцена фильтры" выбран, чтобы вызвать сцену видео фильтр меню.
- "Сцена" введет в окно префикс имени файла.
- Префикс путь к каталогу определена. Это где кадры будут сохранены.
- Запись Соотношение выбирается в зависимости от желаемой скорости стоп-кадра захвата. Если видео было захвачено в 29 кадров в секунду, а затем "1749" (29 кадров / сек х 60 сек / мин) должны быть введены в поле, кроме одного стоп-кадра раз в 1 мин. Все изменения будут сохранены.
- Нужное видео, затем открыл в плеер VLC автоматически сохранять стоп-кадры раз в 1 мин.
- Диаметр емкости затем измеряется с помощью этихизображениями. Во-первых, ImageJ программного обеспечения (NIH) открыт.
- Тогда еще кадры, которые вы будете измерять открыты в ImageJ.
- При выборе "анализировать" меню ", установите измерений", затем открыли и все коробки снят.
- Далее, прямая линия инструмент выбран.
- Сочетание клавиш "Ctrl +" используется для увеличения по мере необходимости и линии, расположенные перпендикулярно к судну путь для измерения диаметра сосуда.
- Наконец, длина судна получается, выбрав «анализировать» меню, а затем "мера" (Ctrl + M) для получения длины судна.
- Этот процесс повторяется, по крайней мере, в три раза и составил в среднем для каждого измеренного судна измеряется в каждом кадре.
- Диаметр емкости в каждый момент времени нормированная на диаметр сосуда базовых, так что сравнение может быть сделано с использованием нескольких крыс. Для этого воспользуемся формулой текущего диаметра / базовый диаметр х 100% для расчета диаметра% базовой каждого судна.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Стоп-кадры взяты из отснятого видео, показывают, что изменения в коре головного диаметра артерии после ET-1 инъекцию можно легко оценить с помощью этой техники черепно окне (рис. 2). Через несколько минут ET-1 инъекцию, судно начнет сжиматься. В конце концов суда будет трудно визуализировать и ткани мозга станет бледным. Через 20 мин эффект ET-1 будет уменьшаться и сосуды начинают расширяться, постепенно возвращаются к исходным диаметром примерно через 45 мин. В дополнение к более очевидным, что происходит сужение сосудов, поверхности коры становится бледнее после ET-1 администрацию. Это можно вычислить абсолютное изменение диаметра сосуда с помощью калиброванного микроскопом сетки при желании. Для сравнения между несколькими крысами вычислить относительное изменение диаметра сосудов, что происходит во время процедуры. Эти измерения выполняются с помощью программного обеспечения ImageJ (NIH). Тогда график, представляющий отнative изменения диаметра сосудов с течением времени может быть построена (рис. 3).
Рисунок 1. Схема расположения временное удаление фрагментов костей черепа. Эта схема изображает скелетной анатомии крысы черепа с передним ориентированных на левую. Височной мышцы имеет свое происхождение вдоль боковой хребет черепа. Эта мышца должна быть отделена от этого хребта и пополам того, чтобы визуализировать плоскоклеточный часть височной кости. Примерно 3-4 мм удаление фрагментов костей черепа может быть выполнена на этом месте, всего в заднем к орбите и выше основания скулового отростка, как это отражается от височной кости. Большая стрелка указывает на местоположение для выполнения удаление фрагментов костей черепа. 3 маленькие стрелки указывают MCA и его филиалов. Все артерииВ этом месте будет отраслях MCA и артерий можно отличить от вен и их не-извилистый вид и чувствительность к вазоактивных соединений.
Рисунок 2. Черепно окна перед ET-1 инъекцию, после ET-1 инъекции, и после реперфузии. Начиная слева, представитель изображений филиалов MCA, если смотреть через черепную окно показано на рисунке. Артерии могут быть идентифицированы по их морфологии. Относительно прямой MCA выходит на поле в левом нижнем углу и имеет один главный пункт филиала в этом образе. Другие судов в этих картинах мозговой вены, которые могут быть идентифицированы по их глубокому тон и извилистый вид. Во время окклюзии артерий быстро сжимаются и ткани станут бледно. Медленно, артерии расширяются и вернуться к исходным диаметром.
Рисунок 3. Представитель диаметр сосуда с течением времени для одной крысы. Процент базового диаметра может быть рассчитана по времени, используя простую формулу, текущий диаметр / базовый диаметр х 100%. Это может быть сделано с любой вазоактивные соединения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Таким образом, эта методика подготовки черепно окно является очень гибким, так как он может быть изменен, чтобы удовлетворить потребности многих экспериментах с незначительными изменениями 4, 5. Например, мы успешно мониторинг мозгового кровотока в отдельных отраслях MCA помощью лазерной доплеровской флоуметрии, чтобы сосредоточиться непосредственно на мозговой артерии визуализируется через черепную окна (Мекка AP 2009 и 2011). Кроме того, аналогичный препарат с длительностью надрезанные может быть использован с местного введения вазоактивных соединений для создания в естественных условиях сосудистой реактивности ванны 3. Некоторые факторы должны быть приняты во внимание при подготовке черепно окна, чтобы уменьшить интенсивность отказов для этой техники. Многие из этих факторов, связанных с получением хорошей визуализации мозговых артерий. Во-первых, необходимо соблюдать осторожность при создании удаление фрагментов костей черепа, так что оболочки и кровеносные сосуды покрывающей его не будут нарушены со сверлом. Это лучше всего достигаетсячастых промывок стерильным физиологическим раствором для очистки мусора и охлаждения черепа. Во-вторых, костного фрагмента должны быть сняты мягко, когда он будет удален. Если фрагмент не оторваться легко, то сверло должно быть использовано, чтобы срезать более костей. Наконец, небольшое количество крови или спинномозговой жидкости может легко изменить внешний вид черепно окна во время этой процедуры. Удаление фрагментов костей черепа выполнена предоставляет отверстие в черепе, который больше, чем требуется для визуализации. Таким образом, можно легко разместить несколько абсорбирующие губки в зависимости часть хирургических сайт, чтобы предотвратить накопление жидкости. Эти губки может быть изменен по мере необходимости, если помощь используется, чтобы не перекрывать окна с хирургическими инструментами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами от Американской Ассоциации Сердца Большой Юго-Восточной Партнерская (09GRNT2060421), Американская медицинская ассоциация, и из университета Флориды клинических и трансляционных Science Institute. Адам Мекке NIH / NINDS, АЯРБ predoctoral человек (F30 NS-060335). Роберт Regenhardt получил predoctoral поддержки стипендий из Университета Флориды многопрофильная программа обучения в гипертония (T32 HL-083810).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inhalation anesthesia system | VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA | 901806 | |
| Isoflurane anesthetic | Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL, USA | 1001936060 | |
| Small animal stereotaxic system | David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA | 900 | |
| Non-rupture ear bars, rat | David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA | 957 | |
| Rat gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA | 1929 | |
| BAT-12 microprobe thermometer | World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA | BAT-12 | |
| T/PUMP, Thermal blanket | Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA | T/PUMP, TP600 | |
| Metzenbaum Scissors | World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA | 501254 | |
| Iris forceps | World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA | 15915 | |
| Bulldog clamp retractors | World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA | 14119-G | |
| 10 μl syringe 26-gaugue | World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA | SGE010RNS | |
| Bovie, high temperature cautery kit | World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA | 500392 | |
| Rat tooth forceps 0.12 | Stotz | E1811 | |
| Micromotor drill | Stoelting, Wood Dale, IL, USA | 51449 | |
| 0.8 mm round drill bur | Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA | RS-6280C-1 | |
| STORZ Bonn suturing forceps | Bausch and Lomb, Inc., Rochester, NY, USA | ||
| Nylon Suture, size 3.0 | Oasis, Mettawa, IL, USA | MV-663 | |
| Cotton swabs | Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA | 22-029-488 | |
| Puralube eye ointment | Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA | NC0138063 | |
| Electric hair clippers | Oster, Providence, RI, USA | 78005-301 | |
| ET-1 diluted to 80 μM concentration in PBS | American Peptide, Sunnyvale, CA, USA | 88-1-10A | |
| Chlorhexidine, 2% | Agrilabs, St. Joseph, MO, USA | 1040, Rev. 6-06, NAC No.: 10580322 | |
| Surgical microscope | Seiler Instrument and Manufacturing, St. Louis, MO, USA | Evolution xR6 | |
| Sony Handycam | Sony, Minato, Tokyo, Japan | HDR-SR12 | |
| Fiber optic illuminator | TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA | FO1–150 | |
| VLC media Player | (Paris, France) | ||
| Image J software | U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA |
References
- Levasseur, J. E., Wei, E. P., Raper, A. J., Kontos, A. A., Patterson, J. L. Detailed description of a cranial window technique for acute and chronic experiments. Stroke. 6, 308-317 (1975).
- Baumbach, G. L., Dobrin, P. B., Hart, M. N., Heistad, D. D. Mechanics of cerebral arterioles in hypertensive rats. Circ. Res. 62, 56-64 (1988).
- Regrigny, O., et al. Effects of melatonin on rat pial arteriolar diameter in vivo. Br. J. Pharmacol. 127, 1666-1670 (1999).
- Mecca, A. P., O'Connor, T. E., Katovich, M. J., Sumners, C. Candesartan pretreatment is cerebroprotective in a rat model of endothelin-1-induced middle cerebral artery occlusion. Exp. Physiol. 94, 937-946 (2009).
- Mecca, A. P., et al. Cerebroprotection by angiotensin-(1-7) in endothelin-1-induced ischaemic stroke. Exp. Physiol. 96, 1084-1096 (2011).
