Summary
Her beskriver vi en Schwann celle (SC) migrasjon analysen som sentre er i stand til å utvikle sammen strekker axons.
Abstract
Utviklingen av perifere nerver er en spennende prosess. Nevroner sender ut axons å innerverer konkrete mål, som hos mennesker er ofte mer enn 100 cm fra soma av nervecellen. Neuronal overlevelse under utvikling avhenger av mål-derived vekstfaktorer, men også på støtte fra Schwann celler (SC). For dette formål SC ensheath axoner fra regionen av neuronalt soma (eller overgangen fra sentrale til perifere nervesystemet) synapsen eller nevromuskulære veikryss. Schwann celler er derivater av neural crest og migrere som forløpere langs fremvoksende axoner inntil hele axon er dekket med sentre. Dette viser viktigheten av SC migrasjon for utvikling av det perifere nervesystemet og understreker nødvendigheten å undersøke denne prosessen. For å analysere SC utvikling, er et oppsett nødvendig som ved siden av sentre også inkluderer deres fysiologiske substrat for migrasjon, axon. På grunn av intrauterin utvikling
Protocol
1. Utarbeidelse av kollagen Gels
- Forbered en aksje medium, som inneholder 455 ul 10x MEM, 112 ul 7,5% 3 NaHCO, 50 ul glutamin og NaOH. Konsentrasjonen og mengden av NaOH avhenger rotte-halen kollagen forberedelse (se 1.2), det endelige volumet av bestanden mediumet er 1000 ul.
- Forbered rotte-hale kollagen ifølge Ebendal (1). Oppbevar Collagen løsning ved 4 ° C. En degradering av kollagen løsning kunne ikke observeres. Etter utarbeidelse av en ny gruppe, anslå NaOH konsentrasjon er nødvendig for bestanden medium (se 1.1). Bruk pH-indikator av mediet for titrering av mengden og konsentrasjonen av NaOH. 800 ul sure rotte-hale kollagen må slå en nyanse av rødt når det blandes med 210 ul av bestanden medium. Dersom konsentrasjonen av NaOH er for lav kollagen løsning vil gulne, grunnet pH-indikator i mediet. Legg kollagen til mediet og bland uten producing bobler. Utfør disse trinnene på isen. Polymerisasjonen skjer innen 2 timer etter den kollagen-løsningen og lager medium har vært blandet og den nye løsningen er inkubert ved 37 ° C. Teste dette før du starter et eksperiment. 1.3) Bland 800 ul av kollagen løsning med 210 ul på lager medium (se 1.2). Plassere 100 ul av denne løsningen i brønner av en 8 godt kammer lysbilde. Inkuber lysbildene ved 37 ° C, 5% CO 2 og fuktige betingelser i en cellekultur inkubator. Forbered kollagen gels under en cellekultur benk og sterile forhold. Kollagen gelatinizes innen 2 timer.
2. Disseksjon av Embryonale SCGs
- Høste embryo av tid drektige mus (E16-18) fra livmoren og holder dem i PBS inntil videre behov.
- Dissekere ett embryo fra amnion. Halshogge embryo Caudal av klavikulær nivå. Fest hodet på en silisium bunn tallerken med "insekt-nåler". Ventral side av hodet har til ansikt med deg end du må se submandibular regionen. Fiksering gjør det enklere forberedelser.
- Fjerne huden av kjevemusklene regionen venstre og høyre og med den sub-kutan bindevev.
- Fjern de submandibular spyttkjertler fra deres plassering for å fjerne utsikt over hyoid, de infrahyoidal muskler og sternocleidomastoideus muskelen.
- Fjern disse musklene nøye for å fjerne utsikt over strupehodet og luftrøret. Ta av luftrøret og strupehodet. Carotis er så synlig på begge sider på prevertebral muskler. SCG ligger i forgreningen av arteria carotis og har en oval form. Fjern forsiktig ganglia og plassere dem i PBS. Fjerne ganglia forsiktig fra Disseksjonsverktøyer hvis de stikker til dem. Det er fordelaktig å bruke tang samt en nålholderen montert med en "insekt nål" for SCG fjerning.
- Gang i PBS, lagre ganglia ved romtemperatur i PBS til du dissekert enough ganglier. Deretter rengjøre ganglia fra blodkar og bindevev. Utfør SCG disseksjon og rengjøring under et disseksjonsmikroskop plassert under en laminær benk.
- Til slutt plasseres eksplantert ganglia bort på gelatinert kollagen geler ved hjelp av sprøyte nåler montert på en sprøyte for lettere håndtering.
- Inkuber SCG eksplanter på gelatinert kollagen i en cellekultur inkubator ved 37 ° C, med 5% CO 2 og fuktige forhold.
3. Behandling av SCG explants
- Etter 1-2 timers inkubasjon, dekker SCG eksplantering inneholder kollagen med 100 ul Neurobasal cellekulturmedium inneholder B27 supplement, glutamin og antibiotika. Nå brønnene av kammeret lysbildene inneholde et volum på 200 ul (100 ul gel og 100 pl medium). Legge til en annen 200 pl av mediet, men som nå inneholder NGF (60 ng / ml) for å lette aksonal vekst. Følgelig det endelige NGF konsentrasjonen er 30 ng / ml.
- For å undersøke utbruddet av SC migrasjon, legge til flere faktorer direkte på dag in vitro 0 (DIV0). Oppløse faktorene i NGF inneholdende medium i dobbel konsentrasjon nødvendig (2).
- For å analysere effekten på sentre, som allerede var startet migrere langs aksoner, legge til flere faktorer ved Div3 til DIV4 (potensielle stopp av eksperimentet). For dette formål, fjern forsiktig 180 ul av løsningen, på Div3, og tilsett 200 pl nytt medium inneholdende NGF og ytterligere faktorer av interesse på dobbel konsentrasjon (2).
4. Time-lapse Imaging
Bruk en omvendt mikroskop for analyser. Forskjellige mål kan brukes, definere synsfelt og forstørrelse. Et viktig aspekt er imidlertid arbeidsavstanden av den brukte objektiv, som avbildning av SCG eksplanter utføres gjennom glass-slide og kollagengel. Innspillingen bildefrekvens på 1/10-30 minutter viste gode resultater (2). Imidlertid har dette aspektet kan justeres til den vitenskapelige spørsmålet. En normal CCD kamera kan brukes til bildeopptak. For tidsinnstilte avbildning en cellekultur inkubering kammeret må være festet til det stadiet av mikroskopet. Inkuber vevet under avbildning ved 37 ° C, med 5% CO 2 og fuktige forhold. Start inkubering systemet en time før starten av bildebehandling. Dette gjør at mikroskop deler (f.eks objektiv) inkludert kammeret lysbilde for å tilpasse seg temperaturen og hindrer temperatur induserte fonner. Definere bestemte områder av analyser (innenfor på eksplantering og mellom ulike eksplanter) med hjelp av mikroskopet programvare og en programvarestyrt motoriserte trinn (flerposisjons oppsett) for samtidige analyser av forskjellige anvendte betingelser til SCG eksplanter. For time-lapse bildebehandling wildtype vev samt vev fra transgene dyr kan brukesmarkerer sentre (s100b: GFP) (3). For imaging fluoroforer et fluorescerende lyskilde må implementeres i micropscope oppsettet. Bruk standard filtre.
5. Kvantifisering av SC migrasjon avstander
- Ved endepunktet (DIV4 for eksempel), fikse kollagen geler med 4% PFA i kammeret lysbildet i 3-4 timer. Fortløpende vaske kollagen gels 5 ganger i 10 minutter med PBS. Påfør standardprotokoller for immunocytokjemi (2). Hvis du er ny til utarbeidelse av SCGs, verifisere identiteten til ganglion som en sympatisk ganglion ved immunhistokjemi mot tyrosin hydroksylase (TH) en felles markør for catecholaminergic celler. Under immunhistokjemi (etter det primære antistoff), overføre eksplantasjon inneholder kollagen gels til 24 brønners plater, som har et større volum, noe som er gunstig for vaske gelene.
- Etter immunhistokjemi, forsiktig plasserer kollagen gels på glassplater. NøyeFjern gjenværende løsningen og la kollagen tørke / krympe til to dimensjoner. Dette gir enkel målinger av avstander (2). Etter dette, montere prøvene.
- Endelig måle migrasjon avstander ved hjelp av Fiji (NIH) programvare. Ingen spesielle plugins for å oppnå dette. Å tillate riktige målinger i mikrometer, sjekk riktig bildebehandling metadata og innstillingene under Fiji, bilde og skala. Bruk Fiji også for kvantifisering av celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aksonal vekst er tilrettelagt fra SCG explants ved behandling med NGF (4) (film ordningen S1 Figur 1 ordningen). Denne prosessen er lett synlig med noen invertert mikroskop og kan følges av time-lapse imaging (film S2). Hvis en forsker er nytt for dissekere SCG fra mus embryoer vi sterkt anbefale en validering av teknikken ved en enkel anti-tyrosin hydroksylase (TH) immunhistokjemi. TH er en felles markør for catecholaminergic nevroner (i dette tilfellet sympatiske nevroner) og gjør også etiketten axoner (figur 2B). Ved dette betyr aksonal lengder kan analyseres i dette systemet (2).
Viktigst, etter aksonal vekst har blitt indusert, kan en bølge av vandrende celler observeres (film S2 og S3). Migrere celler ble validert som S100 immuno positiv SC (2). I tillegg er en transgen mus linjen hvor GFP er under kontroll av den menneskelige s100B promotor fragment (3) kan brukes til å direkte analysere merket SC populasjonen (2) (film S4 og S5). Med hjelp av denne transgene linje disse eksperimentene kan også utføres med konfokal-eller lys ark mikroskopi (ikke utført her).
For analyser av SC under trekket, anbefaler vi et område på analyse med en lav aksonal tetthet (Figur 1 nærbilde Div3 og DIV4) og dermed en liten bestand av SC per område av analyse. Dette forenkler beste muligheter for å se celle morfologi og mobilnettet atferd (film S3).
SC migrasjon avstander kan måles ved slutten av et forsøk (f.eks DIV4). For dette formål DAPI kjernefysisk merking kan utføres på fast vev og avstander fra den ledende SC kjerner til grensen av eksplantasjon kan måles med hjelp av Fiji (NIH programvare) (Figur 2 ordningen og DAPI merking) (2).I tillegg er det også SC spredning eller SC død kan bli analysert. For dette formål for immunohistokjemi pHH3 eller for aktivert Caspase 3 kan utføres for eksempel identifisere mitotiske eller apoptotiske celler henholdsvis (2).
Figur 1 A:. Scheme viser aksonal vekst fra en eksplantert SCG over tid (DIV0-DIV4). B / C: lysfeltobjektiver bilder, registrert under time-lapse avbildning viser nærbilder av en region i en SCG eksplantering på Div3 (B) og DIV4 (C) (skala-bar = 100 mm).
Figur 2:. Scheme viser SC (blå) langs utvidede axoner (grå), vokst fra en eksplantert SCG (lys blå) Div3 og DIV4. Migrasjon avstander kan måles på DAPI kjernefysisk-merkede prøver ved å måle avstanden fra kjernen av de ledende SC til grensen av eksplantert SCG på flere steder (C). TH immunhistokjemi (DIV4) bør utføres dersom en forsker er nytt for SCG disseksjon. En positiv merking identifiserer klart eksplantert ganglion som en sympatisk ganglion (B). TH immunhistokjemi gjør også analyse av axoner vokst fra eksplanterte SCGs.
Film S1. Ordningen viser aksonal vekst fra en eksplantert SCG over flere dager in vitro. Klikk her for å se filmen .
Movie S2. Aksonal vekst og SC migrasjon fra en NGF behandlet SCG eksplantering. Imaging startet på DIV2. Innspilling bildefrekvens var 1/30 min. Scale-bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se filmen .
ntent "> Film S3. Nærbilde av en perifer område av en SCG eksplantering. Grunnet lav aksonal tetthet enkelt SC kan lett bli analysert. Imaging start var Div3. Recording frame rate var 1/10 min. Scale-bar = 100 mikrometer . Klikk her for å se filmen .Movie S4. Kombinasjonen av lysfelt og fluorescens muliggjør visualisering av S100 GFP positive sentre og aksoner. Innspilling bildefrekvens var 1/10 min. Scale-bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se filmen .
Movie S5. SC migrasjon på grensen av en SCG eksplantering. Her bare fluorescens kanalen vises muliggjør enklere tolkning av S100 GFP positive sentre. Innspilling bildefrekvens var 1/10 min. Skala-bar = 100 um./ 50016/50016movieS5.avi "target =" _blank "> Klikk her for å se filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utviklingen av det perifere nervesystemet er en spennende prosess. Når utviklingen er ferdig, blir axoner ensheathed av sentre langs hele lengden, som kan, i mennesker, ofte være over 100 cm. For dette formål riktig antall av de nødvendige sentre må etableres under utvikling og SCS må også flytte sammen strekker axons til periferien for å sikre fullstendig aksonal dekning. Dette gjelder for myelinerte men også for unmeylinated axoner. I begge tilfeller er alle axons er i kontakt med sentre og avhenger deres støtte. Å studere SC utvikling, assay som tar aksonal kupé hensyn og derfor etterligne in vivo utvikling til et bedre grad enn scratch assays (5), kan Boyden analyser (6) eller kammer assays gjøre. I enkelte analyser det aksonal kupé ble tatt hensyn allerede. For eksempel deler av sciatic nervene ble brukt som ruter for sentre for å migreresammen (7, 8), eller sentre ble ko-dyrket med nevroner langs som axoner de ble observert å migrere (9).
SCG eksplantering SC migrasjon analysen, men har enda flere fordeler. Det er spesielt interessant fordi sentre utvikler seg sine egne fysiologiske axoner, og disse er i seg selv vokser fortsatt. Videre teknikken er lett å lære og krever kun en bit av tekniske disseksjon ferdigheter og krever ikke et komplisert co-kultursystem av nevroner og SCS. En ganske lignende oppsett, men ikke bruker SCGs men heller DRGs, ble foreslått av Gumy og kolleger (10). Imidlertid, for å utnytte den fulle muligheter slik assay blir en invers mikroskop oppsett nødvendig at tid-lapse avbildning. Det er viktig å ha muligheten til å gjøre "multi-posisjons eksperimenter», for å være i stand til å analysere differensielt behandlet SCG eksplanter, beliggende i et kammer lysbilde, samtidigtid, slik at arbeidet med optimal kontroll side om side med de faktorer av interesse (2). For analyserer vi bare brukte konvensjonelle lys-og konvensjonelle fluorescens (for transgen s100b: GFP mus) mikroskopi. Teknikken kan imidlertid også lett brukes med konfokal-eller selv lette ark mikroskopi (ikke utført her). Time-lapse opptak kan brukes til å identifisere spesifikke cellulære egenskaper / atferd under trekket. Hittil bare wildtype og transgene mus har blitt brukt (2). Imidlertid bør transfeksjon av sentre og dermed endring av trasé med RNAi for eksempel være gjennomførbart. Med denne teknikken kan det også være mulig å analysere SC-axon samspill av normal og endret SC på samme eller nærliggende axon. Angående migrasjon avstander, SC spredning og SC overlevelse, kan fastsat analyser enkelt utføres ved immunhistokjemi med DAPI kjernefysiske merking og Fiji (NIH) programvare. Men til slutt enda livet reporter for spredning (11) og celledød (12, 13) kan brukes, og dermed muliggjør en direkte avlesning under avbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke Urmas Arumae for å dele en kollagen protokoll og Jutta Fey og Ursula Hinz for utmerket teknisk assistanse. I tillegg ønsker vi å takke Christian F. Ackermann, Ulrike Engel og Nikon Imaging Center ved University of Heidelberg og også Joachim Kirsch for vennlig hjelp for video shoting. Arbeidet ble delvis finansiert gjennom Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 592).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x MEM | Gibco | 21430 | |
| Sodium Bicarbonate (7.5%) | Gibco | 25080 | |
| Glutamine | Gibco | 25030 | |
| NaOH | Merck | 109137 | |
| NGF | Roche | 1058231 | R&D#556-NG-100 |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504 | |
| antibiotics | Gibco | 15640 | |
| d-PBS | Gibco | 14040 | |
| insect needles | FST | 26002-20 | |
| syringe needle | Braun | BD # 300013 | |
| 8 well chamber slide | Lab tek | 177402 |
References
- Ebendal, T. Use of collagen gels to bioassay nerve growth factor activity. Rush, R. A. IBRO Handh, John Wiley & Sons Ltd. (1989).
- Heermann, S., SchmÃcker, J., Hinz, U., Rickmann, M., Unterbarnscheidt, T., Schwab, M. H., Krieglstein, K. Neuregulin 1 type III/ErbB signaling is crucial for Schwann cell colonization of sympathetic axons. PloS One. 6 (12), e28692 (2011).
- Zuo, Y., Lubischer, J. L., Kang, H., Tian, L., Mikesh, M., Marks, A., Scofield, V. L. Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination. The Journal of Neuroscience. The Official Journal of the Society for Neuroscience. 24 (49), 10999-11009 (2004).
- Levi-Montalcini, R., Booker, B. EXCESSIVE GROWTH OF THE SYMPATHETIC GANGLIA EVOKED BY A PROTEIN ISOLATED FROM MOUSE SALIVARY GLANDS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 46 (3), 373-384 (1960).
- Meintanis, S., Thomaidou, D., Jessen, K. R., Mirsky, R., Matsas, R. The neuron-glia signal beta-neuregulin promotes Schwann cell motility via the MAPK pathway. Glia. 34 (1), 39-51 (2001).
- Yamauchi, J., Miyamoto, Y., Chan, J. R., Tanoue, A. ErbB2 directly activates the exchange factor Dock7 to promote Schwann cell migration. The Journal of cell biology. 181 (2), 351-365 (2008).
- Anton, E. S., Weskamp, G., Reichardt, L. F., Matthew, W. D. Nerve growth factor and its low-affinity receptor promote Schwann cell migration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2795-2799 (1994).
- Mahanthappa, N. K., Anton, E. S., Matthew, W. D. Glial growth factor 2, a soluble neuregulin, directly increases Schwann cell motility and indirectly promotes neurite outgrowth. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 16 (15), 4673-4683 (1996).
- Yamauchi, J., Chan, J. R., Shooter, E. M. Neurotrophins regulate Schwann cell migration by activating divergent signaling pathways dependent on Rho GTPases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (23), 8774-8779 (2004).
- Gumy, L. F., Bampton, E. T. W., Tolkovsky, A. M. Hyperglycaemia inhibits Schwann cell proliferation and migration and restricts regeneration of axons and Schwann cells from adult murine DRG. Molecular and Cellular Neurosciences. 37 (2), 298-311 (2008).
- Sakaue-Sawano, A., Kurokawa, H., Morimura, T., Hanyu, A., Hama, H., Osawa, H., Kashiwagi, S. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Park, D., Don, A. S., Massamiri, T., Karwa, A., Warner, B., MacDonald, J., Hemenway, C. Noninvasive imaging of cell death using an Hsp90 ligand. Journal of the American Chemical Society. 133 (9), 2832-2835 (2011).
- Shcherbo, D., Souslova, E. A., Goedhart, J., Chepurnykh, T. V., Gaintzeva, A., Shemiakina, I. I., Gadella, T. W. J., Lukyanov, S., Chudakov, D. M. Practical and reliable FRET/FLIM pair of fluorescent proteins. BMC Biotechnology. 9, 24 (2009).
