Summary
Hier beschreiben wir eine Schwann-Zellen (SC) Migration Assay, in dem SCs sind in der Lage zu entwickeln entlang erstreckt Axone.
Abstract
Die Entwicklung der peripheren Nerven ist eine faszinierende Prozess. Neuronen senden Axone um spezifische Ziele, die Menschen sind oft mehr als 100 cm vom soma des Neurons innervieren. Neuronale Überleben während der Entwicklung hängt Target-Wachstumsfaktoren, sondern auch auf dem Träger von Schwann-Zellen (SCs). Zu diesem Zweck sind SC umhüllen Axone vom Bereich des neuronalen Soma (oder der Übergang von der zentralen zu peripheren Nervensystem) auf der Synapse oder neuromuskulären Verbindung. Schwann-Zellen sind Derivate des Neuralleiste und migrieren als Vorprodukte entlang austretenden Axone bis die gesamte Axons mit SCs bedeckt ist. Dies zeigt die Bedeutung der SC Migration für die Entwicklung des peripheren Nervensystems und unterstreicht die Notwendigkeit, diesen Prozess zu untersuchen. Um SC Entwicklung zu analysieren, wird ein Setup benötigt, die neben den SCs auch ihrer physiologischen Substrat für Migration, das Axon. Aufgrund intrauterine Entwicklung
Protocol
Ein. Herstellung von Kollagen Gels
- Bereiten Sie eine Aktie Medium, enthaltend 455 ul 10x MEM, 112 ul 7,5% NaHCO 3, 50 ul Glutamin und NaOH. Die Konzentration und die Menge der NaOH hängt vom Rattenschwanz Kollagenzubereitung (siehe 1.2), das Endvolumen des Mediums, das Lager 1000 ul.
- Planen Rattenschwanz Kollagen nach Ebendal (1). Bewahren Sie die Collagen-Lösung bei 4 ° C. Ein Abbau der Kollagen-Lösung konnte nicht beobachtet werden. Nach der Vorbereitung einer neuen Charge, schätzen die NaOH-Konzentration für die Aktie Medium benötigt (siehe 1.1). Verwenden des pH-Indikators des Mediums zur Titration der Menge und Konzentration der NaOH. 800 ul sauren Rattenschwanz Kollagen muss ein Schatten von rot färben, wenn sie mit 210 ul der Aktie Medium vermischt. Wenn die Konzentration der NaOH zu niedrig ist die Kollagenlösung wird gelb aufgrund der pH-Indikator des Mediums. Fügen Sie den Kollagen zu mittel-und Mix ohne Proucing Blasen. Führen Sie diese Schritte auf dem Eis. Die Polymerisation innerhalb von 2 Stunden nach der Kollagenlösung und der Vorrat Mediums gemischt worden und die neue Lösung wird bei 37 ° C inkubiert Testen Sie dies, bevor Sie ein Experiment. 1,3) Mix 800 ul Kollagenlösung mit 210 ul auf Lager Medium (siehe 1.2). Platz 100 ul dieser Lösung in den Vertiefungen einer 8 gut Kammerobjektträgers. Inkubieren Sie die Objektträger bei 37 ° C, 5% CO 2 und feuchten Bedingungen in einem Zellkulturbrutschrank. Bereiten Sie die Kollagengelen unter einer Zellkultur Bank und sterilen Bedingungen. Das Kollagen verkleistert innerhalb von 2 Stunden.
2. Dissection embryonaler Standardkapitalbeihilfen
- Ernte Embryonen Zeit trächtigen Mäusen (E16-18) aus der Gebärmutter und halten sie in PBS bis auf weiteres benötigt.
- Sezieren ein Embryo aus dem Amnion. Enthaupten den Embryo caudal des clavicular Ebene. Befestigen Sie den Kopf auf einem Silizium unteren Schale mit "Insekten-Nadeln". Die Bauchseite des Kopfes zu Ihnen stehen eind Sie haben die Submandibulärregion sehen. Die Fixierung ermöglicht eine einfachere Vorbereitung.
- Entfernen Sie die Haut des Submandibulärregion links und rechts und mit ihm die subkutane Bindegewebe.
- Entfernen Sie die Glandula Speicheldrüse von ihrem Standort, um den Blick auf das Zungenbein, die infrahyoidal Muskeln und der M. sternocleidomastoideus löschen.
- Entfernen Sie diese Muskeln sorgfältig, um die Sicht auf den Kehlkopf und die Luftröhre zu löschen. Entfernen Sie die Luftröhre und des Kehlkopfes. Die Halsschlagadern werden dann auf beiden Seiten sichtbar auf den prävertebralen Muskeln. Die SCG ist in der Bifurkation der Halsschlagadern und hat eine ovale Form. Entfernen Sie vorsichtig die Ganglien und legen Sie sie in PBS. Entfernen Sie die Ganglien sanft von den Dissektion Werkzeuge, wenn sie zu ihnen kleben werden. Es ist vorteilhaft, Zangen sowie ein Nadelhalter mit einem "Insekt Nadel" für die SCG Entfernung montiert verwenden.
- Einmal in PBS, speichern die Ganglien bei Raumtemperatur in PBS, bis Sie seziert enough Ganglien. Danach reinigen Sie die Ganglien von Blutgefäßen und Bindegewebe. Durchführen der SCG Dissektion und Reinigung unter einem Präpariermikroskop unter einer laminaren Strömung Werkbank gelegt.
- Schließlich stellen die explantierten Ganglien auf die gelatinierte Kollagengelen mit Hilfe Spritzennadeln auf einer Spritze zur leichteren Handhabung montiert sind.
- Inkubieren Sie die SCG Explantate auf dem gelatinierte Kollagen in einer Zellkultur-Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO 2 und feuchten Bedingungen.
3. Behandlung von SCG Explantate
- Nach 1-2 h Inkubation abdecken SCG Explantats mit Kollagen mit 100 ul Neurobasal Zellkulturmedium mit B27 Ergänzung, Glutamin und Antibiotika. Nun werden die Vertiefungen der Kammer Folien enthalten ein Volumen von 200 ul (100 ul Gel und 100 ul Medium). + 200 ul des Mediums, aber jetzt mit NGF (60 ng / ml), die axonale Wachstum zu ermöglichen. Dementsprechend die endgültige NGF-Konzentration von 30 ng / ml.
- Um das Einsetzen von SC Migration zu untersuchen, zusätzliche Faktoren, die direkt am Tag in vitro 0 (DIV0). Man löst die Faktoren in der NGF enthaltenden Medium in doppelter Konzentration nötig (2).
- Um die Auswirkungen auf die SCs, die bereits begonnen Migration entlang Axone analysieren, zusätzliche Faktoren DIV3 bis DIV4 (potenzielle Stopp des Experiments). Zu diesem Zweck vorsichtig 180 ul der Lösung, bei DIV3, und 200 ul neue Medium mit NGF und die zusätzlichen Faktoren von Interesse bei der doppelten Konzentration (2).
4. Zeitraffer-Imaging
Verwenden Sie eine inverse Mikroskop für Analysen. Verschiedene Ziele verwendet werden, Definieren des Sichtfeldes und Vergrößerung. Ein wichtiger Aspekt ist jedoch der Arbeitsabstand des verwendeten Objektivs, wie die Abbildung der SCG Explantate durch den Glasobjektträger und dem Kollagen durchgeführt wirdGel. Die Bildrate der 1/10-30 Minuten zeigten gute Ergebnisse (2). Dies hat jedoch Aspekt der wissenschaftlichen Fragestellung angepasst werden. Eine normale CCD-Kamera kann zur Bildaufnahme verwendet werden. Für Zeitablauf Abbilden einer Zellkultur Inkubationskammer muss dem Tisch des Mikroskops angebracht werden. Inkubieren des Gewebes während der Bildgebung bei 37 ° C mit 5% CO 2 und feuchten Bedingungen. Starten Sie den Inkubationssystem 1 Stunde vor Beginn der Bildgebung. Dies ermöglicht die Mikroskop-Teile (zB Ziel) einschließlich der Kammer Folie, um die Temperatur einzustellen und verhindert temperaturbedingte Drifts. Definieren spezifischen Bereichen von Analysen (innerhalb von Explantat und zwischen verschiedenen Explantaten) mit Hilfe des Mikroskops Software und einer Software-gesteuerten motorisierten Tisch (Multipositionsventil setup) zur gleichzeitigen Analysen verschiedener angewendeten Bedingungen zu den SCG Explantaten. Für Zeitraffer-Aufnahmen Wildtyp Gewebe sowie Gewebe aus transgenen Tieren verwendet werden kannMarkieren des SCs (S100b: GFP) (3). Zum Abbilden Fluorophore eine fluoreszierende Lichtquelle muss im micropscope Setup implementiert werden. Verwenden Sie Standard-Filter.
5. Quantifizierung der SC Wanderdistanzen
- Am Endpunkt (DIV4 zum Beispiel), fixieren die Kollagengelen mit 4% PFA in der Kammer Rutsche für 3-4 Stunden. Nacheinander waschen Die Kollagengelen 5 mal für 10 min mit PBS. Anwenden Standardprotokolle für Immunzytochemie (2). Wenn Sie neu in der Vorbereitung der SCG sind, überprüfen die Identität des Ganglion als sympathischen Ganglion durch Immunhistochemie gegen Tyrosin-Hydroxylase (TH) eine gemeinsame Marker für katecholaminerge Zellen. Während Immunohistochemie (nach dem primären Antikörper), übertragen die Explantat enthaltenden Kollagengelen zu 24-Well-Platten, die ein größeres Volumen, was vorteilhaft für das Waschen der Gele ist zu haben.
- Nach Immunhistochemie, legen sorgfältig die Kollagengelen auf Glasträger. Vorsichtigentfernen Sie die restliche Lösung und lassen das Kollagen getrocknet / verkleinern auf zwei Dimensionen. Dies erlaubt eine einfache Messung von Entfernungen (2). Danach montieren Sie die Proben.
- Schließlich messen Migration Entfernungen mit Hilfe von Fidschi (NIH) Software. Keine besonderen Plugins sind zu diesem Zweck erforderlich ist. Um korrekte Messungen in um zu ermöglichen, überprüfen Sie die korrekte Abbildung von Metadaten und die Einstellungen unter den Fidschi-, Bild-und Skala. Verwenden Fiji auch für die Quantifizierung von Zellen.
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Representative Results
Axonale Wachstum von SCG Explantate nach der Behandlung mit NGF (4) (Film-Schema S1 Abbildung 1 Schema) erleichtert. Dieser Vorgang ist leicht sichtbar durch jedes inversen Mikroskop und kann durch Zeitraffer-Bildgebung (Film S2) folgen. Wenn ein Wissenschaftler ist neu Sezieren SCG von Maus-Embryonen empfehlen wir eine Validierung der Technik durch eine einfache Anti-Tyrosin-Hydroxylase (TH) Immunhistochemie. TH ist eine häufige Marker für katecholaminerge Neuronen (in diesem Fall sympathischen Neuronen), und unterstützt auch Etikett Axone (2B). Hierdurch axonalen Längen können in diesem System (2) ausgewertet werden.
Wichtig ist, dass nach dem axonalen Wachstum induziert wurde, kann eine Welle von wandernden Zellen beobachtet (Film S2 und S3) werden. Wandernden Zellen wurden als positiv S100 Immuno SC (2) validiert. Zusätzlich eine transgene Maus Zeile, in der GFP unter der Kontrolle des humanen s100b Promotorfragment (3) kann verwendet werden, um direkt zu analysieren das markierte SC Bevölkerung (2) (Film S4 und S5) werden. Mit Hilfe dieser transgenen Linie diese Versuche auch mit konfokalen-oder Lichttafelanordnung Mikroskopie (hier nicht durchgeführt) durchgeführt werden.
Für Analysen der SC während der Migration, empfehlen wir einen Bereich der Analyse mit einem niedrigen axonalen Dichte (Abbildung 1 Nahaufnahme DIV3 und DIV4) und damit einer kleinen Population von SC pro Fläche der Analyse. Dies erleichtert besten Möglichkeiten, Zellmorphologie und zelluläres Verhalten (Film S3) zu sehen.
SC Wanderdistanzen kann am Ende des Experiments (zB DIV4) gemessen werden. Hierzu DAPI nuklearen Kennzeichnung kann auf festen Gewebe und Abstände von der vorlaufenden SC Kerne werden zur Grenze des Explantats durchgeführt werden mit Hilfe von Fidschi (NIH-Software) (Abbildung 2-Schema und DAPI Etikettierung) (2) gemessen werden.Darüber hinaus auch SC Proliferation oder SC Tode analysiert werden können. Hierzu Immunhistochemie für pHH3 oder für aktivierte Caspase 3 kann beispielsweise durchgeführt werden, Identifizieren mitotischen oder apoptotische Zellen bzw. (2).
Abbildung 1 A:. Schematische Darstellung axonalen Wachstums von einer explantierten SCG im Laufe der Zeit (DIV0-DIV4). B / C: Hellfeld Bilder, während der Zeitraffer-Aufnahmen zeigen Nahaufnahmen von einem Bereich einer SCG Explantat bei DIV3 (B) und DIV4 (C) (scale-bar = 100 um) aufgezeichnet.
Abbildung 2 A:. Schematische Darstellung SC (blau) entlang erweiterten Axone (grau), aus einem explantierten SCG (hellblau) an DIV3 und DIV4 gewachsen. Migration Distanzen können auf DAPI Atom-markierten Proben gemessen werden durch Messen der Entfernung vom Kern des führenden SC an die Grenze des explantierten SCG an mehreren Orten (C). TH Immunhistochemie (DIV4) sollte durchgeführt werden, wenn ein Wissenschaftler ist neu SCG Dissektion werden. Eine positive Kennzeichnung identifiziert eindeutig den explantierten Ganglion als sympathischen Ganglion (B). TH Immunhistochemie ermöglicht auch Analysen von Axonen aus explantierten Standardkapitalbeihilfen gewachsen.
Film S1. Schema, das axonale Wachstum von einem explantierten SCG über mehrere Tage in vitro. Klicken Sie hier, um Film anzusehen .
Film S2. Axonal Wachstum und SC Migration von einem NGF behandelt SCG Explantat. Imaging begann DIV2. Aufnahme-Bildrate war 1/30 min. Scale-bar = 100 um. Klicken Sie hier, um Film anzusehen .
ntent "> Movie S3. Nahaufnahme eines peripheren Bereich eines SCG Explantat. Aufgrund der geringen axonalen Dichte einzigen SC problemlos analysiert werden. werden Imaging Start war DIV3. Aufnahme-Bildrate betrug 1/10 min. Scale-bar = 100 um . Klicken Sie hier, um Film anzusehen .Film S4. Die Kombination von Hellfeld und Fluoreszenz ermöglicht die Visualisierung der S100 GFP positive SCs und der Axone. Aufnahme-Bildrate betrug 1/10 min. Scale-bar = 100 um. Klicken Sie hier, um Film anzusehen .
Film S5. SC Migration an der Grenze eines SCG Explantat. Hier nur die Fluoreszenz-Kanal wird gezeigt was eine leichtere Interpretation der S100 GFP positive SCs. Aufnahme-Bildrate betrug 1/10 min. Scale-bar = 100 um./ 50016/50016movieS5.avi "target =" _blank "> Klicken Sie hier, um Film zu sehen.
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Discussion
Die Entwicklung des peripheren Nervensystems ist ein spannender Prozess. Wenn die Entwicklung beendet ist, werden Axone von SCs entlang der gesamten Länge, die beim Menschen können, oft mehr als 100 cm betragen umhüllt. Zu diesem Zweck die richtige Anzahl der benötigten SCs muss während der Entwicklung festgelegt und die SCs müssen auch entlang bewegen erstreckt Axone an den Rand, um die vollständige axonalen Abdeckung zu gewährleisten. Dies gilt für myelinisierten sondern auch für unmeylinated Axone. In beiden Fällen können alle Axone in Kontakt mit SCs und hängen von ihrer Unterstützung. Um SC Entwicklung zu studieren, Assays erforderlich sind, welche nehmen die axonale Abteil berücksichtigt und daher imitieren die in vivo zu einer besseren Entwicklung Ausmaß als kratz-Assays (5), kann Boyden-Assays (6) oder Kammer-Assays machen. In einigen Assays die axonale Kompartiment wurde berücksichtigt bereits. Zum Beispiel Teile der Ischiasnerv wurden als Routen für die SCs zur Migrationentlang (7, 8) oder SCs waren cokultiviert mit Neuronen, entlang derer sie beobachtet Axone migriert wurden (9).
Die SCG Explantat SC Migration Assay hat jedoch noch weitere Vorteile. Es ist besonders interessant, weil SCs entlang ihrer eigenen physiologischen Axone entwickeln, und diese sind selbst noch wächst. Darüber hinaus ist die Technik leicht zu erlernen und erfordert nur ein wenig von technischen Dissektion Fähigkeiten und erfordert keine komplexe Co-Kultur-System von Neuronen und SCs. Ein ganz ähnliches Setup, aber nicht mit Standardkapitalbeihilfen sondern DRGs, wurde von Gumy und Kollegen (10) vorgeschlagen. Um jedoch die vollen Möglichkeiten eines solchen Tests zu nutzen, wird eine inverse Mikroskop Setup benötigt ermöglicht Zeitraffer-Aufnahmen. Es ist wichtig, die Möglichkeit zu "Multi-Positions-Experimente" zu tun haben, um in der Lage sein differentiell behandelt SCG Explantaten in einer Kammer befindet Schieber analysieren, gleichzeitigZeit, so dass die Arbeit mit optimaler Steuerungen Seite an Seite mit den Faktoren von Interesse (2). Für Analysen haben wir nur herkömmliche Licht-und konventionellen Fluoreszenz (für transgene S100B: GFP-Mäuse) Mikroskopie. Die Technik kann jedoch auch leicht mit konfokalen-oder sogar Lichttafelanordnung Mikroskopie (hier nicht durchgeführt) verwendet werden. Zeitraffer-Aufnahmen können verwendet werden, um spezifische zelluläre Eigenschaften / Verhaltensweisen während der Migration zu identifizieren. Bisher ist nur Wildtyp und transgenen Mäusen verwendet wurden (2). Allerdings sollte Transfektion von SCs und damit Veränderung der Wege mit RNAi zum Beispiel möglich sein. Mit dieser Technik ist es sogar möglich sein, die SC-Axon Zusammenspiel von normalen und veränderten SC auf dem gleichen oder benachbarten Axon analysieren. Im Bereich der Migration Entfernungen, SC Proliferation und SC Überleben, können Endpunkt Analysen leicht durch Immunhistochemie mit DAPI Kernfärbung und Fidschi (NIH) Software durchgeführt werden. Doch schließlich sogar das Leben-reporter zur Proliferation (11) und Zelltod (12, 13) könnten verwendet werden, wodurch ein direktes Auslesen während der Bildgebung.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir wollen Urmas Arumae für die Freigabe eines Kollagen-Protokoll und Jutta Fey und Ursula Hinz für hervorragende technische Unterstützung danken. Darüber hinaus wollen wir Christian F. Ackermann, Ulrike Engel und das Nikon Imaging Center an der Universität Heidelberg und auch Joachim Kirsch für die freundliche für das Video shoting helfen, danken. Die Arbeit wurde teilweise durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 592) gefördert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x MEM | Gibco | 21430 | |
| Sodium Bicarbonate (7.5%) | Gibco | 25080 | |
| Glutamine | Gibco | 25030 | |
| NaOH | Merck | 109137 | |
| NGF | Roche | 1058231 | R&D#556-NG-100 |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504 | |
| antibiotics | Gibco | 15640 | |
| d-PBS | Gibco | 14040 | |
| insect needles | FST | 26002-20 | |
| syringe needle | Braun | BD # 300013 | |
| 8 well chamber slide | Lab tek | 177402 |
References
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