Summary
여기 SCS는 확장 axons을 함께 개발 할 수 있습니다하는 Schwann 세포 (SC) 마이그레이션 분석을 설명합니다.
Abstract
주변 신경의 발달은 흥미로운 과정이다. 뉴런은 인간의 이상 100cm 거리에 신경의 소마에서 자주 구체적인 목표를 신경을 분포시키다하기 위해 axons을 보낼 수 있습니다. 개발하는 동안 Neuronal 생존이 목표 - 유래 성장 요인에뿐만 아니라 Schwann 세포 (SCS)의 지원에 따라 달라집니다. 시냅스 또는 신경 근육 접합부에 neuronal 소마 (또는 중앙에서 주변 신경계로의 전환)의 지역에서이를 SC의 ensheath의 axons 있습니다. Schwann 세포는 각각의 문장의 파생이며, 전체 축삭은 SCS으로 덮여 때까지 새로운 axons 함께 전구체로 마이그레이션됩니다. 이 주변 신경 시스템의 개발을위한 SC 마이그레이션의 중요성을 보여줍니다이 과정을 조사 할 필요성을 강조. SC 발전을 분석하기 위해, 설치는 이전에 자신의 생리 기판, 축삭을 포함하는 SCS 옆에있는 필요합니다. 자궁 개발로 인해 (뮤스 musculus) 마우스와 같은 태반 vertebrates에 적합하지 않을 수 있습니다. 이 우회하기 위해, 우리는 우수한 자궁 경부 신경절 (SCG) explant 기술을 적응. 신경 성장 인자 (NGF)와 치료 후 SCG의 explants은 신경절에서 주변에 axons 따라 이전 SC의 전구체 다음 axons을 확장합니다. 이 시스템의 장점은 SC는 SC 내생의 풀에서하고 동시에 성장하고 자신의 생리 axons 따라 마이그레이션이 파생된다는 것입니다. axons 따라 SC 개발이 SC 마이그레이션에 통찰력을 얻기 위해 더 가능성을 열어, 시간 경과 영상으로 분석 할 수 있기 때문에이 시스템은 특히 흥미로운입니다.
Protocol
1. 콜라겐 젤의 작성
- 455 μl 10X 가상, 112 μl 7.5 % NaHCO 3, 50 μl 글루타민과 NaOH를 포함 주식 매체를 준비합니다. 농도와 NaOH의 양이 쥐 꼬리 콜라겐 준비 (1.2 참조), 1,000 μl되는 주식 매체의 마지막 볼륨에 따라 달라집니다.
- Ebendal (1)에 따라 쥐 - 꼬리 콜라겐을 준비합니다. 4 ° C.에있는 콜라겐 솔루션을 저장 콜라겐 솔루션의 저하가 관찰 할 수 없습니다. 새로운 배치의 준비 후에 (1.1 참조) 주식 매체에 필요한 NaOH 농도를 추정. NaOH의 양 및 농도의 적정을위한 매체의 pH-표시기를 사용합니다. 800 μl 산성 쥐 - 꼬리 콜라겐은 재고 매체의 210 μl를 혼합 할 때 붉은 색의 그늘을 돌려해야합니다. NaOH의 농도가 너무 낮 으면 콜라겐 솔루션은 매체의 산도 표시기로 인해 노란색으로 바뀝니다. 찌르다없이 매체와 혼합에 콜라겐을 추가거품 ucing. 얼음에서 다음 단계를 수행합니다. 중합은 콜라겐 솔루션과 재고 매체가 혼합 된 후 2 시간 이내에 발생하고 새로운 솔루션은 37 ° C.에 incubated 수 있습니다 실험을 시작하기 전에이 작업을 테스트합니다. 1.3) 재고 매체의 210 μl (1.2 참조)과 콜라겐 솔루션 800 μl를 섞는다. 8 잘 챔버 슬라이드의 우물이 솔루션의 장소 100 μl. 37 슬라이드를 길러 ° C, 5 % CO 2 및 세포 문화 인큐베이터에서 습기 조건. 세포 배양 벤치 및 무균 조건 하에서 콜라겐 젤을 준비합니다. 콜라겐은 2 시간 이내에 gelatinizes.
2. 배아 SCGs의 해부
- 시간이 임신 자궁의 쥐 (E16-18) 및 추가 필요 할 때까지 PBS에 보관 수확의 배아.
- 양막에서 하나 배아를 해부. 쇄골의 수준의 배아 꼬리 목을 벨. "곤충 - 바늘 '로 실리콘 바닥 요리에 머리를 수정합니다. 머리의 복부 측면 여러분에게 직면하는당신은 턱밑 지역을 볼 수 있습니다 싶네요. 고정 쉽게 준비 할 수 있습니다.
- 왼쪽 및 오른쪽 턱밑 지역의 피부를 제거하고 하위 피부 결합 조직과 함께.
- 목 뿔뼈, infrahyoidal 근육과 목 빗근에보기를 삭제하려면 자신의 위치에서 턱밑 침샘을 제거합니다.
- 후두 및 기관에보기를 삭제하려면 신중하게 이러한 근육을 제거합니다. 기도와 후두를 제거합니다. 경동맥 동맥는 prevertebral 근육의 양쪽에 볼 수 있습니다. SCG는 경동맥 동맥의 분기에 위치하고 있으며, 타원형 모양을 갖추고 있습니다. 조심스럽게 신경절을 제거하고 PBS에 배치합니다. 그들이 지키는 경우 분해 도구 부드럽게 신경절을 제거합니다. 이 집게뿐만 아니라 SCG 제거 "곤충 바늘 '로 장착 바늘 홀더를 사용하여 유용합니다.
- 당신이 enou를 해부 할 때까지 한 번에 PBS에 PBS에 실온에서 신경절을 저장GH 신경절. 그런 다음 혈관과 결합 조직에서 신경절을 청소하십시오. 층류 벤치에서 위치 해부 현미경으로 SCG 해부 및 청소를 수행합니다.
- 마지막으로, 쉽게 처리 할 수있는 주사기에 장착 주사기 바늘의 도움으로 gelatinized 콜라겐 젤에 explanted 신경절를 놓습니다.
- 5 % CO 2와 습기 조건, 37 ° C에서 세포 배양 인큐베이터에서 gelatinized 콜라겐의 SCG explants를 품다.
3. SCG Explants의 치료
- 1-2 시간의 배양 후, B27 보충제, 글루타민과 항생제를 포함하는 100 μl Neurobasal 세포 배양 매체와 SCG explant가 포함 된 콜라겐을 다룹니다. 이제 챔버 슬라이드 우물 200 μl (100 μl 젤과 100 μl 매체)의 볼륨을 포함하고 있습니다. , 매체의 또 다른 200 μl를 추가하지만 지금은 axonal 성장을 촉진하기 NGF를 (60 NG / ML) 포함. 따라서 최종 NGF 농도는 30 NG / ML입니다.
- SC 이전의 발병을 조사하기 위해 체외 0 (DIV0)에 일에 직접 추가 요소를 추가 할 수 있습니다. 필요한 더블 농도 (2) NGF가 포함 된 미디어의 요소를 분해.
- 이미 axons 따라 이주 시작 SCS에 미치는 영향을 분석하기 위해, DIV4 (실험의 잠재적 정류장)까지 DIV3에서 추가 요소를 추가 할 수 있습니다. 이를 위해 신중하게 DIV3에서 솔루션 180 μl를 제거 200 μl 새로운 매체에 포함 된 NGF와 더블 농도 (2)에 대한 관심의 추가 요소를 추가 할 수 있습니다.
4. 시간 경과 영상
분석을위한 역 현미경을 사용하십시오. 다양한 목표를보기 및 확대의 필드를 정의 할 수 있습니다. SCG explants의 이미지는 유리 슬라이드와 콜라겐을 통해 수행되기 때문에 하나의 중요한 측면은 그러나, 사용 목적의 작동 거리입니다젤. 1/10-30 분 녹화 프레임 속도는 좋은 결과 (2) 보여 주었다. 그러나이 점은 과학 질문에 대한 조정되어야한다. 일반 CCD 카메라는 이미지 수집에 사용할 수 있습니다. 시간 경과 영상에 대한 세포 배양 배양 챔버는 현미경의 무대에 첨부되어야한다. 5 % CO 2와 습기 조건, 37 ° C에서 영상 동안 조직을 품다. 영상이 시작되기 전에 부화 시스템하다 시간을 시작합니다. 이 챔버 슬라이드를 포함하여 현미경 부품 (예 : 목표)의 온도에 적응 할 수 있으며, 온도 유도 앉를 방지 할 수 있습니다. 현미경 소프트웨어의 도움과 SCG explants에 다른 적용 조건의 동시 분석을위한 소프트웨어 제어 동력 단계 (multiposition 설치)에 분석의 특정 영역 (explant에 내 서로 다른 explants 사이) 정의합니다. 사용할 수있는 시간 경과 영상 wildtype 조직뿐만 아니라 유전자 변형 동물의 조직에 대한(3) : SCS (GFP s100b)을 표시. 영상 fluorophores를 들어 형광등 광원 micropscope 설정에서 구현해야합니다. 표준 필터를 사용합니다.
5. SC 마이그레이션 거리의 정량화
- 끝 지점 (예를 들어 DIV4)에, 3-4 시간의 챔버 슬라이드에 4% PFA과 콜라겐 젤을 해결할 수 있습니다. 연속 PBS로 10 분의 콜라겐 젤 다섯 번 씻는다. immunocytochemistry (2)에 대한 표준 프로토콜을 적용합니다. 당신은 SCGs의 준비에 새로하는 경우, 티로신 hydroxylase에 대한 immunohistochemistry에 의해 교감 신경절 (TH) catecholaminergic 세포를위한 공통의 마커로 신경절의 신원을 확인합니다. immunohistochemistry 동안 (주 항체 후), 젤을 세정에 도움이되는 더 큰 볼륨을 가지고 24 잘 접시에 explant 포함 콜라겐 젤을 전송할 수 있습니다.
- immunohistochemistry 후, 유리 슬라이드에 콜라겐 젤을주의 깊게 배치합니다. 주의하여나머지 솔루션을 제거하고 콜라겐이 건조 / 2 크기로 축소 보자. 이 거리를 (2) 쉽게 측정 할 수 있습니다. 이 후, 샘플을 탑재합니다.
- 마지막으로, 피지 (NIH) 소프트웨어의 도움으로 마이그레이션 거리를 측정합니다. 특별한 플러그인이 끝 부분에 필요하지 않습니다. μm의 정확한 측정을 허용하려면 올바른 이미지 메타 데이터 및 피지 아래의 설정, 이미지와 규모를 확인합니다. 세포의 정량화에도 피지를 사용하십시오.
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Representative Results
Axonal 성장은 NGF (4) (영화 체계 S1 그림 1 방식)과 치료에 explants를 SCG에서 용이하게되어 있습니다. 이 과정은 어떤 역 현미경을 이용하여 쉽게 볼 수 있으며 시간 경과 영상 (영화 S2)에 의해 다음 수 있습니다. 과학자 마우스 배아에서 SCG을 해부에 새로운이라면 강력 간단한 안티 - 티로신 hydroxylase (TH) immunohistochemistry에 의해 기술의 유효성 검사를하는 것이 좋습니다. TH는 라벨 axons (그림 2B) catecholaminergic 뉴런 (이 경우 교감 신경 뉴런)를위한 공통의 마커입니다하지 않습니다. 이 방법으로 axonal 길이는이 시스템 (2)에서 분석 할 수 있습니다.
axonal 성장이 유도 된 후 중요한, 마이그레이션 세포의 물결은 (영화 S2 및 S3) 관찰 할 수 있습니다. 마이그레이션 세포는 S100 immuno 긍정적 인 SC (2)로 확인되었습니다. 또한 유전자 변형 마우스 라인은,있는 GFP는 인간 S10의 통제하에 있습니다0b 발기인 조각 (3) 직접이라는 SC 인구 (2) (영화 S4 및 S5)을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 이 유전자 변형 라인의 도움으로이 실험은 공 촛점 또는 가벼운 시트 현미경 (여기 수행되지 않음)을 수행 할 수 있습니다.
마이그레이션하는 동안 SC의 분석을 위해, 우리는 낮은 axonal 밀도 (클로즈업 DIV3 및 DIV4 그림 1)과이를 분석의 지역 당 SC의 작은 인구 분석의 영역을 사용하는 것이 좋습니다. 이 세포 형태학 및 세포 행동을 (영화 S3)를 참조하는 것이 가장 가능성을 용이하게한다.
SC 이주 거리가 실험 (예 : DIV4)의 끝에서 측정 할 수 있습니다. 이를 위해 DAPI 핵 라벨은 피지 (NIH 소프트웨어) (그림 2 구조와 DAPI 라벨) (2)의 도움으로 측정 할 수 explant의 경계에 선도적 인 SC의 핵에서 고정 조직과 거리에서 수행 할 수 있습니다.뿐 아니라 SC 확산 또는 SC 죽음을 분석 할 수 있습니다. 이 최종 immunohistochemistry에 pHH3 또는 활성 Caspase 3는 각각 (2) mitotic 또는 apoptotic 세포를 식별, 예를 들어 수행 할 수 있습니다.
그림 1 A :. 계획은 시간이 지남에 따라 explanted SCG (DIV0-DIV4)에서 axonal 성장을 보여주고 있습니다. B / C : DIV3 (B) 및 DIV4 (C) (스케일 바 = 100 μm)에서 SCG explant 중 하나 지역의 가까이에 UPS를 보여주는 시간 경과 영상 동안 기록 brightfield 이미지.
그림 2 A :. 계획은 DIV3 및 DIV4에 explanted SCG (하늘색)에서 성장 확장 axons (회색)을 따라 SC (파란색)를 보여주고 있습니다. 마이그레이션 거리가 DAPI 핵 라벨 샘플을 측정 할 수 있습니다 여러 위치에서 explanted SCG의 경계 (C)로 이어지는 SC의 핵심에서 거리를 측정하여. 과학자 절개를 SCG에 새로하는 경우 TH immunohistochemistry (DIV4)을 수행해야합니다. 긍정적 인 라벨 분명 공감 신경절 (B)로 explanted 신경을 식별합니다. TH의 immunohistochemistry도 explanted SCGs에서 성장 axons의 분석이 가능합니다.
영화 S1. 체외에서 며칠 동안 explanted SCG에서 axonal 성장을 보여주는 방식. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
NGF의 영화 S2. Axonal 성장과 SC 마이그레이션은 explant를 SCG 취급. 영상은 DIV2에서 시작했다. 녹화 프레임 속도 1 / 30 분이었다. 스케일 바 = 100 μm. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
ntent "> 영화 S3는. SCG explant의 주변 지역들로 닫습니다. 낮은 axonal 밀도를 하나의 SC가 쉽게 분석 할 수 있습니다. 이미징 시작이 DIV3했다. 녹화 프레임 속도 1 / 10 분이었다. 스케일 바 = 100 μm로 인해 . 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .영화 S4는. brightfield과 형광의 조합 S100 GFP 긍정적 인 SCS 및 axons의 시각화 할 수 있습니다. 녹화 프레임 속도 1 / 10 분이었다. 스케일 바 = 100 μm. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
영화 S5. SCG explant의 경계에서 SC 마이그레이션. 여기 만 형광 채널 S100 GFP 긍정적 인 SCS을보다 쉽게 해석을 가능하게 표시됩니다. 녹화 프레임 속도 1 / 10 분이었다. 스케일 바 = 100 μm./ 50016/50016movieS5.avi "대상 ="_blank "> 영화를 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
주변 신경 시스템의 개발은 흥미로운 과정이다. 개발이 완료되면, axons는 인간에 자주 이상 100cm 할 수 있습니다 전체 길이를 따라 SCS에 의해 ensheathed 있습니다. 이를 위해 필요한 SCS의 정확한 숫자는 개발 중에 설립 할 수 있으며 SCS는 전체 axonal 범위를 확인하기 위해 주변에 확장 axons을 따라 이동해야합니다. 이 myelinated뿐만 아니라에 대한 unmeylinated axons에 대한 진정한 보유하고 있습니다. 두 경우 모두 모든 axons은 SCS와 접촉하고 그들의 지원에 따라 달라집니다. SC 개발을 공부하고, assays이 계정에 axonal 구획을하기 때문에 스크래치 assays보다 정도 (5)에 생체 개발을 모방하는 필요, Boyden의 assays (6) 또는 챔버 assays는 할 수 있습니다. 일부 assays에서 axonal 구획은 이미 고려되었습니다. 예를 들어 좌골 신경의 섹션은 마이그레이션 SCS에 대한 경로로 사용되었습니다함께 (7, 8), 또는 SCS들이 마이그레이션 관찰 된 axons 따라 뉴런 (9)와 공동 배양했다.
SCG explant SC 마이그레이션 분석 그러나, 더 많은 장점이 있습니다. SCS가 자신의 생리 axons 함께 개발하고 있기 때문에 특히 흥미 롭다,이는 여전히 성장 자체입니다. 또한이 기술은 배우기 쉽다 및 기술 분해 능력 만 조금 필요하며 뉴런과 SCS의 복잡한 공동 문화 시스템을 필요로하지 않습니다. 매우 유사한 설정은, 그러나 SCGs 아니라 DRGs를 사용하지, Gumy 및 동료 (10)에 의해 제안되었다. 그러나, 이러한 분석의 전체 가능성을 이용하기 위해 역 현미경 설정은 시간 경과 영상을 사용이 필요합니다. 이 같은에서 챔버 슬라이드에 위치하고 differentially 취급 SCG explants를 분석 할 수 있도록 위해 "다중 위치 실험"을 수행 할 수있는 가능성을 가지고하는 것이 중요합니다시간, 관심 (2)의 요소와 나란히 최적의 제어 측면과 함께 작업을 가능하게한다. 현미경 : 분석을 위해 우리는 기존의 빛과 기존의 형광을 (GFP 유전자 변형 마우스 s100b)을 사용했습니다. 기술은 그러나, 쉽게 공 촛점 또는 심지어 가벼운 시트 현미경 (여기 수행되지 않음)와 함께 사용할 수 있습니다. 시간 경과 녹음 마이그레이션하는 동안 특정 세포의 특성 / 행동을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 지금까지 만 wildtype와 유전자 변형 생쥐는 (2) 사용되었습니다. 그러나, SCS와 예를 들어, RNAi와 경로의이를 변경의 transfection이 가능해야합니다. 이 기법으로는 동일하거나 인접한 축삭에 정상과 변경된 SC의 SC-축삭의 상호 작용을 분석 할 수 있어야 수 있습니다. 마이그레이션 거리, SC 확산 및 SC의 생존에 관해서는, 엔드 포인트 분석을 쉽게 DAPI 핵 라벨링과 피지 (NIH) 소프트웨어와 immunohistochemistry에 의해 수행 할 수 있습니다. 그러나,도 결국은 생명 repo확산 (11)와 세포 사망 (12, 13)에 대한 rter는이를 이미징 동안 직접 기록을 가능하게 사용될 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리는 우수한 기술 지원을위한 콜라겐 프로토콜과 Jutta 페이와 우르술라 Hinz을 공유 Urmas의 Arumae 감사드립니다. 아울러 우리는 친절 비디오 shoting에 도움을 기독교 F. Ackermann, Ulrike 엥겔과 하이델베르크 (Heidelberg) 대학에서 니콘 이미징 센터와도 요아킴 Kirsch 감사드립니다. 작품은 부분적으로 독일 Forschungsgemeinschaft (SFB 592)를 통해 기금을 마련했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x MEM | Gibco | 21430 | |
| Sodium Bicarbonate (7.5%) | Gibco | 25080 | |
| Glutamine | Gibco | 25030 | |
| NaOH | Merck | 109137 | |
| NGF | Roche | 1058231 | R&D#556-NG-100 |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504 | |
| antibiotics | Gibco | 15640 | |
| d-PBS | Gibco | 14040 | |
| insect needles | FST | 26002-20 | |
| syringe needle | Braun | BD # 300013 | |
| 8 well chamber slide | Lab tek | 177402 |
References
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