Summary
ここでは、SCが伸びる軸索に沿って開発することができますているシュワン細胞（SC）の遊走アッセイを記述します。
Abstract
末梢神経の開発は魅力的なプロセスです。ニューロンはヒトで100以上の30cm離れニューロンの細胞体からしばしば具体的な目標を、支配する軸索を送る。開発中の神経細胞の生存は、対象由来成長因子でなく、シュワン細胞（SCS）のサポートに依存します。この目的を達成するために神経細胞体の地域（または中枢から末梢神経系への移行）のSC ensheath軸索シナプスや神経筋接合部へ。シュワン細胞は神経堤の誘導体であり、全体の軸索は、SCSで覆われるまで、新興の軸索に沿って前駆体として移行されます。これは、末梢神経系の開発のためのSCの移行の重要性を示しており、このプロセスを調査する必要性を強調している。 SCの発展を分析するために、設定も移行のためのそれらの生理学的基質、軸索を含むSCの隣に必要とされる。子宮内の開発による
Protocol
1。コラーゲンゲルの調製
- 455μlの10倍、MEM、112μlの7.5パーセントのNaHCO 3、50μlのグルタミンおよびNaOHを含む、株式媒体を準備します。濃度とNaOHの量は、ラット尾コラーゲン製剤（1.2参照）、1,000μlのある株式媒体の最終容量に依存します。
- Ebendal（1）に記載のラット尾部コラーゲンを準備します。 4℃のコラーゲン溶液を保存コラーゲン溶液の劣化を観察することができなかった。新しいバッチを調製した後、株式培地（1.1参照）に必要なNaOH濃度を推定する。 NaOHの量と濃度の滴定のための媒体のpHインジケーターを使用しています。 800μlの酸性ラット尾コラーゲンは、株式の培地210μlの混合赤の影を有効にする必要があります。 NaOHの濃度が低すぎるとコラーゲン溶液は、培地のpH指示薬により、黄色に変わります。突くことなく、メディアとのミックスにコラーゲンを追加気泡をucing。氷の上でこれらの手順を実行します。重合は、コラーゲン溶液と株式媒体を混合した後、2時間以内に発生し、新しい溶液を37℃でインキュベートする。実験を開始する前にこれをテストします。 1.3）（1.2参照）在庫培地210μlでコラーゲン溶液800μlを混合します。 8ウェルチャンバースライドのウェル中にこの溶液100μlを置きます。 37でスライドをインキュベート℃、5％CO 2、および細胞培養インキュベーター中で湿気のある条件。細胞培養ベンチ、無菌条件下でコラーゲンゲルを準備します。コラーゲンは、2時間以内にgelatinizes。
2。胚SCGsの解剖
- 子宮からの時間妊娠中のマウスの収穫胚（E16-18）し、さらに、必要になるまでそれらをPBS中に入れておきましょう。
- 羊膜から1つの胚を解剖。鎖骨レベルの胚の尾の首を。 "昆虫針"を持つシリコンボトムディッシュ上でヘッドを固定します。頭の腹側はあなたに直面しているあなたは顎下領域を参照してくださいする必要があります。d。固定は簡単に準備できるようになります。
- 左と右の顎下領域およびそれとの皮下結合組織の皮膚を取り除きます。
- 舌、infrahyoidal筋肉や胸鎖乳突筋の上にビューをクリアするために、その場所から顎下唾液腺を削除します。
- 喉頭と気管の上にビューをクリアするために慎重にこれらの筋肉を削除します。気管および喉頭を削除します。頚動脈はその後椎前筋の両側に表示されます。 SCGは、頸動脈の分岐点に位置し、楕円形の形状を有している。慎重に神経を除去し、PBS中に置いてください。彼らはそれらに付着している場合は切開ツールから優しく神経を取り除きます。それは、鉗子と同様SCGを除去するための "昆虫針"が搭載された針ホルダーを使用することは有益である。
- あなたはenouを解剖するまで一度PBS中、PBS中で室温で神経を保存GH神経節。その後、血管や結合組織から神経をきれいにしてください。層流ベンチ下に置かれた解剖顕微鏡下SCG切開とクリーニングを行ってください。
- 最後に、扱いやすくするために注射器に搭載された注射針の助けを借りて、ゼラチン化したコラーゲンゲルに外植神経を配置します。
- 5％CO 2の湿潤な条件で、37℃で細胞培養インキュベーター中で糊化コラーゲン上SCG外植片をインキュベートする。
3。 SCG外植片の治療
- 1〜2時間のインキュベーション後、B27サプリメント、グルタミンおよび抗生物質を含む100μlNeurobasal細胞培養培地とSCG植含むコラーゲンをカバーしています。今チャンバースライドのウェルは200μl（100μlのゲルと100μlの培地）のボリュームが含まれています。しかし今では軸索の成長を促進するために、NGF（60 ng / mlで）を含む、媒体の別の200μlを添加する。従って最終NGF濃度は30 ng / mlである。
- SCの移行の発症を調査するために、in vitroで 0（DIV0） で一日に直接追加の要因を追加します。 （2）必要に応じて二重濃度のNGF含有する培地中での要因を溶かす。
- すでに軸索に沿って移行開始のSCへの影響を分析するために、DIV4（実験の潜在的な停止）までDIV3で付加的な要因を追加します。この目的を達成するために、慎重にDIV3では、溶液の180μlを削除し、NGFとダブル濃度（2）で興味のある付加的な要因を含む200μlの新しいメディアを追加します。
4。タイムラプスイメージング
分析用倒立顕微鏡を使用しています。種々の目的は、ビューと倍率のフィールドを定義し、使用することができます。 SCG植片のイメージングはスライドガラスとコラーゲンを介して行われるように1つの重要な側面は、しかし、使用目的の作動距離であるゲル。 1/10-30分の録画フレームレートは良好な結果（2）を示した。しかし、この側面は、科学的な疑問に調整する必要があります。通常のCCDカメラは、画像取得のために使用することができます。タイムラプスイメージングのための細胞培養インキュベーションチャンバーは、顕微鏡のステージに取り付けなければならない。 5％CO 2の湿潤な条件で、37℃で撮像中に組織をインキュベートする。撮影開始前培養システム一時間を開始します。これはチャンバースライドを含む顕微鏡部品（ 例えば、対物）の温度に調整することができ、温度ドリフト誘発を防ぐことができます。顕微鏡ソフトのヘルプやSCG外植片に異なる印加条件の同時分析のためのソフトウェア制御の電動ステージ（マルチポジションの設定）に分析の特定の領域を（外植片に内および異なる外植片の間）を定義します。使用することができるタイムラプスイメージング野生型組織だけでなく、トランスジェニック動物からの組織のために（3）：SCS（GFP S100B）をマーキング。イメージング蛍光団のための蛍光光源はmicropscopeセットアップで実装する必要があります。標準のフィルタを使用します。
5。 SCの移動距離の定量化
- エンドポイント（例えばDIV4）で、3〜4時間のためのチャンバースライドに4％PFAでコラーゲンゲルを固定します。連続してPBSで10分間コラーゲンゲルを5回洗浄する。免疫細胞化学（2）のための標準的なプロトコルを適用します。あなたはSCGsの準備を初めて使用する場合は、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）カテコールアミン細胞に共通のマーカーに対する免疫組織化学による交感神経節と節の身元を確認します。免疫組織化学（一次抗体後）の間に、ゲルを洗浄するために有益であるより大きな体積を有する24ウェルプレートにコラーゲンゲルを含む植を転送します。
- 免疫組織化学の後、スライドガラス上にコラーゲンゲルを慎重に置きます。慎重に残りの溶液を除去し、コラーゲンが乾燥/二次元に縮小することができます。これは、距離（2）の容易な測定を可能にする。この後、サンプルをマウントします。
- 最後に、フィジー（NIH）のソフトウェアの助けを借りて移動距離を測定します。は、特別なプラグインはこの目的を達成するために必要ではありません。 μm単位の正確な測定を可能にするには、正しい画像のメタデータとフィジーの下の設定、画像やスケールを確認してください。細胞の定量化のためにもフィジーを使用しています。
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Representative Results
軸索の成長は、NGF（4）（映画スキームS1は図1方式）を用いた治療により植片をSCGから促進される。このプロセスは、倒立顕微鏡で簡単に表示され、タイムラプスイメージング（ムービーS2）を続けることができます。科学者がマウス胚からSCGを解剖で新たに追加された場合、我々は強くシンプルな抗チロシンヒドロキシラーゼ（TH）免疫組織化学によって手法の妥当性検査をお勧めします。 THは、カテコールアミン作動性ニューロン（このケースでは交感神経ニューロン）のための一般的なマーカーであるとラベルの軸索（ 図2B）も行います。これにより軸索の長さは、このシステム（2）で解析することができます。
軸索成長が誘導された後に重要なのは、遊走細胞の波が（映画S2およびS3）を観察することができる。遊走細胞はS100の免疫陽性のサウスカロライナ（2）として検証されています。 GFPは人間S10の制御下にあるだけでなく、トランスジェニックマウス系統、0bのプロモーター断片（3）は直接標識SCの人口（2）（映画S4とS5）を分析するために使用できます。このトランスジェニックラインの助けを借りて、これらの実験はまた、共焦点または光シート顕微鏡（ここで行われていない）を用いて行うことができる。
移行時にSCの分析のために、私たちは低軸索密度（クローズアップDIV3及びDIV4 図1）、それによって分析の面積あたりのSCの人口が少ないと分析の領域をお勧めします。これは、細胞の形態や細胞挙動（ムービーS3）を参照するための最良の可能性を容易にします。
SCの移動距離は、実験（ 例えば DIV4）の終了時に測定することができます。この目的を達成するために核のDAPI標識が固定された組織で実行することができ、大手SCの核から外植片の境界線までの距離はフィジー（NIHソフトウェア）（ 図2スキームおよびDAPI標識化）（2）の助けを借りて測定することができます。加えて、SC増殖またはSC死を解析することができます。この目的を達成するためにpHH3用または活性化カスパーゼ3の免疫組織化学は、それぞれの有糸分裂やアポトーシス細胞を識別する（2）は、例えば実行することができます。
図1：Schemeは時間をかけて外植SCG（DIV0-DIV4）からの軸索の成長を示す。 B / C：明視野画像は、1 DIV3（B）のSCG植の領域とDIV4（C）は（スケールバー=100μm）のクローズアップを示すタイムラプスイメージング中に記録される。
図2：SchemeはDIV3及びDIV4で外植SCG（水色）から成長した拡張線維（灰色）に沿って、SC（青）を示す。移動距離は、DAPI核標識サンプル上で測定することができます複数の場所で外植SCGの境界（C）に至るSCの核からの距離を測定することによって。科学者が解剖をSCGで新たに追加された場合のTH免疫組織化学（DIV4）が行われるべきである。正のラベリングは、明らかに交感神経節（B）として外植神経節を識別します。 THの免疫組織化学はまた、外植SCGsから成長軸索の分析を可能にします。
映画S1 in vitro で数日間かけて植したSCGから軸索の成長を示すスキームは、ムービーを表示するにはここをクリック 。
S2は映画。外植片をSCG扱わNGFから軸索成長とSCの移行。イメージングは、DIV2で始まった。録画フレームレートは、1月30日分であった。スケールバー=100μmである。 ムービーを見るにはここをクリック 。
ntent "> ムービーS3が。SCG外植片の周辺部のクローズアップ。低い軸索密度単一SCを簡単に分析することができます。イメージングスタートDIV3だった。録画フレームレートが1月10日分であった。スケールバー=100μmであるため。 ムービーを見るにはここをクリック 。映画S4の明視野と蛍光との組み合わせは、S100 GFP陽性SCと軸索の可視化を可能にします。録画フレームレートは、1月10日分であった。スケールバー=100μmである。 ムービーを見るにはここをクリック 。
映画S5の SCG植の国境でのSCの移行。ここでの唯一の蛍光チャンネルはS100のGFP陽性SCの簡単な解釈を可能に示されています。録画フレームレートは、1月10日分であった。スケールバー=100μmである。/ 50016/50016movieS5.avi "ターゲット=" _blank ">ムービーを見るにはここをクリックしてください。
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Discussion
末梢神経系の発達は、エキサイティングなプロセスです。開発が完了すると、軸索は、ヒトでは、多くの場合100 cm以上であることができます全体の長さに沿って、SCSによってensheathedされています。この目的を達成するために必要なSCの正しい数はまた、完全な軸索のカバレッジを確保するため、周囲に伸びる軸索に沿って移動しなければならない開発およびSCの間に確立されてきました。これは、有髄のためだけでなく、unmeylinated軸索にも当てはまります。どちらの場合も、すべての軸索は、SCSと接触しており、彼らのサポートに依存しています。 SCの開発を研究するために、アッセイは考慮軸索コンパートメントを取るため、スクラッチアッセイ（5）、ボイデンアッセイ（6）またはチャンバーアッセイを行うことができますより良い程度に生体模倣開発に必要とされる。いくつかのアッセイでは軸索の区画は既に考慮された。例えば坐骨神経のセクションが移行するSCのためのルートとして使用した（7,8）に沿って、またはSCは彼らが移行することが観察された軸索に沿っニューロン（9）と共培養した。
SCG植SC遊走アッセイは、しかし、さらに多くの利点があります。 SCは、自分の生理的な軸索に沿って開発しているので、それは特に興味深いものです、そして、これらはまだ成長そのものです。さらに技術を学ぶのは簡単ですし、技術的解剖スキルのビットのみを必要とし、ニューロンおよびSCの複雑な共培養系を必要としません。かなり似たようなセットアップは、しかしSCGsむしろするDRGを使用していない、Gumyら（10）によって提案された。しかし、そのようなアッセイの完全な可能性を活用するために、逆顕微鏡のセットアップはタイムラプスイメージングを可能と必要とされる。それは同時に、チャンバースライドに位置差別的に扱わSCG植片を、分析できるようにするためには、 "マルチポジションの実験"を実行する可能性を有することが重要である時間、興味のある要因（2）と並んで最適なコントロール側での作業を可能にします。顕微鏡：分析するために我々は、従来の光と従来の蛍光（GFPトランスジェニックマウスS100B用）を使用。技術は、しかし、また、容易に共焦点あるいは光シート顕微鏡（ここでは実行されません）を使用することができます。タイムラプス録画は、移行時に特定の細胞特性/動作を識別するために使用できます。これまでのところ唯一の野生型及びトランスジェニックマウスは、（2）使用されている。しかし、例えば、SCとそれによってRNAiを持つ経路の変化のトランスフェクションが可能でなければなりません。このテクニックを使えば、たとえ同じまたは隣接軸索上で通常と変更されたSCのSC-軸索相互作用を解析することが可能である可能性があります。移動距離、サウスカロライナ州に増殖し、SCの生存に関しては、エンドポイント解析が容易にDAPIで核ラベリングとフィジー（NIH）のソフトウェアを使用して免疫組織化学により行うことができる。しかし、最終的にも生命レポ増殖（11）と細胞死（12、13）rterこれにより撮影時の直接読み出しを可能にする、使 用することができる。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
私たちは、優れた技術支援のためにコラーゲンプロトコルとユッタ·フェイとウルスラヒンツを共有するためのUrmas Arumaeに感謝したいと思います。さらに我々は親切にビデオshotingのヘルプのためにクリスチャン·F·アッカーマン、ウルリケ·エンゲルとハイデルベルク大学のニコンイメージングセンターともヨアヒムキルシュに感謝したいと思います。研究の一部はドイツ学術振興（SFB 592）を通じて資金を供給された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x MEM | Gibco | 21430 | |
| Sodium Bicarbonate (7.5%) | Gibco | 25080 | |
| Glutamine | Gibco | 25030 | |
| NaOH | Merck | 109137 | |
| NGF | Roche | 1058231 | R&D#556-NG-100 |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504 | |
| antibiotics | Gibco | 15640 | |
| d-PBS | Gibco | 14040 | |
| insect needles | FST | 26002-20 | |
| syringe needle | Braun | BD # 300013 | |
| 8 well chamber slide | Lab tek | 177402 |
References
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